江美芳+王勤輝+龐歡歡+田悅+王曉燁+孫璐+高偉+黃建梅

[摘要]糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）和糖尿病腎?。―N）是最常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥，也是糖尿病致死致殘的主要原因，臨床報(bào)道顯示復(fù)方血栓通膠囊對(duì)DR和DN均有較好的治療作用，但復(fù)方血栓通膠囊中的化學(xué)成分在眼球和腎臟中的分布尚無(wú)報(bào)道，該研究主要探索復(fù)方血栓通膠囊中的化學(xué)成分在比格犬眼球和腎臟中的分布情況。比格犬連續(xù)灌胃給予復(fù)方血栓通膠囊3 d后，取眼球和腎臟，運(yùn)用高效液相色譜-高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)LTQ-Orbitrap鑒定其中的化學(xué)成分，通過(guò)與對(duì)照品及相關(guān)文獻(xiàn)中化學(xué)成分的精確相對(duì)分子質(zhì)量、保留時(shí)間以及二級(jí)碎片信息比對(duì)，確認(rèn)化合物。該研究在眼球和腎臟中分別鑒定出14，19個(gè)三七皂苷類成分。鑒定結(jié)果為闡釋復(fù)方血栓通膠囊在治療DR和DN的有效成分奠定了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]復(fù)方血栓通膠囊； 三七皂苷； 眼球； 腎臟； HPLC LTQ-Orbitrap

[Abstract]Diabetic retinopathy（DR） and diabetic nephropathy（DN） are the most common complications of diabetes， and the main causes of death and disability of diabetes. Clinical reports showed that Fufang Xueshuantong capsule（FXT） had effective curative effect on DR and DN， but there was no report on the distribution of chemical compounds of FXT in beagle dog eyes and kidneys. In this study， FXT was given by gavage administration in Beagle dogs for 3 days， and then their eyeballs and kidneys were taken. The chemical compounds in beagle dog eyes and kidneys were detected by HPLC LTQ-Orbitrap technology. Furthermore， by comparing with the data from retrieving literature and references， the chemical compounds were identified by the accurate mass， retention time （t_R）， and MS/MS. Fourteen and 19 types of notoginsenosides were respectively identified in eyeballs and kidneys in this study， and these results could lay foundation for clarifying the effective ingredients of FXT in treatment of DR and DN.

[Key words]Fufang Xueshuantong capsule； notoginsenosides； eyeball； kidney； HPLC LTQ-Orbitrap

doi：10.4268/cjcmm20162022

糖尿病是一種常見(jiàn)疾病，它不僅導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂，而且可引起多個(gè)系統(tǒng)的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響人類健康。糖尿病并發(fā)癥，是糖尿病致死致殘的主要原因。糖代謝異常導(dǎo)致血管、神經(jīng)以及組織器官的損傷，其中糖尿病眼病、糖尿病腎病是最常見(jiàn)的糖尿病微血管并發(fā)癥之一，目前對(duì)該類疾病的治療藥物較少。復(fù)方血栓通膠囊是中山大學(xué)中山眼科中心與廣東眾生藥業(yè)股份有限公司共同研制開(kāi)發(fā)的純中藥復(fù)方制劑，由君藥三七、臣藥丹參、佐使藥黃芪、玄參4味藥組成。三七占全方的54.3%，具有活血化瘀、益氣養(yǎng)陰的功效。復(fù)方血栓通膠囊在眼科疾病中廣泛應(yīng)用，尤其是對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變療效顯著^[1-3]。同時(shí)，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道^[4-5]，復(fù)方血栓通膠囊能較好的改善腎功能，對(duì)糖尿病腎病具有保護(hù)作用。

在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下， 中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，即具有臨床療效的有效成分，是探索中藥功效與其作用的本質(zhì)與核心，是中藥現(xiàn)代化發(fā)展的基礎(chǔ)^[6]。課題前期已對(duì)復(fù)方血栓通膠囊入血成分及糞、尿中的代謝成分進(jìn)行了研究，但對(duì)復(fù)方血栓通膠囊在組織器官中的化學(xué)成分分布情況未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，有關(guān)復(fù)方血栓通膠囊治療糖尿病眼病和腎病的物質(zhì)基礎(chǔ)研究較薄弱，前期研究結(jié)果顯示復(fù)方血栓通膠囊進(jìn)入體內(nèi)的主要為三七皂苷類成分，故三七皂苷類成分為研究的重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象。

二維線性離子阱（LTQ）-Orbitrap是一種新型質(zhì)譜儀，具有很高的靈敏度和分辨率，能夠提供高精度的質(zhì)量數(shù)，從而得到可能的元素組成信息；能夠獲得化合物豐富的多級(jí)質(zhì)譜信息從而利于化合物的結(jié)構(gòu)鑒定^[7-8]；同時(shí)，母離子列表（parent ion list， PIL）以及選擇離子監(jiān)測(cè)（select ion monitoring， SIM）檢測(cè)方式結(jié)合數(shù)據(jù)依賴性掃描，可以輔助達(dá)到目標(biāo)化合物以及微量/痕量成分快速檢測(cè)的目的^[9]。無(wú)論是常規(guī)化合物鑒定還是要求更為嚴(yán)格的復(fù)雜體系中痕量物質(zhì)的分析，該質(zhì)譜系統(tǒng)優(yōu)越的檢測(cè)性能使之在各個(gè)領(lǐng)域得到迅速應(yīng)用^[10-11]。

為了進(jìn)一步闡釋復(fù)方血栓通膠囊治療DR和DN的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究運(yùn)用高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)HPLC LTQ-Orbitrap鑒定給予復(fù)方血栓通膠囊后比格犬眼球和腎臟中的三七皂苷類成分。

1 材料

結(jié)合型傅立葉變換高分辨質(zhì)譜 Thermo-Fisher LTQ-Orbitrap XL（Thermo Fisher Scientific， USA），配有Accela 600 pump HPLC液相系統(tǒng)（Thermo， USA）。

復(fù)方血栓通膠囊（批號(hào)150421）購(gòu)自廣東眾生藥業(yè)股份有限公司；原人參三醇（PPT）型皂苷：人參皂苷Re（MUST-15031711），Rg₁（MUST-16022407），Rg₂（MUST-14040919），Rh₁ （MUST-15052717），三七皂苷R₁（MUST-16041806）， R₂；原人參二醇（PPD）型皂苷：人參皂苷Rg3（批號(hào)MUST-15082211），Rb₁（MUST-16021907），F(xiàn)₂（批號(hào)MUST-16032202），Rh₂（MUST-14031112），Rd（MUST-16012503），七葉膽皂苷ⅩⅦ（MUST-16040617），均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司。

色譜級(jí)甲醇和乙腈購(gòu)自Fisher科技（美國(guó)）有限公司，質(zhì)譜級(jí)甲酸購(gòu)自Sigma化學(xué)有限公司。

2 方法

2.1 溶液的制備 復(fù)方血栓通膠囊混懸液的制備：復(fù)方血栓通膠囊去殼，稱取藥物粉末，配制成質(zhì)量濃度約為0.25 g·mL^-1的0.5%羧甲基纖維素鈉混懸溶液，備用。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取三七皂苷類對(duì)照品適量，用甲醇定容，配制成一定濃度的混標(biāo)溶液。

2.2 動(dòng)物給藥方案和生物樣品的采集 雄性比格犬，2只，每只重10 kg左右，購(gòu)自北京市沙河通利試驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。

健康雄性比格犬2只，隨機(jī)分為空白組和給藥組，給藥前禁食12 h（不禁水）。按照4 mL·kg^-1（即1 g·kg^-1）給比格犬灌胃，每日1次，連續(xù)給藥3 d，于第3天給藥后2 h注射戊巴比妥鈉溶液處死，取眼球和腎臟，用生理鹽水清洗干凈，于-80 ℃冰箱保存。

2.3 生物樣品的前處理 取給藥犬眼球，稱重，除去外膜，加入2倍量生理鹽水，勻漿機(jī)充分?jǐn)囁?，取勻漿液2 mL，加入3倍量甲醇，渦旋1 min，12 000 r·min^-1離心15 min，取上清液室溫下氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?00 μL甲醇-水（5∶1）復(fù)溶，進(jìn)樣 10 μL，進(jìn)行 LC-MS/MS 分析?？瞻籽矍颉⒛I臟前處理同給藥眼球。

2.4 液質(zhì)條件 色譜條件：采用 XBridge C₁₈色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），聯(lián)有Phenomenex C₁₈預(yù)柱（0.3 mm×4 mm，5 μm），流動(dòng)相 A 為乙腈，B 為 0.1%甲酸水，梯度洗脫（0～10 min，20%～22%A；10～15 min，22%A；15～18 min，22%～31%A；18～30 min，31%～32%A；30～35 min，32%～63%A；35～40 min，63%A；40～45 min，63%～83%A），流速 1.0 mL·min^-1，柱溫為室溫。

質(zhì)譜條件：ESI 源，負(fù)離子模式，毛細(xì)管溫度 350 ℃，鞘氣流速 30單位，輔助氣流速 10單位，噴霧電壓3 kV，毛細(xì)管電壓-35 V，管透鏡電壓-110 V，樣品先進(jìn)行全掃描，分辨率 R 設(shè)為3萬(wàn)，掃描范圍 m/z 100～1 500，二級(jí)和三級(jí)質(zhì)譜采用動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)依賴性掃描（data dependent scan，DDS），選取上一級(jí)豐度前三強(qiáng)的峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離（CID）碎片掃描，以離子阱打拿極（dynode） 檢測(cè)。

2.5 數(shù)據(jù)處理 高分辨數(shù)據(jù)處理軟件釆用 QualBrowser of Xcalibur 2.1 （Thermo Fisher Scientific ）。該軟件可進(jìn)行化合物的提取鑒定（EIC），元素組成預(yù)測(cè)誤差在5。

3 結(jié)果與討論

3.1 三七皂苷對(duì)照品HPLC-MS規(guī)律分析 在流動(dòng)相中含有0.1%甲酸、負(fù)離子條件下，三七皂苷類成分主要以[M+COOH]-和[M-H]-2種離子形式存在，其中 [M-H]-的響應(yīng)強(qiáng)度一般較低。

在二級(jí)質(zhì)譜中，三七皂苷類成分主要經(jīng)過(guò)CID裂解產(chǎn)生脫去糖基后的碎片離子和皂苷苷元（人參三醇苷元和人參二醇苷元）的碎片離子。糖基主要有葡萄糖（m/z162）、鼠李糖（m/z146）、阿拉伯糖（m/z132）、木糖（m/z132）；二醇型皂苷常產(chǎn)生的共同碎片離子有m/z621 （C₄₂H₇₁O₁₃^-，苷元+C₆H₁₀O₅-H^-）、459（C₃₀H₅₁O₃^-，苷元-H^-） 和375（C₂₄H₃₉O₃^-，苷元-C₆H₁₂-H^-），三醇型皂苷常產(chǎn)生的共同碎片離子有m/z637（C₃₆H₆₁O₉^-，苷元+C₆H₁₀O₅-H^-）、475（C₃₀H₅₁O₄^-苷元-H^-）和391（C₂₄H₃₉O₄^-， 苷元-C₆H₁₂-H^-）。根據(jù)以上特征，能更好更快的鑒定三七皂苷類成分。

3.2 三七皂苷類成分的鑒定 結(jié)合3.1項(xiàng)下皂苷特點(diǎn)，通過(guò)化合物的精確相對(duì)分子質(zhì)量、二級(jí)碎片信息以及保留時(shí)間，與對(duì)照品或者文獻(xiàn)比對(duì)，對(duì)化合物進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果圖1，2和表1。

化合物M3（t_R8.6 min）：該化合物的加合離子峰m/z977.528 0 [M+COOH]^-，準(zhǔn)分子離子峰m/z 931.521 7 [M-H]^-，通過(guò)數(shù)據(jù)處理軟件推測(cè)其分子式為C₅₅H₉₃O₂₅。該化合物二級(jí)碎片離子m/z637，475，391為PPT型皂苷產(chǎn)物離子，推測(cè)該化合物為三七皂苷類成分。其二級(jí)碎片主要通過(guò)丟失糖基產(chǎn)生，m/z799.53為m/z931.53丟失1個(gè)木糖基（m/z132）的離子[M-H-Xyl]^-，m/z769.43為m/z931.53丟失1個(gè)葡萄糖基（m/z162）的離子[M-H-Glc]^-，m/z637.43為m/z769.43丟失1個(gè)木糖基（m/z132）或m/z799.53丟失1個(gè)葡萄糖基（m/z162）的離子[M-H-Xyl-Glc]^-，m/z475.46為m/z637.43丟失1個(gè)葡萄糖基（m/z162）的離子（[M-H-Xyl-Glc]^-），m/z391.31為m/z475.46進(jìn)一步丟失C-20位連接的脂肪鏈所得的離子[M-H-Xyl-2Glc-84]^-。與對(duì)照品三七皂苷R₁的精確相對(duì)分子質(zhì)量、保留時(shí)間以及二級(jí)碎片信息一致，故確認(rèn)該化合物為三七皂苷R₁。

化合物M5，M20，M21：具有相同的加合離子峰m/z991.54 [M+COOH]^-和準(zhǔn)分子離子m/z945.54 [M-H]^-，保留時(shí)間分別為11.5，33.0，33.9 min。經(jīng)CID裂解，M20和M21均通過(guò)丟失糖基產(chǎn)生碎片離子m/z783[M-H-Glc]^-和621[M-H-2Glc]^-，見(jiàn)表1。M20和M21與對(duì)照品七葉膽皂苷ⅩⅦ和人參皂苷Rd的精確相對(duì)分子質(zhì)量、保留時(shí)間以及二級(jí)碎片信息均一致，故推測(cè)化合物M20為七葉膽皂苷ⅩⅦ，M21為人參皂苷Rd。而化合物M5經(jīng)CID裂解后，丟失一系列糖基產(chǎn)生碎片離子m/z783[M-H-Glc]^-，637[M-H-Glc-Rha]^-，475[M-H-2Glc-Rha]^-， 其中m/z637，475為三醇型皂苷常見(jiàn)碎片離子，與M20，M21不同，與對(duì)照品人參皂苷Re精確相對(duì)分子質(zhì)量、保留時(shí)間以及二級(jí)碎片信息一致，故推測(cè)化合物M5為人參皂苷Re。

其余化合物皆可同樣推導(dǎo)，其中化合物M1～M2，M6～M11，M16～M19，M23無(wú)對(duì)照品，與參考文獻(xiàn)比對(duì)確定結(jié)構(gòu)^[12-15]。

4 討論

復(fù)方血栓通膠囊灌胃后，運(yùn)用高效液相色譜-高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定出比格犬眼球和腎臟內(nèi)三七皂苷類成分分別14個(gè)和19個(gè)。

由于基質(zhì)效應(yīng)，以及三七皂苷類成分生物利用度等影響，生物樣品中三七皂苷類成分檢測(cè)率較低，采用全掃描模式，無(wú)法獲取低豐度皂苷的二級(jí)碎片信息。因此本研究在全掃描的基礎(chǔ)上，加以母離子列表掃描模式，針對(duì)性的獲取濃度較低化合物的二級(jí)碎片信息，對(duì)這類皂苷成分進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。

三七皂苷類成分在眼球和腎臟中主要以原型形式存在。由于血眼屏障作用，進(jìn)入眼球中的三七皂苷類成分種類較少，進(jìn)入眼組織的三七皂苷類成分主要為低相對(duì)分子質(zhì)量皂苷，連接糖基個(gè)數(shù)主要為1～3個(gè)，極個(gè)別連接糖基個(gè)數(shù)為4個(gè)，如人參皂苷Rb₁。進(jìn)入腎臟中的三七皂苷類成分糖基個(gè)數(shù)主要為3～5個(gè)，有較少數(shù)連接糖基個(gè)數(shù)為1～2個(gè)，如人參皂苷F₂，三七皂苷R₁，腎臟中的三七皂苷類成分主要以原型形式存在，但個(gè)別皂苷為取代型皂苷，以取代形式存在，如化合物M6，M7為乙酰基取代皂苷，化合物M17，M19為丙?；〈碥?。這些三七皂苷類成分可能為治療糖尿病視網(wǎng)膜病變和腎病的有效成分。

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[責(zé)任編輯 曹陽(yáng)陽(yáng)]