郭柏宏肖向紅鞏珊珊張晶鈺柴龍會(huì)

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

低溫脅迫下東北林蛙GLUT1轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化

郭柏宏 肖向紅鞏珊珊 張晶鈺 柴龍會(huì)

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1；

東北林蛙(Ranadybowskii)主要分布在我國(guó)東北部，季節(jié)性的低溫環(huán)境使東北林蛙具有高效的抗凍策略，形成高濃度的葡萄糖保護(hù)劑是重要的抗凍機(jī)制之一。GLUT1是機(jī)體細(xì)胞中分布最廣泛葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。本實(shí)驗(yàn)采用高通量測(cè)序技術(shù)獲得東北林蛙GLUT1 mRNA片段，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析低溫脅迫下(-1℃)東北林蛙隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，其肝臟、骨骼肌、心臟、脂肪、皮膚組織中GLUT1轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝臟和心臟的GLUT1在低溫脅迫24 h達(dá)到峰值，分別為對(duì)照組的9.17倍和5倍；脂肪體和骨骼肌的GLUT1轉(zhuǎn)錄水平于48 h達(dá)到峰值，為對(duì)照組的7.2倍；GLUT1在皮膚中沒(méi)有顯著變化。結(jié)果表明，GLUT1參與東北林蛙低溫脅迫下的應(yīng)激反應(yīng)，并在形成細(xì)胞高濃度葡萄糖方面發(fā)揮著重要作用。

東北林蛙(Ranadybowskii)主要分布于我國(guó)東北部、朝鮮、日本及俄羅斯等地。由于此地處亞寒帶，冬季氣候寒冷干燥，年平均溫度達(dá)到0℃以下，作為兩棲類變溫動(dòng)物，東北林蛙越冬時(shí)要面臨嚴(yán)峻的低溫威脅和生存壓力，因此在環(huán)境溫度過(guò)低時(shí)會(huì)通過(guò)冬眠降低機(jī)體代謝水平，維持生命[1-2]。其中，體內(nèi)形成高濃度的葡萄糖作為抗凍保護(hù)劑是機(jī)體重要的抗凍保護(hù)機(jī)制之一，它在減少細(xì)胞水分流失，降低冰晶形成，防止細(xì)胞塌陷，穩(wěn)定細(xì)胞膜和膜內(nèi)大分子起到重要作用[3-6]。

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1(glucose transporter protein 1，GLUT1)，是哺乳動(dòng)物中轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖跨膜運(yùn)輸重要的載體蛋白，糖轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白家族(GLUTs)是促進(jìn)己糖跨膜運(yùn)輸?shù)囊幌盗械鞍?，GLUTs家族中共有14名成員GLUT(1-14)，每一個(gè)成員都分別對(duì)不同的己糖有特異性的親和能力、特異性的組織分布、亞細(xì)胞定位以及生理功能。GLUT1是一種膜蛋白，在哺乳動(dòng)物中基本結(jié)構(gòu)由 12個(gè)跨膜片段組成，可以順濃度差將細(xì)胞外的葡萄糖運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi)部[7]。GLUT1是目前已知分布最廣的GLUT家族的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，在各個(gè)組織器官都有不同程度的表達(dá)。在人體中主要表達(dá)于紅細(xì)胞，血腦屏障，表皮細(xì)胞等[8]。

目前GLUT1的研究主要是見(jiàn)于哺乳動(dòng)物和人的腫瘤及糖尿病方面[9]，對(duì)于兩棲類低溫環(huán)境下葡萄糖作為機(jī)體抗凍保護(hù)劑的相關(guān)機(jī)制研究還很少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)低溫脅迫下GLUT1基因表達(dá)水平分析為兩棲類抗凍保護(hù)劑的形成提供證據(jù)，同時(shí)也為GLUT1的功能性研究提供新的視角。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

東北林蛙，健康成年雄性36只，采集于黑龍江省鐵力林場(chǎng)，體重(22±2)g。其中實(shí)驗(yàn)組18只，對(duì)照組18只。飼養(yǎng)在通氣良好的容器中，容器中加入適量活性碳處理的水，以不沒(méi)過(guò)蛙身高度為準(zhǔn)。將蛙放置于4℃環(huán)境中適應(yīng)2周，同時(shí)設(shè)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。

1.2 低溫模型的建立

將在4℃的東北林蛙置于-1℃溫控冰箱馴養(yǎng)45 min后，開始計(jì)時(shí)低溫脅迫。分別于4 h、8 h、12 h、24 h、48 h和72 h組織樣本采集，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別隨機(jī)取樣3只。采用雙毀髓法迅速取其肝臟、心臟、骨骼肌、皮膚和脂肪體樣本，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總RNA的提取和cDNA的合成

將組織用去酶的剪刀剪碎，加入TRIzol?Reagent(ambion，USA)1 000mL，勻漿，具體步驟按照TRIzol?Reagent說(shuō)明書操作。總RNA濃度與完整性通過(guò)分光光度計(jì)和2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)?？俁NA-80℃保存?zhèn)溆?。cDNA的合成用ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(TOYOBO，Japan)反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成，具體操作以說(shuō)明書為準(zhǔn)，cDNA保存于-20℃。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.4.1 引物設(shè)計(jì)

東北林蛙GLUT1序列片段由高通量測(cè)序獲得(由華大基因測(cè)序分析)，東北林蛙GLUT1引物由Beacon Designer 7軟件完成(表1)。通過(guò)RT-PCR和標(biāo)準(zhǔn)曲線選擇適合的引物。按照2x Taq Master Mix(TIANGEN，Beijing)說(shuō)明書進(jìn)行PCR反應(yīng)，模版為反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)合成的cDNA。PCR條件：94℃ 2 min變性；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃30 s，共30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增；72℃ 5 min 延伸。得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將得到清晰的單一且片段大小正確的條帶進(jìn)行qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。qPCR儀器及分析選用CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad，Hercules，CA)。以反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)獲得的cDNA為模版，進(jìn)行梯度稀釋，按10倍稀釋成4個(gè)梯度。相關(guān)酶試劑采用2x SuperReal Premix Plus(TIANGEN，Beijing)熒光定量試劑盒，實(shí)驗(yàn)操作以說(shuō)明書為準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)條件采用兩步法，95℃ 15 min 變性；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，退火和延伸。在每次的延伸后進(jìn)行熒光檢測(cè)，將收集到的數(shù)據(jù)作為Cq值，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，保證E=85%～105%，R2>0.980。選取符合條件的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，具體步驟如熒光定量試劑盒說(shuō)明書所示，內(nèi)參基因選用GAPDH。其中每個(gè)qPCR反應(yīng)孔做3次重復(fù)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3次獨(dú)立樣本重復(fù)。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理及分析

將實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)通過(guò)Livak(2-ΔΔCq)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行處理。最終的數(shù)據(jù)分析通過(guò)SPSS19.0軟件，置信區(qū)間設(shè)為0.05，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(圖2)。SPSS 19.0 分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，通過(guò)t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 GLUT1引物的選擇及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過(guò)引物篩選，內(nèi)參基因GAPHD和GLUT1的引物PCR結(jié)果及繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，溶解曲線結(jié)果如下(表1，圖1)。

表1熒光定量PCR引物GAPDH和GLUT1

Tab.1 The primers of GAPDH and GLUT1 for qPCR

2.2 低溫脅迫下東北林蛙中GLUT1mRNA表達(dá)水平的變化

在低溫-1℃脅迫下，肝臟的GLUT1mRNA表達(dá)水平逐漸升高，脅迫24 h后顯著升高為對(duì)照組的9.17倍(P<0.01)，48 h后其表達(dá)水平逐漸降低。心臟的GLUT1mRNA表達(dá)水平上調(diào)，12～24 h表達(dá)量達(dá)高峰，為對(duì)照組的5倍(P<0.05)，48 h后開始降低，72 h降低為對(duì)照組的0.5倍。脂肪體的GLUT1mRNA表達(dá)水平在最初脅迫的24 h無(wú)顯著變化，48 h則顯著升高，為對(duì)照組的7.2倍，72 h降至初始水平。骨骼肌的GLUT1 mRNA表達(dá)水平在4～8 h逐漸升高為對(duì)照組的4.3倍，12～24 h降低為對(duì)照組的2倍，48 h后GLUT1 mRNA表達(dá)水平又上調(diào)達(dá)峰值，為對(duì)照組的7.9倍(P<0.01)，72 h恢復(fù)為初始表達(dá)水平的2.3倍。皮膚的GLUT1mRNA總體呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，為對(duì)照組的2～3倍，僅8 h降低至對(duì)照組水平的0.4倍。

圖1 GLUT1在qPCR中的溶解曲線Fig.1 The melt curve of GLUT1by qPCR

圖2 低溫脅迫下東北林蛙不同組織GLUT1mRNA表達(dá)變化內(nèi)參基因?yàn)镚APDH(* P<0.05，** P<0.01)Fig.2 The expression of GLUT1 mRNA during cold exposure in Rana dybowskii The corresponding tissues were liver，heart，fat body and skin. GAPDH as the reference (* P<0.05，** P<0.01)

3 討論

兩棲類耐寒機(jī)制的研究始于上世紀(jì)八十年代[10]，Joanisse在研究Ranasyivatica中發(fā)現(xiàn)在低溫環(huán)境下兩棲動(dòng)物通過(guò)精確的代謝調(diào)節(jié)避免細(xì)胞外液結(jié)冰。目前耐寒性動(dòng)物有兩種主要的抗凍機(jī)制，一種是機(jī)體轉(zhuǎn)換為低代謝狀態(tài)，通過(guò)抑制某些生化過(guò)程，降低能量損耗，從而保護(hù)機(jī)體免受低溫?fù)p傷[11]；另一種通過(guò)體內(nèi)合成高濃度的抗凍保護(hù)劑，最常見(jiàn)的為甘油和葡萄糖[12]。Storey研究發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫下美洲樹蛙主要器官的葡萄糖含量增加到150～300 mM，為機(jī)體初始水平的30～50倍[6，13]。

GLUT1是一種特異性轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的載體蛋白，分布廣泛，為細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖，提供細(xì)胞代謝所需的能量。因此我們推測(cè)，GLUT1的上調(diào)表達(dá)是細(xì)胞內(nèi)形成高濃度的葡萄糖保護(hù)劑的重要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肝臟、心臟、骨骼肌、脂肪體和皮膚中的GLUT1在低溫脅迫下的mRNA表達(dá)水平呈上調(diào)趨勢(shì)。其中，在低溫脅迫初期(4～12 h)上調(diào)表達(dá)最顯著的是皮膚組織，表明皮膚作為機(jī)體外部重要的防御和保護(hù)組織，對(duì)溫度的變化最為敏感。GLUT1基因水平的上調(diào)表達(dá)，預(yù)示著皮膚是最早合成抗凍保護(hù)劑的組織，為保護(hù)機(jī)體避免細(xì)胞結(jié)冰，起到了重要的門戶作用。隨后在8 h中表達(dá)變化最顯著的是骨骼肌組織，由此可見(jiàn)骨骼肌也是在低溫脅迫早期形成抗凍保護(hù)劑的重要組織。低溫脅迫中期(24～48 h)，GLUT1mRNA表達(dá)上調(diào)的組織為內(nèi)臟器官，其中包括肝臟、心臟和脂肪體，其表達(dá)水平達(dá)到峰值的時(shí)間相對(duì)滯后(24～48 h)，其中變化最顯著的為肝臟組織。分析肝臟作為機(jī)體轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的重要代謝器官，肝臟對(duì)葡萄糖的大量轉(zhuǎn)運(yùn)不僅可以形成高濃度的抗凍保護(hù)劑，保護(hù)機(jī)體阻止細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，免受低溫?fù)p傷，同時(shí)也可以為相關(guān)抗凍蛋白的合成提供能源，保證機(jī)體在低溫應(yīng)激下的能量所需。在低溫脅迫后期(72 h)，組織中上調(diào)GLUT1mRNA表達(dá)水平都有所回降，可見(jiàn)在機(jī)體逐漸適應(yīng)低溫環(huán)境下降低了葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)水平，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。

綜上所述，通過(guò)對(duì)低溫脅迫下東北林蛙不同組織中GLUT1mRNA表達(dá)水平變化的分析，表明GLUT1參與了低溫脅迫的應(yīng)激反應(yīng)，低溫冬眠期為組織器官高效率轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖，在形成細(xì)胞內(nèi)高濃度的葡萄糖抗凍保護(hù)劑和能量供應(yīng)方面起重要作用。

[1] Clark M S，Worland M R.How insects survive the cold：molecular mechanisms-a review[J].Journal of Comparative Physiology B，2008，178(8)：917-933.

[2] Block W，Wharton D A，Sinclair B J.Cold tolerance of a New Zealand alpine cockroach，Celatoblattaquinquemaculata(Dictyoptera，Blattidae)[J].Physiological Entomology，1998，23(1)：1-6.

[3] Costanzo J P，Lee R E，Lortz P H.Glucose concentration regulates freeze tolerance in the wood frogRanasylvatica[J].Journal of Experimental Biology，1993，181(1)：245-255.

[4] Bale J S，Hayward S A L.Insect overwintering in a changing climate[J].The Journal of Experimental Biology，2010，213(6)：980-994.

[5] Bazin Y，Wharton D A，Bishop P J.Cold tolerance and overwintering of an introduced New Zealand frog，the brown tree frog(Litoriaewingii)[J].Cryoletters，2007，28(5)：347-358.

[6] Storey K B，Storey J M.Insect cold hardiness：metabolic，gene，and protein adaptation[J].Canadian Journal of Zoology，2012，90(4)：456-475.

[7] 俞曉燕，孫子林.GLUT1的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，21(30)：3411-3414.

[8] Sung J Y，Kim G Y，Lim S J，et al.Expression of the GLUT1 glucose transporter and p53 in carcinomas of the pancreatobiliary tract[J].Pathology-Research and Practice，2010，206(1)：24-29.

[9] Heilig C W，Brosius F C 3rd，Henry D N.Glucose transporters of the glomerulus and the implications for diabetic nephropathy[J].Kidney international.Supplement，1997，60：S91-99.

[10] Storey K B，Storey J M.Freeze tolerance in animals[J].Physiological Reviews，1988，68(1)：27-84.

[11] Margesin R，Neuner G，Storey K B.Cold-loving microbes，plants，and animals-fundamental and applied aspects[J].Die Naturwissenschaften，2007，94(2)：77-99.

[12] Costanzo J P，Iverson J B，Wright M F，et al.Cold hardiness and overwintering strategies of hatchlings in an assemblage of northern turtles[J].Ecology，1995，76(6)：1772-1785.

[13] Xianghong X，Dong Z，Cuijun Y.Survival and metabolic responses to freezing temperature in the northeast forest frogRanadybowskii[J].Asiatic Herpetological Research，2008，11：147-152.

Glucose transporter 1(GLUT1)；Cryoprotectant；Cold exposure；Glucose

TheDynamicofGLUT1mRNAExpressioninRanadybowskiiDuringColdStress

GuoBaihongXiaoXianghong*GongShanshanZhangJingyuChaiLonghui

(NortheastForestryUniversity，Harbin，150040，China)

Dybowski’s frog(Ranadybowskii)is found in northeast China where it faces a seasonally cold climate.Thus the frog has evolved effective self-protection strategies for surviving cold during winter.One of these mechanisms is high concentration of glucose in blood which serves as a cryoprotectant.GLUT1 is the most widely distributed in the body cells.In this study，we obtained partial GLUT1 mRNA fragments by high-throughput sequencing and analyzed the changes in level ofRanadybowskiiGLUT1 mRNA transcript in liver，heart，fat body，skeletal muscle and skin during cold stress at-1℃ by using quantitative real-time PCR.In liver and heart，GLUT1 mRNA levels reached their peaks after 24h of cold stress at 9.17 and 5 fold induction to their control groups，respectively.In skeletal muscle and fat body，the expression of GLUT1 reached its top levels of 7. 2 fold induction after 48h of cold exposure． GLUT1 expression showed no significant change in skin． This study showed that GLUT1 participated in cold stress responses of Rana dybowskii and played an essential role in maintaining high concentrations of glucose．

稿件運(yùn)行過(guò)程

2016-01-18

修回日期：2016-02-03

發(fā)表日期：2016-05-10

抗凍保護(hù)劑；

冷刺激；

葡萄糖

S858.94

A

2310-1490(2016)02-134-04

郭柏宏，女，27歲，碩士研究生；主要從事分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。

*通訊作者：肖向紅， E-mail：xiaoxh2010@sina.com