張晉彥 吳爭 寧惠娟 方載浩 梁立軍 崔永一

(浙江農(nóng)林大學(xué)，臨安，311300) (龍井市農(nóng)村經(jīng)濟管理服務(wù)中心) (浙江農(nóng)林大學(xué))

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雜交蘭組培苗與內(nèi)生真菌共生培養(yǎng)體系的構(gòu)建1)

張晉彥 吳爭 寧惠娟 方載浩 梁立軍 崔永一

(浙江農(nóng)林大學(xué)，臨安，311300) (龍井市農(nóng)村經(jīng)濟管理服務(wù)中心) (浙江農(nóng)林大學(xué))

為了篩選出對雜交蘭組培苗生長有益的菌株，采用4種內(nèi)生真菌(被孢霉屬Mortierellasp.)，通過固體菌劑和液體菌劑2種接種方式，建立雜交蘭組培苗與真菌的共生培養(yǎng)體系。共生培養(yǎng)150 d后，運用石蠟切片法觀察到菌絲、菌絲結(jié)等典型的菌根結(jié)構(gòu)。結(jié)合重分離真菌形態(tài)觀察和分子鑒定，確定重分離菌株均為原接種菌株。結(jié)果表明：液體菌劑接種方式相比固體菌劑，對雜交蘭組培苗生長的促進(jìn)作用顯著；菌株FC5和FC9液體菌劑對雜交蘭組培苗的生長促進(jìn)作用顯著；FC17液體菌劑對雜交蘭組培苗根部生長促進(jìn)效果顯著。

內(nèi)生真菌；雜交蘭；菌劑；菌根顯微結(jié)構(gòu)；分子鑒定

To screen out beneficial fungi strains toCymbidiumhybridum(C.hybridum‘Princess Nobuko’×C.goeringii‘Huangshuixian’) plantlets growth, using solid inoculation and liquid inoculation, we established mycorrhizal symbiosis system between four kinds of endophytic fungi (Mortierellasp.) andCymbidiumhybridumplantlets. After 150-day symbiotic culture, typical mycorrhizal structures such as hyphae and pelotons were founded by permanent paraffin-cut section method. Considering morphological observation and molecular identification, it was confirmed that fungi isolated fromC.hybridumplantlets roots were the same as origin fungi. The liquid inoculum treatment was better than solid inoculum treatment. Strains FC5 and FC9 liquid inoculum treatments had obvious promoting effect on the growth ofC.hybridumplantlets. Strain FC17 liquid inoculum treatments significantly promoted the growth ofC.hybridumplantlet roots.

蘭科植物(Orchidacea)主產(chǎn)熱帶及亞熱帶地區(qū)[1]，具有較高的觀賞、藥用價值，其種類豐富，自古以來深受人們喜愛。隨著市場需求量的日益增長，野生蘭科植物資源遭到破壞，數(shù)量急劇減少，這使人們逐漸意識到保護(hù)蘭科植物種質(zhì)資源的重要性[2]。目前，組織培養(yǎng)技術(shù)在蘭科植物快速繁育及工廠化生產(chǎn)中被廣泛地運用，解決了部分野生珍稀品種的繁育問題。但是，組培苗馴化成活率偏低，植株瘦弱，開花延遲，這些現(xiàn)象成為了目前制約蘭花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要瓶頸[3]。

蘭科植物是典型的菌根共生型植物，菌根共生關(guān)系被認(rèn)為是引發(fā)其多樣性和適應(yīng)性進(jìn)化的一個主要因素[4]。Sakamoto et al[5]研究表明蘭科植物內(nèi)生真菌種類與其所處地理位置具有較大的相關(guān)性。在蘭科植物的生命周期中，不同的生長發(fā)育階段所需的真菌種類不同[6]。同一種真菌也可能與多種蘭科植物形成共生關(guān)系[7-8]。真菌通過菌絲體侵入蘭科植物根內(nèi)，形成菌絲團。植物細(xì)胞通過消解、吸收菌絲團來獲得養(yǎng)分[9]。在蘭科植物的生長初期，植物通過吸收真菌提供的水分和營養(yǎng)物質(zhì)，提高幼苗成活率，并促進(jìn)其生長發(fā)育[10-12]。

本研究利用課題組從野生國蘭根部分離保存的4種內(nèi)生真菌，開展雜交蘭組培苗與內(nèi)生真菌的共生體系研究，探討真菌對雜交蘭組培苗生長的影響，篩選對其生長有益的菌株，為蘭花生物肥的研發(fā)及其優(yōu)良種苗高效培育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

供試植株：浙江農(nóng)林大學(xué)組織培養(yǎng)實驗室提供的雜交蘭組培苗，其親本為大花蕙蘭‘皇后’(Cymbidiumhybridum‘Princess Nobuko’)(♀)和春蘭‘黃水仙’(Cymbidiumgoeringii‘Huangshuixian’)(♂)，選取長勢一致且植株健壯的雜交蘭組培苗，株高5～6 cm，葉3～5片，根3～5條，移栽馴化于浙江農(nóng)林大學(xué)平山溫室。

供試菌株：課題組保存的4種真菌[13]，菌株編號為FC5、FC9、FC12和FC17。

1.1 培養(yǎng)基及基質(zhì)

PDA液體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯煮30 min后，取其濾液加入蔗糖20 g·L-1，于121 ℃滅菌20 min備用，pH值自然。

PDA固體培養(yǎng)基：取馬鈴薯濾液加入蔗糖20 g·L-1，瓊脂7.5 g·L-1，于121 ℃滅菌20 min備用，pH值自然。

固體基質(zhì)：將木屑、棉籽殼、麥麩按體積比64%∶26%∶10%混合均勻，加入適量蒸餾水，濕度以手握基質(zhì)，指縫中有水滲出但不滴下為準(zhǔn)?；旌暇鶆蚝蠓盅b于無菌瓶中，121 ℃高壓滅菌20 min[14]。

蘭苗馴化基質(zhì)：將松樹皮基質(zhì)按中號與小號1∶1體積比(中號松樹皮直徑約12 mm，小號松樹皮直徑約6 mm)混合均勻，浸泡在稀釋1 000倍的多菌靈溶液中過夜，次日清水投洗2～3次，自然風(fēng)干，備用。

1.2 液體菌劑配制

在供試菌株菌落邊緣打取一個菌餅，接種到PDA液體培養(yǎng)基中，于搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，溫度26 ℃下暗培養(yǎng)5～7 d[15]。

1.3 固體菌劑配制

用無菌量筒量取懸浮均勻的菌液，均勻倒入固體基質(zhì)中，在溫度26 ℃暗培養(yǎng)7～10 d，觀察到菌絲長滿瓶壁后備用。

1.4 真菌重分離法

從每個處理中隨機抽取5株植株，取其新生營養(yǎng)根從根尖向上5～7 cm的小段，每株2～3段，在流水下沖洗20～30 min，用已消毒的剪刀剪成1 cm小段。用75%酒精消毒1 min，無菌水沖洗1次，再用0.1%升汞消毒6 min，無菌水沖洗3～4次。濾紙吸干根段表面水分，切去根段兩頭組織至5 mm左右小段，接種于PDA培養(yǎng)基上(一次性培養(yǎng)皿規(guī)格90 mm×15 mm，每板接種4個根段)，于恒溫培養(yǎng)箱中26 ℃暗培養(yǎng)3～5 d后，觀察重分離情況[16]。有白色絮狀菌絲分離出后，使用接種針挑取菌落邊緣菌絲接種于新PDA培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)接3次純化后移入冰箱保存。

1.5 真菌微觀形態(tài)觀察

在超凈工作臺中，用接種針挑取菌落邊緣少量菌絲于載玻片上，用乳酸酚棉蘭染料染色，蓋上蓋玻片制成臨時玻片，于OLYMPUS生物顯微鏡400倍下觀察真菌形態(tài)(菌絲有無隔膜，有無分枝，有無孢子，孢子形態(tài)，孢子大小等)并拍照記錄。

1.6 菌根顯微結(jié)構(gòu)觀察

從各處理中隨機抽取5株植株，每株取3段3～4 cm的營養(yǎng)根根段，流水洗凈后切成5 mm小段，經(jīng)FAA固定，系列脫水，石蠟包埋，使用手動旋轉(zhuǎn)切片機切片，切片厚度為14～16 μm，使用番紅固綠染色，中性樹膠封片，用光學(xué)顯微鏡觀察，并照相記錄[17-18]。

1.7 真菌分子鑒定

用CTAB法提取真菌基因組DNA，PCR擴增后使用DNA膠回收試劑盒(Sangon,China)回收純化，膠回收產(chǎn)物連接入pEASY-T1載體(TransGen,China)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽性克隆搖取菌液，測序工作委托Sangon公司完成。

1.8 試驗設(shè)計

本試驗選取長勢一致且植株健壯的雜交蘭組培苗，分組編號并稱取鮮質(zhì)量，種植于直徑90 mm塑料盆內(nèi)。每盆種植1株，每處理20盆，共設(shè)9個處理(表1)，每處理3次重復(fù)。試驗共2個因子，分別為菌株種類(菌株FC5，菌株FC9，菌株FC12，F(xiàn)C17)和接菌方式(A固體菌劑處理：在實驗室無菌條件下，將真菌菌液10 mL均勻接種在已配好的固體基質(zhì)內(nèi)，待其長滿瓶壁后，取培養(yǎng)好的固體菌劑，以10 g/盆的用量分別接種于處理組雜交蘭組培苗根部。B液體菌劑處理：在溫室環(huán)境下，將不同真菌菌液以10 mL/盆的用量，澆施在處理組雜交蘭組培苗根部)。對照組每盆基質(zhì)中混入10 g固體基質(zhì)，加蒸餾水10 mL，于溫室條件(溫度15～28 ℃，濕度60%～70%，晴天遮光60%～80%，保持通風(fēng)，施肥遵循少量多施的原則，奧綠肥(Scotts,America)每盆10粒；花寶2號(Hyponex,America)稀釋1 000倍，一周澆灌一次)共生培養(yǎng)150 d。

表1 雜交蘭組培苗接種內(nèi)生真菌(被孢霉屬Mortierellasp.)試驗設(shè)計

編號菌株編號來源植株處理方式栽培數(shù)量/盆1FC5蕙蘭1(Cymbidiumfaberi)1固體菌劑602FC5蕙蘭1(Cymbidiumfaberi)1液體菌劑603FC9蕙蘭2(Cymbidiumfaberi)2固體菌劑604FC9蕙蘭2(Cymbidiumfaberi)2液體菌劑605FC12春蘭(Cymbidiumgoeringii)固體菌劑606FC12春蘭(Cymbidiumgoeringii)液體菌劑607FC17四季蘭(Cymbidiumensifoliumvar.rubrigem-mum)固體菌劑608FC17四季蘭(Cymbidiumensifoliumvar.rubrigem-mum)液體菌劑609對照組 ——60

1.9 數(shù)據(jù)處理

共生培養(yǎng)150 d后，從每個處理組和對照組組培苗中隨機選擇10株生長健壯的植株，對單株鮮質(zhì)量、株高、葉片數(shù)量、根長、根數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計，分別在試驗處理開始和結(jié)束時記錄，并計算各項指標(biāo)的相對生長量，使用spss19.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌重分離

對處理組和對照組新生營養(yǎng)根根段進(jìn)行真菌重分離。處理組根段樣本均分離得到白色絨毛狀的真菌(圖1)，對照組根段樣本未分離出真菌。

2.2 重分離真菌形態(tài)觀察

分離得到的4種真菌經(jīng)純化后，真菌宏觀形態(tài)表現(xiàn)為白色絮狀菌絲，向周圍均勻輻射生長，7～10 d左右長滿9 cm培養(yǎng)皿；生長面有豐富菌絲，菌株FC12菌落形成半徑不同的同心圓環(huán)(表2)。

A～H為接種菌株FC5、FC9、FC12、FC17固體菌劑和液體菌劑處理組組培苗根段分離真菌情況。

菌株編號正面形態(tài)反面形態(tài)直徑/mm一致性FC5白色,蓬松絨氈狀,中間隆起白色,平滑49.25±0.34一致FC9白色,毛氈狀白色,平滑44.25±0.49一致FC12乳白色,菌絲豐富,蓬松,輻射狀淺黃色35.50±0.88一致FC17白色,蓬松絨氈狀白色37.75±0.19一致

注：直徑為接入PDA培養(yǎng)基上生長6 d后的菌落直徑的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；一致性為重分離真菌菌株和課題組保存原真菌菌株的形態(tài)一致性分析。

在光學(xué)顯微鏡下觀察真菌的微觀形態(tài)發(fā)現(xiàn)菌絲有隔，有分枝，孢子圓形，孢子直徑在6.06～7.57 μm(表3)。

表3 重分離真菌的微觀形態(tài)

注：一致性為重分離真菌菌株和課題組保存原真菌菌株的微觀形態(tài)一致性分析；表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2.3 雜交蘭組培苗菌根結(jié)構(gòu)觀察

雜交蘭組培苗根段橫切面從外到內(nèi)分別是根被，皮層和中柱。在其新生營養(yǎng)根中，菌絲穿透根被組織，侵入皮層細(xì)胞，形成菌絲、菌絲結(jié)等典型菌根結(jié)構(gòu)。菌絲的分布比較分散，由外向內(nèi)逐漸減少(圖2A)。在靠近外皮層的皮層細(xì)胞中有時可觀察到針狀結(jié)晶(圖2B)。在靠近外皮層的皮層細(xì)胞中觀察到質(zhì)粒，分布集中(圖2C)。接菌組培苗根部皮層細(xì)胞中，可以觀察到生長旺盛的真菌菌絲，經(jīng)番紅固綠雙重染色后呈現(xiàn)綠色，也可以觀察到老化的菌絲，經(jīng)染色后呈紅色(圖2D)。

2.4 重分離內(nèi)生真菌rDNA ITS序列分析

重分離獲得的真菌菌株用CTAB法提取基因組DNA，以DNA為模板，真菌通用引物ITS1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)作為上下游引物，進(jìn)行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳分析，檢測到擴增片段。

對真菌rDNA ITS擴增目標(biāo)位點進(jìn)行回收、克隆、測序，結(jié)果表明本試驗的4個真菌菌株序列長度均在600 bp左右。通過BLAST比對，4個真菌rDNA ITS序列與GenBank中已登錄的被孢霉屬Mortierellasp. dd08032真菌序列顯示較高的序列相似性見表4。結(jié)合真菌形態(tài)學(xué)觀察，可以判定接種真菌菌株侵入雜交蘭組培苗根部。

2.5 共生培養(yǎng)對雜交蘭組培苗生長的影響

在雜交蘭組培苗與內(nèi)生真菌共生培養(yǎng)初期，處理組與對照組生長速度無顯著差異，隨著共生培養(yǎng)時間的增長，差異逐漸顯現(xiàn)。處理組葉片普遍比對照組葉片堅挺、翠綠，并且新葉增長速度快。接種固體菌劑處理組少部分新生根存在發(fā)黑萎蔫的現(xiàn)象，而液體菌劑處理組幼苗新根呈乳白色，數(shù)量較多且生長健壯。

A.皮層細(xì)胞內(nèi)菌絲結(jié)(P為菌絲結(jié))；B.皮層細(xì)胞內(nèi)針狀結(jié)晶(AC為針狀結(jié)晶)；C.皮層細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒(PL為質(zhì)粒)；D.老化菌絲(F為真菌菌絲)。

圖2 雜交蘭組培苗菌根結(jié)構(gòu)觀察

表4 重分離真菌rDNA序列與最相近序列種Mortierellasp. dd08032(FJ810149.1)比對結(jié)果

來源植物菌株編號覆蓋范圍/%最大識別率/%序列長度/bp蕙蘭1FC5-110099616FC5-2100100617FC5-3100100617蕙蘭2FC9-110099617FC9-210099617FC9-310099617春蘭FC12-1100100617FC12-2100100617四季蘭FC17-1100100617FC17-2100100617FC17-310099617

接種真菌后發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌對雜交蘭組培苗鮮質(zhì)量、株高、新葉數(shù)等地上部分的生長促進(jìn)作用顯著。菌株FC5、FC9液體菌劑處理組鮮質(zhì)量的增加量顯著高于對照組，增長率分別達(dá)325.9%和322.7%。FC9液體菌劑株高的增長量達(dá)到60 mm左右，與對照組的差異達(dá)極顯著水平。FC9固體菌劑處理和FC5液體菌劑處理組株高增長量與對照組的差異達(dá)到顯著水平。FC9、FC17固體菌劑處理和FC5液體菌劑處理組新葉數(shù)均極顯著高于對照組，F(xiàn)C9固體菌劑處理組新葉數(shù)達(dá)到5片(圖3)。

在促進(jìn)根系生長方面，菌株FC17液體菌劑處理能較好地促進(jìn)根系的生長，新根數(shù)和根長增長量均極顯著高于對照組。FC5液體菌劑處理對新根的產(chǎn)生也有明顯的促進(jìn)作用。FC9固體菌劑處理組新根數(shù)與對照組的差異達(dá)極顯著水平，新根數(shù)約6條(表5)。

3 結(jié)論與討論

蘭科植物與真菌的共生關(guān)系被認(rèn)為是一種偏利性共生，即共生體系建立后，蘭科植物受益更大，體現(xiàn)在生物量的明顯增加[19]。陳曉梅對接菌金釵石斛研究發(fā)現(xiàn)菌株MF15對金釵石斛長勢有影響，能極顯著增加氣生根數(shù)量，對無菌苗生長有促進(jìn)作用[20]。張麗春發(fā)現(xiàn)接種小菇屬真菌鐵皮石斛根系粗大，生長速度加快，生物量顯著提高[21]。本試驗FC17液體菌劑僅對雜交蘭根系生長有較大的促進(jìn)作用。從野生蕙蘭中分離出的兩種菌株FC5和FC9，其液體菌劑對雜交蘭組培苗具有明顯的促進(jìn)作用，具有商業(yè)開發(fā)與應(yīng)用前景，值得深入研究。

兩種接種方式均可以使雜交蘭和內(nèi)生真菌建立共生關(guān)系，但二者共生關(guān)系達(dá)到平衡才能促進(jìn)植株的生長發(fā)育。通過觀察發(fā)現(xiàn)接種固體菌劑處理組基質(zhì)間隙始終有少量菌絲分布，而接種液體菌劑處理組，前期基質(zhì)內(nèi)有少量菌絲分布，隨著共生時間增長，基質(zhì)內(nèi)菌絲分布量減少，后期基質(zhì)內(nèi)未能觀察到明顯的菌絲。液體菌劑接種方式優(yōu)于固體菌劑，可能是隨著接種時間的增加，固體菌劑處理組真菌菌絲濃度增大，使雜交蘭組培苗和真菌的共生關(guān)系失衡，抑制了植株的生長[22]。固體菌劑最佳的基質(zhì)配方、菌液接種劑量，以及適宜真菌的生長環(huán)境和培養(yǎng)時間等問題還有待研究。生長快速又易與植株達(dá)成共生關(guān)系的真菌，在施用中應(yīng)使用較低濃度，或者減少接種劑量[23]。

圖3 不同處理組對雜交蘭組培苗的影響

編號鮮質(zhì)量/g葉片數(shù)量/片株高/mm根數(shù)量/條根長/mm1(3.58±0.50)*3.21±0.3730.67±2.79(4.33±0.48)*25.91±3.42 2(7.78±0.67)*(4.54±0.33)**(47.33±2.78)*(5.17±0.56)**30.08±2.0135.86±0.51(5.04±0.87)**(48.17±0.83)*(6.33±0.48)**26.74±3.004(7.86±0.47)*(4.38±0.40)*(60.67±2.59)**3.50±0.6828.41±2.5056.83±0.59(4.04±0.31)*(42.33±2.11)*(4.33±0.40)*30.91±1.6366.07±0.623.04±0.40(43.17±2.39)*2.50±0.5833.41±2.507(3.45±0.60)*(4.54±0.33)**34.83±4.362.17±0.21(15.08±1.62)**85.68±0.953.21±0.26(45.67±3.57)*(5.00±0.56)**(37.58±2.65)**95.52±0.912.71±0.5033.17±2.712.83±0.5626.74±1.54

注：*和** 分別表示與對照組CK在P<0.05水平上差異顯著，在P<0.01水平上差異極顯著；表中數(shù)據(jù)為共生處理前后試驗植株生物量增長量平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

蘭科菌劑作為一種微生物肥料，有環(huán)保，可持續(xù)，生產(chǎn)成本較低等特點，可避免化學(xué)肥料、農(nóng)藥殘留對人畜健康構(gòu)成的威脅及對環(huán)境破壞，同時可以用作生物防治，防治病蟲害，且害蟲和病菌難以產(chǎn)生抗藥性。通過對蘭科植物內(nèi)生真菌研究，篩選出有益蘭科植物共生菌，對解決瀕危蘭花資源重引入或遷地保護(hù)等問題具有重要的實踐意義，對蘭科植物的工廠化生產(chǎn)和蘭花生物肥的研發(fā)具有廣闊的市場前景。

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Establishing Symbiotic Cultivation System of Tissue-culturedCymbidiumhybridumPlantlets and Endophytic Fungi//

Zhang Jinyan, Wu Zheng, Ning Huijuan

(Zhejiang Agricultural and Forestry University, Lin’an 311300, P. R. China);

Fang Zaihao

(Service Center for the Rural Economy Management, Longjing);

Liang Lijun, Cui Yongyi

(Zhejiang Agricultural and Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(10)：30-34,60.

Endophytic fungi;Cymbidiumhybridum; Microbial inoculum; Mycorrhizal microstructure; Molecular identification

張晉彥，女，1990年8月生，浙江農(nóng)林大學(xué)風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，碩士研究生。E-mail:331361040@qq.com。

崔永一，浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，教授。E-mail:orchidcui@163.com。

2016年4月10日。

S682.31

1)浙江省林學(xué)一級重中之重學(xué)科研究生創(chuàng)新項目(201534)；浙江省溫州科技局國際合作項目(H20080049)；浙江省花卉新品種選育重大科技專項重點項目(2012C12909-11)。

責(zé)任編輯：潘 華。