朱文淵李海濤

（1.濟(jì)寧市畜牧獸醫(yī)局，山東濟(jì)寧 272037；2.曲阜市畜牧獸醫(yī)局，山東曲阜 273100）

不同稀釋劑對(duì)獺兔精液保存和授精效果的影響研究

朱文淵1李海濤2

（1.濟(jì)寧市畜牧獸醫(yī)局，山東濟(jì)寧 272037；2.曲阜市畜牧獸醫(yī)局，山東曲阜 273100）

采用單因素隨機(jī)分組設(shè)計(jì)研究了4種稀釋劑配比對(duì)獺兔精子存活時(shí)間、精子活力變化及授精效果的影響。結(jié)果表明∶生理鹽水組（NS組）精子存活時(shí)間最長(zhǎng)為33.3±1.0h，極顯著高于果糖-檸檬酸鈉組（Fru-SC組）（23.3±0.6h）、葡萄糖-檸檬酸鈉組（G-SC組）（22.3±0.6h）和蔗糖-檸檬酸鈉組（Suc-SC組）（21.2±0.8h），F(xiàn)os-SC組和G-SC組無顯著差異，F(xiàn)os-SC組極顯著高于Suc-SC組；精子活力隨保存時(shí)間增加均呈下降趨勢(shì)，且在12h以內(nèi)4組均能滿足授精要求。授精試驗(yàn)表明∶保存4h以內(nèi)，4種稀釋劑對(duì)獺兔受孕率（70～74%）和產(chǎn)仔率（6.17±1.40～6.44±1.42）均無顯著影響。

獺兔；精液；稀釋劑；存活時(shí)間；精子活力；受孕率；產(chǎn)仔數(shù)

獺兔為皮肉兼用品種，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。自2013年以來，獺兔價(jià)格下行，市場(chǎng)低迷，但優(yōu)質(zhì)兔皮仍供不應(yīng)求。我國(guó)是獺兔養(yǎng)殖大國(guó)，但養(yǎng)殖水平不高，種質(zhì)資源退化嚴(yán)重。在歐洲，養(yǎng)兔普遍采用育種公司提供優(yōu)質(zhì)鮮精，養(yǎng)殖戶人工授精的方式繁殖［1］。人工授精技術(shù)的應(yīng)用可使優(yōu)質(zhì)種公兔的利用率提高10倍以上，能加速優(yōu)質(zhì)兔群的選育，降低生產(chǎn)成本，并避免各類疾病的垂直傳播。當(dāng)前，我國(guó)獺兔的飼養(yǎng)方式主要為庭院養(yǎng)殖，規(guī)模小、養(yǎng)殖水平低，繁殖多為本交，僅在部分規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)逐步采用人工授精。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器和試劑

顯微鏡（鳳凰XSP-35-1600X）、生物培養(yǎng)箱（上海新苗SPX150）、手提式高壓滅菌器（新豐XFS-280）、百分之一電子天平（梅特勒）、兔用采精器、輸精槍等。

無水檸檬酸鈉、檸檬酸、蔗糖、果糖、葡萄糖均為分析純，促排卵3號(hào)（LHRH-A，寧波三生藥業(yè)），孕馬血清（PMSG，寧波三生藥業(yè)），生理鹽水，青霉素，鏈霉素等。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

選取約12月齡健康美系獺兔種公兔20只，經(jīng)產(chǎn)2～3胎健康母兔200只做為試驗(yàn)動(dòng)物，均由曲阜市佳利獺兔養(yǎng)殖合作社種兔場(chǎng)提供。

1.3 稀釋液配制

試劑配制所用玻璃器皿、去離子水均在121℃高壓滅菌20min，試劑稱量使用百分之一天平，準(zhǔn)確至0.01g。按表1配制稀釋液，每100ml稀釋液中含青、鏈霉素各10IU，2～4號(hào)稀釋液滴加少量檸檬酸調(diào)節(jié)pH值到6.5。1到4號(hào)稀釋液滲透濃度分別為：308mmol/L、400mmol/L、400mmol/L、305mmol/L。配制好后35℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

使用假陰道式采精器采集精液，正常精液應(yīng)為乳白色，無異物，鏡檢呈云霧狀翻騰，活力在0.7以上。將合格的精液混勻，過4層紗布，鏡檢活力應(yīng)在0.7以上。

精子活力隨時(shí)間變化規(guī)律和存活時(shí)間測(cè)定：混精用各組稀釋液按1：5的比例稀釋混勻，每組各取3份，每份2mL置于滅菌的青霉素小瓶中，于4℃冰箱內(nèi)保存，于稀釋后4h、12h、24h、48h分別檢查一次精力活力，并記錄存活時(shí)間。

表1 不同稀釋液配制表

授精試驗(yàn)：采用單因素隨機(jī)分組設(shè)計(jì)，每組母兔50只。母兔注射25單位PMSG同期發(fā)情，注射后2～5h達(dá)到發(fā)情高峰。用35℃平衡的各組稀釋液按1：5的比例稀釋混精，每只母兔輸精0.5ml，同時(shí)注射0.5單位LHRH-A超排，整個(gè)過程在精液稀釋后4h內(nèi)完成。統(tǒng)計(jì)受孕率和產(chǎn)仔率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS19.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，顯著性檢驗(yàn)采用LSD法和Duncan法。使用卡方分析對(duì)受孕率進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果分析

2.1 不同稀釋劑對(duì)精子活力和存活時(shí)間的影響

如表2所示，4類稀釋液對(duì)精子存活時(shí)間的影響存在極顯著差異。NS組精子存活時(shí)間最長(zhǎng)，極顯著高于其它3組（P＜0.01）。Fru-SC組和G-SC組精子存活時(shí)間無顯著差異（P＞0.05），F(xiàn)ru-SC組精子存活時(shí)間極顯著高于Sur-SC組（P＜0.01），G-SC組和Sur-SC組稀釋液之間存活時(shí)間無顯著差異（P＞0.05）。各組稀釋液精子活力隨時(shí)間均呈下降趨勢(shì)，但在12h以內(nèi)，精子活力均大于0.6，能滿足人工授精的要求。

表2 不同稀釋劑對(duì)精力活力變化和存活時(shí)間的影響 n=3

2.2 不同稀釋劑對(duì)受孕率和產(chǎn)仔數(shù)的影響

不同稀釋劑對(duì)獺兔人工授精受孕率和平均產(chǎn)仔數(shù)的影響如表3所示。各組的受孕率在70～74%之間，和該場(chǎng)年平均受孕率72%左右持平。Fru-SC組平均產(chǎn)仔數(shù)最高達(dá)到6.44只，NS組6.17只的平均產(chǎn)仔數(shù)最低，但均高于該廠年平均窩產(chǎn)仔數(shù)6只的水平。各組稀釋液之間受孕率和平均產(chǎn)仔數(shù)均無顯著性差異（P＞0.05）。

表3 不同稀釋劑對(duì)受孕率和產(chǎn)仔數(shù)的影響

3 討論

（1）張兆旺（2001）研究表明，使用8種不同的稀釋劑配方，平均精子生存指數(shù)均在等滲濃度附近（300mmol/L）最高［2］。在偏高滲的環(huán)境中精子可以保持流線型的正常形態(tài)，且對(duì)精子存活時(shí)間、生存指數(shù)均無顯著影響［2］。精子在偏酸性環(huán)境下，活動(dòng)力降低，可較長(zhǎng)時(shí)間保持授精能力［3］。檸檬酸鈉可以起到抗精子凝集和緩沖pH值的作用；蔗糖具有保護(hù)生物膜，維持精子正常生理形態(tài)的功能。果糖和葡萄糖均是精子可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，本試驗(yàn)中所使用的4中稀釋劑為等滲或微高滲，并調(diào)節(jié)pH值到6.5，在此基礎(chǔ)上研究不同成分對(duì)精液保存時(shí)間、活力等各項(xiàng)指標(biāo)的影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，保存12h以內(nèi)精子活力下降緩慢，各組稀釋液均能滿足人工授精的要求。存活時(shí)間NS組最長(zhǎng)極顯著高于其它3組，此結(jié)果和張兆旺（2001）［2］在雞上的研究結(jié)果一致，究其原因可能是鈉離子對(duì)精子的興奮作用有關(guān)。兩種單糖的添加對(duì)精子存活時(shí)間無顯著影響，這表明在適宜緩沖條件下，因精子利用單糖而導(dǎo)致pH值下降的損傷可以消除。蔗糖在稀釋劑中主要起維持精子正常形態(tài)的作用，對(duì)提高存活時(shí)間并未表現(xiàn)出作用，這也可能是由于各組間緩沖濃度的不同造成的。

（2）授精試驗(yàn)結(jié)果顯示，各組間受孕率無顯著性差異，且均高于70%，這和孫亞紅（2011）在長(zhǎng)毛兔上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致［4］，也和該場(chǎng)年平均受孕率72%左右持平。平均產(chǎn)仔數(shù)NS組最低，這可能是由于在NS保存過程中會(huì)造成精子畸形率過高導(dǎo)致，因此，NS組較高的精子存活時(shí)間可能并無應(yīng)用價(jià)值。Sur-SC組在存活時(shí)間上略低，在保存12h以內(nèi)精子活力與其它各組無顯著差異，且受孕率和平均產(chǎn)仔數(shù)和其它各組均無顯著性差異，鑒于蔗糖對(duì)細(xì)胞膜的保護(hù)作用，由此推斷在精子保存時(shí)間延長(zhǎng)的時(shí)候可能會(huì)有較好的授精效果。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下可以得出以下結(jié)論：4℃保存條件下，使用4種稀釋液精子存活時(shí)間由長(zhǎng)到短依次為生理鹽水組、果糖-檸檬酸鈉組、葡萄糖-檸檬酸鈉組和蔗糖-檸檬酸鈉組；隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)，各組稀釋液精子活力呈下降趨勢(shì)，在12h以內(nèi)均能滿足人工授精的要求。使用各組稀釋液，精子保存時(shí)間在4h以內(nèi)進(jìn)行授精試驗(yàn)并不影響獺兔的受孕率和產(chǎn)仔率。生理鹽水獲取簡(jiǎn)便，在精子短期保存的條件下（4h以內(nèi)）建議選用生理鹽水做為精子稀釋劑。

［1］ 秦應(yīng)和，李福昌，余志菊，等.歐洲三國(guó)兔業(yè)考察報(bào)告［J］.草食與畜牧，2010，（11）：56-60.

［2］ 張兆旺.稀釋液溶質(zhì)和滲透壓對(duì)精子體外存活及形態(tài)的影響［J］.中國(guó)家禽，2001，23（8）：50-52.

［3］ 穆秀名，吳淑琴，王凈，等.不同稀釋液對(duì)塞北兔精液保存效果的影響［J］.黑龍江動(dòng)物繁殖，2011，19（2）：11-13.

［4］ 孫亞紅，聶文貴，裴學(xué)，等.不同季、不同稀釋液對(duì)長(zhǎng)毛兔人工授精對(duì)比試驗(yàn)［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011，（1）：62-63.