吳龍飛，羅香文，，劉 勇，，李夢晴，杜 嬌，張德詠，，?

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南省植物保護(hù)研究所，湖南長沙410125）

啶氧菌酯降解菌的分離鑒定及其降解特性

吳龍飛1，羅香文1，2，劉 勇1，2，李夢晴1，杜 嬌2，張德詠1，2，?

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南省植物保護(hù)研究所，湖南長沙410125）

通過富集培養(yǎng)法篩選分離到1株能以啶氧菌酯為唯一碳源的降解菌株P(guān)ID-1，采用形態(tài)學(xué)、生理生化方法，并結(jié)合16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析，將菌株P(guān)ID-1初步鑒定為沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）。菌株P(guān)ID-1降解啶氧菌酯的最佳條件為pH 7和35℃。在該降解條件下，培養(yǎng)5 d，菌株P(guān)ID-1對100 mg·L-1啶氧菌酯的降解率可達(dá)83.54%。將啶氧菌酯經(jīng)PID-1降解后的物質(zhì)經(jīng)質(zhì)譜掃描，通過譜庫檢索，發(fā)現(xiàn)其降解中間產(chǎn)物包括1-（1，5-dimethylhexyl-）-4-methyl-benzene、2，5-bis（1，1-dimethylethyl）-phenol、butyl 2-methyoxyethyl ester、bis（tert-butyldimethylsilyl）ester、1-（3-n-propoxyphenyl）-2-propanone oxime和2-nitro-4-（trifluoromethyl）phenol。

啶氧菌酯；沼澤紅假單胞菌；降解途徑

啶氧菌酯是一種甲氧基丙烯酸酯類廣譜、內(nèi)吸性殺菌劑，在我國2008年獲得臨時登記，主要用于防治麥類葉面病害，如座枝孢屬（Ramulispora）導(dǎo)致的葉斑病等［1］。與現(xiàn)有甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，如嘧菌酯、肟菌酯等相比，啶氧菌酯對座枝孢屬（Septoria）、絲核菌屬（Rhizoctonia）等導(dǎo)致的小麥病害有更強(qiáng)的防治效果［2］。在我國，啶氧菌酯還用于水稻稻曲病等病害的防治［3］。啶氧菌酯的使用范圍和使用量在我國正逐步上升。

推薦劑量的啶氧菌酯在香蕉和土壤中的半衰期分別為10.7～12.1和12.5～13.4 d，若按1.5倍推薦劑量施用，15 d后其在香蕉和土壤中的殘留量為0.686和0.159 mg·kg-1，表明啶氧菌酯的殘留期較長［4］。啶氧菌酯能夠抑制啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的生長［5］，對土壤微生物的呼吸作用及土壤微生物結(jié)構(gòu)具有不可逆轉(zhuǎn)的影響［6］。4倍推薦劑量的啶氧菌酯能夠顯著降低家蠶的全繭量和繭層量［7］，且啶氧菌酯對斑馬魚的急性毒性為高毒，即使低濃度長時間暴露，對斑馬魚亦具有慢性毒性。可以推測，高濃度的啶氧菌酯對非靶標(biāo)生物和環(huán)境具有潛在的毒性風(fēng)險。

以生物修復(fù)（bioremediation）為理論支撐的農(nóng)藥殘留物降解修復(fù)技術(shù)，為降低或清除農(nóng)產(chǎn)品和農(nóng)田生態(tài)環(huán)境中的化學(xué)農(nóng)藥殘留污染物提供了新穎的技術(shù)措施，具有修復(fù)效率高、環(huán)境兼容性好、無二次污染等特點，且修復(fù)成本低，操作簡易，目前是國內(nèi)外去除農(nóng)藥殘留污染研究的熱點技術(shù)之一［8］。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的微生物降解目前僅見少量報道［9］，啶氧菌酯的微生物降解資源篩選及降解機(jī)理研究鮮見報道。為此，特采用富集培養(yǎng)、定向馴化的方法篩選啶氧菌酯降解菌資源，并研究其降解啶氧菌酯的機(jī)制，為啶氧菌酯潛在的殘留污染提供有用微生物資源。

1 材料與方法

1.1 主要培養(yǎng)基

微生物篩選分離培養(yǎng)基（無碳源MM培養(yǎng)基）：（NH4）2SO42.0 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.2 g· L-1，CaCl2·2H2O 0.01 g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 1.5 g·L-1，KH2PO41.5 g· L-1，pH 7.2［10］；選擇培養(yǎng)基：在MM培養(yǎng)基中加入一定濃度的啶氧菌酯；固體培養(yǎng)基：在相應(yīng)液體培養(yǎng)基中添加1.5%瓊脂。

1.2 主要儀器

JEXL-230掃描電子顯微鏡，日本電子公司；Tu-1901分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；6890N/5975氣質(zhì)聯(lián)用儀，Agilent；5810R冷凍高速離心機(jī)，Eppendorf；Mili QA-10純水系統(tǒng)，Millipore；Alpha Imager凝膠成像系統(tǒng)，HP；PGX-150A光照培養(yǎng)箱，北京中聯(lián)科儀科技有限公司。

1.3 降解菌的分離、篩選

將采自不同地區(qū)農(nóng)田排水渠的污泥2.0 g加入120 mL以20 mg·L-1啶氧菌酯作為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基中，置于3 000 lx、35℃光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至渾濁（5～7 d）后，取5 mL菌液加入120 mL以40 mg·L-1啶氧菌酯作為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基中，同等條件下培養(yǎng)；重復(fù)該步驟，直至加入120 mL以100 mg·L-1啶氧菌酯作為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至渾濁。然后，取200 μL培養(yǎng)液涂布到含100 mg·L-1啶氧菌酯的選擇性固體培養(yǎng)基中。挑取菌落形態(tài)不同的菌，分別接種到含啶氧菌酯、甲氰菊酯100 mg·L-1的選擇性液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至渾濁（3～5 d）。采用分光光度計測定菌液濁度，計算菌液的菌落含量（colony forming unit，cfu），調(diào)整菌液的菌落總數(shù)達(dá)到109cfu·mL-1，作為后續(xù)試驗接種液。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 電鏡樣品制備及觀察

將細(xì)菌溶液反復(fù)離心收集沉淀，2.5%戊二醛固定，經(jīng)磷酸緩沖液洗滌，1%鋨酸固定2 h，反復(fù)洗滌離心后梯度酒精脫水，樹脂滲透包埋。經(jīng)60℃烘箱加熱聚合、切片后，掃描電子顯微鏡觀察拍照。

1.4.2 生理生化指標(biāo)測定

參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》［11］檢測篩選細(xì)菌資源的各種生理生化指標(biāo)。

1.4.3 菌體吸收光譜的測定

取1.5 mL培養(yǎng)渾濁的細(xì)菌培養(yǎng)液，8 000 r· min-1離心洗滌3次，用60%蔗醣溶液重懸浮，分光光度計上300～900 nm掃描。

1.4.4 菌體16S rDNA序列的測定

細(xì)菌基因組提取采用UNIQ-10柱式基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），具體操作方法參見使用說明書。以所提的細(xì)菌總DNA為模板，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行序列擴(kuò)增［12］，PCR反應(yīng)體系（總體積50μL）：10×PCR buffer 2.5μL；MgCl22μL；dNTP 1 μL；引物 （27F，agagtttgatcctggctcag；1492R，ggttaccttgttacgactt）各0.5μL；Taq酶（5 U·μL-1）0.5μL；雙蒸水43μL。PCR擴(kuò)增程序為：94℃，4 min；94℃，1 min，50℃，1 min，72℃，1 min，30個循環(huán)；72℃，10 min。PCR反應(yīng)完成后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增片斷。測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行。

測定的16S rDNA序列在GenBank中利用BLAST進(jìn)行比對，比較其序列同源性。利用Mega 5軟件進(jìn)行多序列聯(lián)配，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［13］。

1.5 降解特性測定

1.5.1 啶氧菌酯殘留量

啶氧菌酯殘留量采用 LE-HPLC方法測定［14］。

1.5.2 啶氧菌酯降解途徑

啶氧菌酯降解中間代謝產(chǎn)物采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）鑒定［15］。鑒定條件：全掃描，質(zhì)量范圍50～550 amu；電子轟擊能70 eV；色譜柱HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm），進(jìn)樣口溫度220℃，氦氣流量1.0 mL·min-1。升溫程序：初始溫度120℃，保持3min，以10℃·min-1的速度升溫至200℃，再以5℃·min-1的速度升溫，終止溫度250℃，保持5 min；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 啶氧菌酯降解菌篩選分離

以啶氧菌酯為唯一碳源的MM培養(yǎng)基，經(jīng)過富集培養(yǎng)，培養(yǎng)液逐步渾濁，呈現(xiàn)不同的顏色，表明有不同的微生物能夠利用啶氧菌酯作為唯一碳源進(jìn)行生長。

將富集培養(yǎng)得到的菌液劃線培養(yǎng)，進(jìn)行單胞分離。在固體培養(yǎng)基平板上，得到了不同顏色、不同菌落直徑的菌落。本研究選擇菌落最大的一個紅色菌落，命名為PID-1，進(jìn)行后續(xù)的鑒定及降解特性研究。

2.2 啶氧菌酯降解菌株P(guān)ID-1鑒定

啶氧菌酯降解菌株P(guān)ID-1的掃描電鏡結(jié)果（圖1）表明，菌株P(guān)ID-1的形狀為短桿狀，細(xì)胞大小為（0.3～0.6）μm×（2.5～3.4）μm，以二分裂方式繁殖。

圖1 菌株P(guān)ID-1掃描電鏡圖Fig.1 Morphology of strain PID-1 by scanning electron microscope

生理生化試驗結(jié)果表明，菌株P(guān)ID-1為革蘭氏陰性（G-），H2S反應(yīng)陽性，V.P反應(yīng)陰性，吲哚試驗陽性，甲基紅反應(yīng)陰性，不能利用淀粉，能液化明膠。碳源利用試驗（表1）表明，菌株P(guān)ID-1可以利用多種碳源，其中，酵母膏是最佳碳源；能利用部分醇類化合物如肌醇、丙三醇等進(jìn)行生長，也可利用小分子有機(jī)酸如丙酮酸等生長。

表1 菌株P(guān)ID-1碳源利用試驗結(jié)果Table 1 Carbon utilization capacity of strain PID-1

菌體色素掃描結(jié)果（圖2）表明，在880、820、580和360 nm處有典型的吸收峰，表明菌株P(guān)ID-1菌體含有菌綠素和類胡蘿卜素。化特點，并結(jié)合16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析（圖3），依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》［11］，將菌株P(guān)ID-1初步鑒定為沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）。

圖2 菌株P(guān)ID-1菌體色素吸收光譜Fig.2 Absorption spectrum of pigments of strain PID-1

根據(jù)菌株P(guān)ID-1形態(tài)特征、菌體色素、生理生

2.3 菌株啶氧菌酯降解特性

2.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對菌株降解啶氧菌酯的影響

在pH分別為4、5、6、7、8、9的120 mL MM培養(yǎng)基中，加入100 mg·L-1的啶氧菌酯和0.5%的PID-1菌液，光照培養(yǎng)5 d后取樣，樣品經(jīng)萃取后，采用LE-HPLC方法檢測啶氧菌酯的殘留量。圖4結(jié)果表明，當(dāng)pH值在6～8之間時，菌株P(guān)ID-1降解啶氧菌酯的效能較好，降解啶氧菌酯的最適pH為7，降解效率可達(dá)76.56%。

圖3 菌株P(guān)ID-1 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of 16S rDNA sequence of strain PID-1

圖4 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對菌株P(guān)ID-1降解啶氧菌酯的影響Fig.4 Effects of initial pH of media on picoxystrobin degradation by strain PID-1

2.3.2 發(fā)酵溫度對菌株降解啶氧菌酯的影響

在以100 mg·L-1的啶氧菌酯為碳源的120 mLMM培養(yǎng)基（pH 7）中，接種0.5%的PID-1菌液，不同溫度下（15～55℃）光照培養(yǎng)5 d后，采用LE-HPLC方法測定啶氧菌酯殘留量。圖5表明，當(dāng)溫度為25～45℃時，菌株P(guān)ID-1具有較好的啶氧菌酯降解能力；其中，降解啶氧菌酯的最適溫度為35℃。溫度過高（55℃）或過低（15℃）都會顯著降低菌株P(guān)ID-1降解啶氧菌酯的能力，特別是當(dāng)溫度低于15℃時，菌株P(guān)ID-1降解100 mg·L-1啶氧菌酯的效率僅為19.52%。

圖5 溫度對菌株P(guān)ID-1降解啶氧菌酯的影響Fig.5 Effects of temperature on picoxystrobin degradation by strain PID-1

2.3.3 降解動態(tài)

在以100 mg·L-1的啶氧菌酯為碳源的120 mL MM培養(yǎng)基中，接種0.5%的PID-1菌液，在35℃、初始pH值7條件下進(jìn)行光照培養(yǎng)，定期取樣，采用LE-HPLC方法測定啶氧菌酯殘留量，獲得菌株P(guān)ID-1在最適條件下降解啶氧菌酯的動態(tài)結(jié)果（圖6）。培養(yǎng)液中的啶氧菌酯含量在培養(yǎng)初期（2 d）降低較慢，隨后，啶氧菌酯的含量快速降低，表明菌株對啶氧菌酯的降解率3 d后快速上升。菌株P(guān)ID-1在最適降解條件下，培養(yǎng)5 d，對 100 mg·L-1啶氧菌酯的降解率可達(dá)83.54%。

圖6 菌株P(guān)ID-1降解啶氧菌酯的動態(tài)過程Fig.6 Degradation dynamics of picoxystrobin by strain PID-1

2.4 啶氧菌酯降解機(jī)制

2.4.1 啶氧菌酯降解中間產(chǎn)物

菌株P(guān)ID-1降解啶氧菌酯的質(zhì)譜（mass spectrum）掃描結(jié)果（圖7）表明，隨著培養(yǎng)時間的延長，啶氧菌酯的相對豐度逐步降低；在質(zhì)譜圖上，隨著啶氧菌酯的逐步降解，質(zhì)譜圖上出現(xiàn)一系列的中間代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜峰（3 d），繼續(xù)培養(yǎng)，一些中間代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜峰消失，表明這些中間代謝產(chǎn)物繼續(xù)被降解，但仍有部分代謝產(chǎn)物沒有被降解（5 d）。

圖7 菌株P(guān)ID-1降解啶氧菌酯代謝產(chǎn)物質(zhì)譜掃描圖Fig.7 Mass scanning of degrading metabolics of picoxystrobin by strain PID-1

菌株P(guān)ID-1降解啶氧菌酯的質(zhì)譜（mass spectrum）掃描后，經(jīng)過譜庫檢索，啶氧菌酯的降解中間產(chǎn)物（圖8）包括：1-（1，5-dimethylhexyl-）-4-methyl-benzene，保留時間3.943 min；2，5-bis（1，1-dimethylethyl）-phenol，保留時間6.313 min；butyl 2-methyoxyethyl ester，保留時間8.720 min；bis（tert-butyldimethylsilyl） ester，保留時間 9.330 min；1-（3-n-propoxyphenyl）-2-propanone oxime，保留時間9.339 min；2-nitro-4-（trifluoromethyl）phenol，保留時間10.689 min。

2.4.2 啶氧菌酯降解途徑

根據(jù)菌株P(guān)ID-1降解啶氧菌酯中間代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜檢測分析結(jié)果，推測啶氧菌酯可能的降解途徑如圖9所示，啶氧菌酯的—O—鍵先斷裂，然后苯環(huán)上的側(cè)鏈氧化，還包含有苯環(huán)開環(huán)反應(yīng)等降解步驟。

圖8 菌株P(guān)ID-1降解啶氧菌酯代謝產(chǎn)物Fig.8 Degradation metabolics of picoxystrobin by strain PID-1

圖9 菌株P(guān)ID-1降解啶氧菌酯可能的降解途徑Fig.9 Possible degradation pathway of picoxystrobin by strain PID-1

3 結(jié)論與討論

通過富集培養(yǎng)法篩選分離獲得一株能以啶氧菌酯為唯一碳源的降解菌株P(guān)ID-1，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化方法結(jié)合16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析，將菌株 PID初步鑒定為沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）。菌株 PID-1降解啶氧菌酯的最佳條件為pH 7和35℃，在該降解條件下，培養(yǎng)5 d，菌株P(guān)ID-1對100 mg·L-1啶氧菌酯的降解率可達(dá)83.54%。

菌株 PID-1初步鑒定為沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris），是光合細(xì)菌中重要的細(xì)菌資源之一。在化學(xué)農(nóng)藥及有機(jī)污染物殘留的生物修復(fù)研究中，光合細(xì)菌資源篩選分離及降解特性的研究報道較少，迄今為止，僅有光合細(xì)菌降解有機(jī)磷農(nóng)藥殘留物［16］、硫代磷酸酯類農(nóng)藥殘留物［17］、菊酯類農(nóng)藥殘留物［18］，以及磺酰脲類除草劑殘留物［19］的報道。光合細(xì)菌已被大量研究證實是一種益生菌，具有良好的促進(jìn)作物抗逆性和刺激作物生長的作用［20］，因此，篩選光合細(xì)菌降解菌將具有較好的應(yīng)用潛力。

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留物的微生物降解研究方面，目前僅見的醚菌酯殘留物降解菌資源包括貪銅離菌（Cupriacidu sp.）和產(chǎn)黃桿菌（Rhodanobacter sp.），這2個菌株均能將嘧菌酯完全降解為CO2，同時具有較寬的降解譜，還能降解肟菌酯、唑胺菌酯和醚菌酯［9］。利用芽孢桿菌等多種菌株的復(fù)合微生物還能夠降解多種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑［21］。但啶氧菌酯的微生物降解資源的分離、降解特性及降解機(jī)理等還需開展進(jìn)一步的研究。降解機(jī)理研究表明，微生物降解甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的主要作用基因為甲氧基丙烯酸酯甲基酯酶基因［22］。根據(jù)菌株P(guān)ID-1降解啶氧菌酯中間代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜檢測和分析，推導(dǎo)啶氧菌酯的降解途徑為：啶氧菌酯的—O—鍵先斷裂，然后苯環(huán)上的側(cè)鏈氧化，并包含有苯環(huán)開環(huán)反應(yīng)等降解步驟。

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（責(zé)任編輯 高 峻）

Isolation and degrading characteristics of picoxystrobin degrading strain

WU Long-fei1，LUO Xiang-wen1，2，LIU Yong1，2，LIMeng-qing1，DU Jiao2，ZHANG De-yong1，2，?
（1.College of Plant Protection，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；2.Hunan Plant Protection Institute，Changsha 410125，China）

The strain PID-1 was screened and isolated by enrichment culture，and was primarily identified as Rhodopseudomonas palustris based on morphology，physiological and biochemical characteristics as well as phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences.The optimal degrading conditions of PID-1 were pH 7 and 35℃.Under this condition，up to 83.54%of 100 mg·L-1picoxystrobin could be degraded by PID-1.Themetabolics of picoxystrobin degraed by PID-1 were identified bymass spectrum as 1-（1，5-dimethylhexyl-）-4-methyl-benzene，2，5-bis（1，1-dimethylethyl）-phenol，butyl2-methyoxyethyl ester，bis（tert-butyldimethylsilyl）ester，1-（3-n-propoxyphenyl）-2-propanone oxime and 2-nitro-4-（trifluoromethyl）phenol.

picoxystrobin；Rhodopseudomonas palustris；degrading pathway

X592

A

1004-1524（2016）09-1550-08

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.09.14

2016-04-19

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201203098）；國家自然科學(xué)基金（31272067）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項資金（CARS-25-B-05）

吳龍飛（1990—），男，湖南郴州人，碩士研究生，主要研究方向為農(nóng)田污染物生物修復(fù)。E-mail：wlf814@163.com

?通信作者，張德詠，E-mail：dyzhang78@163.com

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28（9）：1550-1557 http：//www.zjnyxb.cn吳龍飛，羅香文，劉勇，等.啶氧菌酯降解菌的分離鑒定及其降解特性［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，28（9）：1550-1557.