陳萬(wàn)超，楊 焱，李 文，蔣 俊，于海龍，馮 杰，李曉貝，劉 昆

（1.國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海201403；2.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海201306；3.麗水市農(nóng)科院 食藥用菌研究所，浙江 麗水323000）

香菇揮發(fā)性成分SPME-GC-MS分析及特征指紋圖譜的建立

陳萬(wàn)超1，2，楊 焱1，李 文1，蔣 俊3，于海龍1，馮 杰1，李曉貝1，劉 昆3

（1.國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海201403；2.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海201306；3.麗水市農(nóng)科院 食藥用菌研究所，浙江 麗水323000）

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（SPME-GC-MS）對(duì)12個(gè)品種香菇揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，并結(jié)合聚類分析提取出42個(gè)共有香氣特征成分，構(gòu)建成香菇特征指紋圖譜。同時(shí)圖譜信息與樣品共有峰信息進(jìn)行相似性分析，得到其良好可靠性，且可設(shè)定相似度閾值為0.6來(lái)衡量其香氣品質(zhì)，或者甄別與香菇香氣的差異程度；依據(jù)所建圖譜信息，采用主成分分析對(duì)其他食用菌樣品進(jìn)行對(duì)照研究，顯示香菇樣品與其他食用菌樣品均存在明顯差異，表明該特征指紋圖譜可用于香菇香氣的鑒定和監(jiān)控。

香菇；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；指紋圖譜；主成分分析；揮發(fā)性成分

全球香菇（Lentinula edodes）栽培產(chǎn)量?jī)H次于雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）。香菇的人工栽培在我國(guó)已有800多年的歷史［1］。中國(guó)是世界人工栽培香菇的發(fā)祥地，是全球最大的香菇生產(chǎn)與消費(fèi)大國(guó)，并隨著栽培技術(shù)的不斷革新和創(chuàng)新，香菇產(chǎn)量已占到全球香菇總產(chǎn)量的70%以上［1-2］。香菇，不僅富含香菇多糖、香菇嘌呤等活性成分，具備有效調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化、降血脂、降膽甾醇等藥理作用［2］，而且鮮美可口，風(fēng)味獨(dú)特。其具有的濃郁特殊香味，是評(píng)價(jià)香菇品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)之一，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)香菇揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析［3-7］，認(rèn)為一些含硫雜環(huán)化合物是香菇的特征風(fēng)味成分，一些八碳化合物具有蘑菇味，而對(duì)于具體的風(fēng)味特征指紋圖譜的研究并沒(méi)見(jiàn)報(bào)道。

氣味指紋分析技術(shù)是在現(xiàn)代儀器分析技術(shù)不斷進(jìn)步的推動(dòng)下快速發(fā)展起來(lái)的，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水果的香氣成分、肉類風(fēng)味、酒類揮發(fā)性物質(zhì)及香精香料風(fēng)味組分的鑒定［8］。且可采取的儀器手段，如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 （Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）、氣味指紋儀和味覺(jué)指紋儀等，能夠產(chǎn)生氣相色譜指紋圖譜、氣味指紋圖譜和味覺(jué)指紋圖譜，分別給出樣品的結(jié)構(gòu)指紋、氣味指紋和口感指紋信息［9］。其中GC-MS是較為常用的方法之一，而與固相微萃取 （solid phase microextraction，SPME）聯(lián)用具有操作時(shí)間短、樣品量少、無(wú)需萃取溶劑、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)［6-7，10］，可全面準(zhǔn)確分析香菇風(fēng)味組成。根據(jù)分析結(jié)果篩選對(duì)香菇風(fēng)味起決定作用的特征成分，建立其指紋圖譜中的特征指紋信息，采用系統(tǒng)聚類、相似度分析法及主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），構(gòu)建香菇指紋圖譜，可為香菇和香菇產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和品質(zhì)的認(rèn)證，提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

12個(gè)品種香菇（L.edodes）如表1所示，均為目前國(guó)內(nèi)的主栽審定品種。菌種由浙江省麗水市農(nóng)科院食藥用菌研究所提供，栽培地浙江麗水?；覙?shù)花（Grifola frondosa）、猴頭菌（Hericium erinaceus）和雞腿菇（Copyinds comatus）子實(shí)體干品，均購(gòu)自上海百信生物科技有限公司。

表1 香菇菌種Table 1 L.edodes strains

1.2 試劑與儀器

正構(gòu)烷烴混合標(biāo)樣（C7—C30），購(gòu)自上海安譜科學(xué)儀器有限公司；鄰二氯苯（色譜級(jí)），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜級(jí)），購(gòu)自美國(guó)迪馬科技公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SPME萃取裝置，75 μm CAR/PDMS（carbon/ polydimethyl siloxane），美國(guó) Supelco公司制造；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司制造；HWS28型電熱恒溫水浴鍋，DHG-9240A型鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司制造；BF00A粉碎機(jī)，上海淀久機(jī)械制造有限公司制造；Milli-Q超純水設(shè)備，美國(guó)Ultra公司制造。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 香菇的栽培、樣品采樣及預(yù)處理 12個(gè)品種香菇栽培配方（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為木屑79%，麩皮20%，石膏粉1%；開(kāi)始栽培時(shí)間為2013年8月底，由于出菇時(shí)間不同，均采收第二茬香菇作為樣本；按照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY/T 1061-2006香菇等級(jí)規(guī)格》選取特級(jí)鮮香菇，從菌蓋連接處去除菌柄，菌蓋于（50±2）℃烘干至含水量低于質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，將烘干的樣品分別粉碎過(guò)60目篩后置于干燥器中備用。

1.3.2 頂空固相微萃?。⊿PME）香菇揮發(fā)性物質(zhì)精確稱取1.0 g粉粹的香菇干品，裝入15 mL的固相微萃取瓶中，加入5 mL水和10 μL鄰二氯苯（96 mg/L），迅速均勻后密封，將萃取瓶放入55℃恒溫水浴鍋中，待樣品溫度升至55℃時(shí)，將老化的固相微萃取柱頭（75 μm CAR/PDMS）插入萃取瓶中，同時(shí)推出纖維萃取頭，頂空處平衡吸附30 min。吸附后，立即收回萃取頭，同時(shí)將SPME移至GC進(jìn)樣口內(nèi)，在250℃下解析10 min。

1.3.3 GC-MS分析條件 GC-MS型號(hào) Agilent 7890A-5975C，采用 DB-5ms毛細(xì)色譜柱（J&W Scientific Inc，F(xiàn)olsom，CA，USA，30 m×0.25 mm× 0.25 μm），載氣為純度99.999%氦氣，體積流量1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣。進(jìn)樣口溫度220℃，傳輸線溫度280℃。色譜柱升溫方式為程序升溫，起始溫度為50℃（保持1 min），以10℃/min的升溫速度升至280℃（5 min）。質(zhì)譜條件：離子源為EI源，溫度220℃，四級(jí)桿150℃，質(zhì)量掃描范圍35～450 u。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

相似度分析采用Excel 2007軟件處理，聚類分析（clustering）和主成分分析（PCA）采用IBM SPSS Statistic 20.0軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇樣品SPME-GC-MS分析

為了獲取切實(shí)的香菇揮發(fā)性成分，采用內(nèi)標(biāo)物和一系列正構(gòu)烷烴的混合標(biāo)樣作為參照［11］計(jì)算相對(duì)保留指數(shù)（包括相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留面積），對(duì)樣品中各個(gè)峰進(jìn)行定量和定性分析。本實(shí)驗(yàn)各樣品SPME-GC-MS分析譜圖如圖1所示，其選用鄰二氯苯作為內(nèi)標(biāo)物，根據(jù)被測(cè)化合物和內(nèi)標(biāo)物相應(yīng)的色譜峰面積之比來(lái)計(jì)算被測(cè)組分的相對(duì)含量；并將GC-MS結(jié)果導(dǎo)入LECO Chroma TOF軟件，選擇信噪比（S/N）為100，采用NIST11和Wiley譜庫(kù)檢索，色譜保留指數(shù)及人工解析鑒定化合物結(jié)構(gòu)，同時(shí)對(duì)比C7—C30的正構(gòu)烷烴混合物測(cè)定結(jié)果，計(jì)算保留指數(shù)，進(jìn)行定性分析；在色譜峰分析過(guò)程中刪除峰面積低于10 000（濃度過(guò)低）者，由上述條件獲得香菇揮發(fā)性成分的色譜結(jié)構(gòu)。12個(gè)品種香菇樣品中共檢出219種物質(zhì)，包括20種含硫化合物、14種八碳化合物、32種醛類、27種醇類、13種酮類、13種酸類、17種酯類、8種酚類、1種醚類、32種烴類、15種芳香類（包括1個(gè)內(nèi)標(biāo)物）、11種呋喃、8種吡咯、4種吡啶、4種吡嗪。

2.2 不同品種香菇特征香氣物質(zhì)聚類分析

實(shí)驗(yàn)中由于樣品處理等因素會(huì)造成香氣組成和含量的差異，為了排除差異較大的香菇樣品，建立穩(wěn)定的指紋圖譜，從而得到較為標(biāo)準(zhǔn)化的指紋特征圖譜信息。實(shí)驗(yàn)中采用SPME-GC-MS對(duì)香菇揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，將各色譜峰的相對(duì)含量與樣品名稱建立矩陣，利用IBM SPSS Statistic 20.0軟件結(jié)合系統(tǒng)聚類法對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析，剔除差異較大樣品對(duì)指紋信息的影響。聚類分析采用組間聯(lián)接聚類方法，以歐式（Euclidean）距離為量度標(biāo)準(zhǔn)，以Z得分對(duì)變量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理［12］，從而獲得香菇揮發(fā)性成分聚類譜系圖，聚類分析結(jié)果樹(shù)狀圖如圖2所示。

圖1 12個(gè)品種香菇GC-MS色譜圖Fig.1 GC-MS chromatogram of 12 L.edodes.

由圖可以得出，當(dāng)歐氏距離增至17時(shí)，12個(gè)香菇樣品可被劃分為兩大類群，類群I包括申香8號(hào)、申香10號(hào)、武香一號(hào)、868、Cr04、慶科20和939，類群II包括241、605、9015、L135和808。上述兩大類群相似性分布，除808、868和605沒(méi)有報(bào)道外，其他與香菇菌株遺傳親緣關(guān)系的研究結(jié)果［13-15］相類似，進(jìn)一步得出遺傳親緣關(guān)系與化學(xué)成分相似性存在一定關(guān)系，選擇不同親緣距離的香菇菌株能夠囊括更準(zhǔn)確的香菇指紋信息。揮發(fā)性成分聚類圖中申香8號(hào)和申香10號(hào)在最小距離形成兩個(gè)聚類，表示他們之間的相似性最大。同時(shí)由圖可知，從整體上看不存在某個(gè)偏差較大，即被孤立形成一個(gè)類群的情況，因此不存在差異較大樣品，在后續(xù)指紋信息提取時(shí)，12個(gè)樣品揮發(fā)性分析結(jié)果均不會(huì)對(duì)指紋圖譜的構(gòu)建造成較大影響。

圖2 香菇揮發(fā)性成分聚類樹(shù)狀圖Fig.2 Cluster pedigree diagram of active-volatiles of L.edodes

2.3 香菇香氣特征指紋圖譜的建立

香菇香氣是一種復(fù)雜的體系，由許多種物質(zhì)共同作用形成，同時(shí)外界的溫度、濕度等因素都會(huì)對(duì)其產(chǎn)生一定的影響。香菇在烘干過(guò)程中，會(huì)導(dǎo)致氨基酸和肽類的熱解、糖和氨基酸或者肽類的相互作用等，這些復(fù)雜反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生大量揮發(fā)性成分，從而影響香菇香氣呈現(xiàn)。Caporaso等［16］研究發(fā)現(xiàn)，短鏈脂肪醛（C5—C9）具有特殊的香氣，如己醛具有生油脂味，庚醛具有堅(jiān)果味和水果青香，辛醛具有青果皮香等。通過(guò)提取香菇共有的成分，能夠得到包含體現(xiàn)香菇香氣特征的重要成分。

對(duì)揮發(fā)性成分分析結(jié)果作進(jìn)一步分析，測(cè)定結(jié)果3 min前峰型干擾較為明顯，因此剔除低保留指數(shù)（RI＜900）成分，同時(shí)剔除對(duì)香氣一般沒(méi)有貢獻(xiàn)的烷烴［17］，但保留3種含硫雜環(huán)化合物（1，2，4-三硫雜環(huán)戊烷；1，2，4，5-四硫雜環(huán)己烷和1，2，4，5，7-五硫雜環(huán)庚烷）。因?yàn)楹蚧衔锸窍愎较銡獾闹匾M分［5-7，18］，從而提取樣品中剩余共有色譜峰，建立標(biāo)準(zhǔn)化香氣特征指紋圖譜，如表2和圖3所示。從12個(gè)香菇品種中共提取出42種共有成分，7種八碳化合物、8種含硫化合物、16種醛類、5種醇類、2種酸類、2種酮類、1種吡啶和1種呋喃，所確定的以上成分可作為香菇特征香氣的判別及其質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要依據(jù)。

表2 香菇特征香氣活性物質(zhì)指紋圖譜信息Table 2 Information of chromatographic fingerprint of active-odor compounds of L.edodes

續(xù)表2

2.4 香菇特征香氣指紋信息相似度評(píng)價(jià)

指紋圖譜相似度是指紋圖譜信息的整體相關(guān)性，常用相關(guān)系數(shù) （Correlation）、余弦?jiàn)A角（Angle cosine）等計(jì)算方法［12，19-20］進(jìn)行分析。為確保所構(gòu)建指紋信息的可靠性，優(yōu)先考慮構(gòu)建樣品指紋信息的相似度情況。將所選12個(gè)香菇品種樣品共有色譜峰的相對(duì)含量與構(gòu)建的指紋譜圖信息（表2）做相似度分析，如圖4所示，相關(guān)系數(shù)位于0.57～0.98（＞0.5）之間，余弦?jiàn)A角位于0.63～0.98之間，說(shuō)明12個(gè)樣品共有峰與指紋圖譜信息相似性較好，所構(gòu)建的香氣特征指紋圖譜信息具有可靠性。在實(shí)際應(yīng)用中，待測(cè)樣品與指紋圖譜信息的相似度應(yīng)存在某個(gè)閾值來(lái)衡量其香氣品質(zhì)或者甄別與香菇香氣的差異程度，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得到一個(gè)合適的閾值0.6作為這個(gè)衡量標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 3種其他食用菌與香菇樣品主成分分析

主成分分析 （Principal component analysis，PCA）是一種較為經(jīng)典的特征抽取和降維技術(shù)，可用于大量數(shù)據(jù)的簡(jiǎn)化及優(yōu)化處理，快速實(shí)現(xiàn)模式或者關(guān)系的可視化識(shí)別［12］。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)所構(gòu)建的香菇特征指紋信息數(shù)據(jù)（表2），分別對(duì)3種其他食用菌（灰樹(shù)花、猴頭菌和雞腿菇）和12個(gè)品種香菇進(jìn)行分析，采用SPSS軟件中因子分析進(jìn)行PCA分析，如圖5所示，以42種香菇共有香氣物質(zhì)為分類變量，對(duì)12個(gè)香菇樣品和3個(gè)其他食用菌樣品進(jìn)行分類，其中香菇樣品和其他食用菌樣品聚集在不同位置，說(shuō)明其間存在明顯差異。

同時(shí)PCA分析中主成分1（48.76%）、主成分2（23.81%）和主成分3（15.14%）累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為87.71%（＞85%），能夠反映樣本原始數(shù)據(jù)的大部分信息，表示通過(guò)PCA分析能較好地區(qū)分香菇和其他食用菌，整體上利用所構(gòu)建的指紋圖譜信息，可以使香菇的特征得以呈現(xiàn)。

圖3 香菇揮發(fā)性成分GC-MS指紋圖譜Fig.3 GC-MS fingerprint of volatiles of L.edodes

圖4 不同品種香菇樣品相似度分析Fig.4 Results of similarity among different strains of L.edodes samples

圖5 香菇樣品與其他食用菌樣品PCA分析Fig.5 PCA plot of the 12 L.edodes samples and 3 other mushroom samples

3 結(jié)語(yǔ)

以12個(gè)國(guó)內(nèi)審定的香菇品種栽培子實(shí)體干燥樣本為基礎(chǔ)，采用SPME-GC-MS分析技術(shù)測(cè)定香菇揮發(fā)性成分，共檢測(cè)出219種化合物。對(duì)品種和各化合物相對(duì)含量進(jìn)行聚類分析，不存在偏差較大樣品，且相似性分布與其遺傳親緣關(guān)系類似，因此12個(gè)品種數(shù)據(jù)均可采用，且選擇不同親緣距離的香菇菌株能夠囊括更準(zhǔn)確的香菇指紋信息。

根據(jù)所得的揮發(fā)性成分構(gòu)建了能夠反映香菇香氣特征的指紋圖譜信息，提取具有一定香氣特征的共有峰42個(gè)，其中含7種八碳化合物、8種含硫化合物、16種醛類、5種醇類、2種酸類、2種酮類、1種吡啶和1種呋喃，其中八碳化合物（如1-辛烯-3-醇、2-辛醇等）、8種含硫化合物（如1，2，4-三硫雜環(huán)戊烷、二甲基二硫醚、二甲基三硫醚等）分別為食用菌和香菇特征物質(zhì)。12個(gè)品種上述共有峰相似度分析結(jié)果較好，同時(shí)與其他種類食用菌進(jìn)行主成分分析，能較好地區(qū)別香菇與其它種類的食用菌，驗(yàn)證了所構(gòu)建的香氣特征指紋圖譜信息具有可靠性和準(zhǔn)確性，且可通過(guò)設(shè)定相似度閾值0.6來(lái)衡量其香氣品質(zhì)，甄別香菇風(fēng)味與其他食用菌的差異程度。

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Analysis of Volatile Components in Lentinula edodes by SPME-GC-MS and Establishment of Fingerprint

CHEN Wanchao1，2，YANG Yan*1，LI Wen1，JIANG Jun3，YU Hailong1，F(xiàn)ENG Jie1，LI Xiaobei1，LIU Kun3
（1.National Engineering Research Center of Edible Fungi，Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization（South），Ministry of Agriculture，the People's Republic of China；Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of Agricultural Science，Shanghai 201403，China；2.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；3.Institute of Edible and Medical Fungi，Lishui Academy of Agricultural Science，Lishui 32300，China.）

Volatile components in 12 Lentinula edodes species were analyzed by headspace solid phase micro extraction-gas chromatography-mass spectrometry（SPME-GC-MS），and 42 common aroma components were extracted according to the results of clustering analysis to construct the L. edodes characteristic fingerprints.At the same time，the similarity analysis between fingerprint information and sample common component information was performed，the results turned out to be its good reliability.Furthermore，the similarity threshold can be set as 0.6 to measure the quality of its aroma or the degree of difference from L.edodes odor.Based on the characteristic fingerprints information，samples were compared to other edible fungi by principal component analysis（PCA），and the results showed that the odors between L.edodes and other edible fungi were significantly different，indicating that the aroma characteristic fingerprint can be used to identify and monitor L. edodes aroma.

Lentinula edodes，SPME-GC-MS，fingerprint，principal component analysis（PCA），volatile components

TS 201.2

A

1673—1689（2016）010—1074—07

2015-01-04

上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字（2013）第6—10號(hào)）。

*通信作者：楊 焱（1970—），女，新疆烏魯木齊人，工學(xué)博士，研究員，主要從事食藥用真菌研究。E-mail：yangyan@saas.sh.cn