徐桂新，張轉(zhuǎn)平，譚華森

(安康市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，安康 725000)

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HPLC法測定葛花中大豆苷和染料木苷的含量

徐桂新，張轉(zhuǎn)平，譚華森

(安康市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，安康 725000)

目的 建立HPLC法測定葛花中大豆苷、染料木苷的含量。方法 采用C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-1.0 mL·L-1磷酸溶液(15∶85)；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為260 nm；柱溫為30 ℃。結(jié)果 大豆苷回歸方程為Y=166 989.8X-1 438.6，r=0.999 9，大豆苷在0.206～1.032 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；染料木苷回歸方程為Y=142 567X+2 543.1，r=0.999 7，染料木苷在0.204～1.018 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)論 該方法簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可作為葛花的質(zhì)量評價依據(jù)。

葛花；大豆苷；染料木苷；HPLC

A.stract:Objective To establish an HPLC method for the determination of the content for daidzin， genistin glycosides in the flower of kudzuvine. Methods C18column (250 mm×4.6 mm，5 μm) was used with acetonitrile-1 mL·L-1phosphoric acid (15∶85) as the mobile phase；the flow rate was 1.0 mL·min-1，the detection wavelength was 260 nm，and the column temperature was 30 ℃. Results Daidzin regression equation wasY=166 989.8X-1 438.6，r=0.999 9，indicated that daidzin injection amount between 0.206-1.032 μg had good linear relationship；genistein glycosides regression equation wasY=142 567X+2 543.1，r=0.999 7，showed that genistein glycosides injection amount between 0.204-1.018 μg had good linear relationship. Conclusion The method is simple，accurate，reproducible，and can be used as a quality assessment method for the flower of kudzuvine.

葛花為豆科植物葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥花?，F(xiàn)代研究表明，葛花中含有黃酮、皂苷、揮發(fā)油等成分，具有保肝、解酒、保護(hù)心肌、降血糖、降血脂等藥理活性[1-3]。其中黃酮類成分有延緩女性衰老、改善更年期癥狀、預(yù)防癌癥及心血管疾病等功效[4-6]。筆者以大豆苷、染料木苷[7]為指標(biāo)性成分進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取得了較為滿意的結(jié)果，所建立的方法操作簡便、快速，重復(fù)性好，可作為葛花的質(zhì)量評價依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；LC Solution色譜工作站；KQ-250D超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯有限公司)。

1.2 試藥 大豆苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號11738-200501)；染料木苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號111709-200501)；乙腈、甲醇均為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Kromasil ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-1.0 mL·L-1磷酸溶液(15∶85)；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為260 nm；柱溫為30 ℃。在上述色譜條件下，樣品中2種成分與其他組分分度較好，結(jié)果見圖1。

圖1 HPLC圖

A.大豆苷對照品；B.混合對照品；C.葛花樣品；1.大豆苷；2.染料木苷

Fig.1 HPLC chromatograms

A. daidzin solution；B. daidzin and genistin glycosides mixture solution； C.flower of kudzuvine solution；1.daidzin；2.genistin glycosides

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取大豆苷、染料木苷對照品適量，加甲醇制成1 mL約含0.05 mg的混合溶液，即得。

2.3 供試品提取條件考察和制備

2.3.1 提取溶劑的選擇 取同一樣品適量，精密稱定，加入體積分?jǐn)?shù)分別為30%的甲醇、50%的甲醇、80%的甲醇和甲醇20 mL，加熱回流30 min，回流的樣品取續(xù)濾液測定含量，結(jié)果見表1。從測定結(jié)果看，體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇提取效果最佳，故選用體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇為提取溶劑。

表1 不同提取溶劑的測定結(jié)果

Tab.1 The determination results of different solvents

質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%30%甲醇50%甲醇80%甲醇甲醇大豆苷0.0830.0900.1130.1100.0750.0810.1060.092染料木苷0.0720.0800.0980.0900.0680.0760.090 0.084

2.3.2 供試品溶液的制備 取葛花粉末(過三號篩)約1 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取2.2項(xiàng)下的大豆苷、染料木苷混合對照品溶液(大豆苷和染料木苷質(zhì)量濃度分別為0.051 6 g·L-1和0.050 9 g·L-1)，分別精密吸取4，8，12，16和20 μL，進(jìn)樣，在相同條件下進(jìn)行測定，以峰面積(Y)對進(jìn)樣量(X)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算。大豆苷回歸方程為Y=166 989.8X-1 438.6，r=0.999 9，表明大豆苷在0.206～1.032 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；染料木苷回歸方程為Y=142 567X+2 543.1，r=0.999 7，表明染料木苷在0.204～1.018 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取上述對照品溶液10 μL，按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測定。大豆苷峰面積RSD值為1.02%；染料木苷峰面積RSD值為1.65%。2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一樣品，按照供試品溶液制備方法平行制備5份，依法測定含量。測定結(jié)果顯示，大豆苷峰面積RSD值為2.18%，染料木苷峰面積RSD值為2.06%。結(jié)果表明重復(fù)性較好。

2.7 回收率實(shí)驗(yàn) 取同一樣品6份，分別加入大豆苷1.05 mg、染料木苷對照品0.98 mg，按照供試品溶液制備方法進(jìn)行處理后，依法測定含量，計算回收率。大豆苷平均回收率為98.27%，RSD值為2.33%；染料木苷平均回收率為99.18%，RSD值為1.51%。結(jié)果見表2～3。2.8 含量測定 分別精密吸取上述對照品溶液及供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣，測定峰面積，計算大豆苷、染料木苷的含量，結(jié)果見表4。

表2 大豆苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)

Tab.2 Daidzein sample recovery rate test

取樣量/g樣品中大豆苷的含量/mg對照品加入量/mg測出量/mg回收率/%平均回收率/%1.03271.2601.052.30699.698.271.00241.2211.052.295102.31.11261.3551.052.37997.51.07261.3061.052.32396.91.04621.2741.052.29597.21.07681.3121.052.32196.1

表3 染料木苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)

Tab.3 Genistin glycosides sample recovery rate test

取樣量/g樣品中染料木苷的含量/mg對照品加入量/mg測出量/mg回收率/%平均回收率/%1.03271.0330.982.00599.299.181.00241.0020.981.998101.61.11261.1130.982.07598.21.07261.0730.982.054100.11.04621.0460.982.01298.61.07681.0770.982.03297.4

表4 葛花中大豆苷、染料木苷的測定結(jié)果

Tab.4 Daidzein and genistein glycosides determination result in the flower of kudzuvine

產(chǎn)地送樣時間大豆苷/%染料木苷/%鎮(zhèn)坪2010-09-150.1220.100鎮(zhèn)坪2010-09-200.1020.088平利2010-11-020.1230.111平利2010-11-050.2070.134旬陽2010-11-080.0580.047

3 討論

3.1 溶劑的選擇 不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇對葛花異黃酮的提取有明顯影響，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，用體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇提取測定結(jié)果略高于其他溶劑，故采用體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇為提取溶劑。

3.2 流動相的選擇 分別用甲醇-水(30∶70)和乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液(15∶85)為流動相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)后者圖譜中峰分離效果及峰形均優(yōu)于前者，故選用乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液(15∶85)為流動相。

3.3 結(jié)果分析 從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，各樣品中大豆苷、染料木苷的含量均有差異，可能與生長環(huán)境及采收時期有關(guān)，因葛花花期較短(10 d左右)，采收時間有待進(jìn)一步考察。本文所建立的方法操作簡便、快速，重復(fù)性好，可作為葛花的質(zhì)量評價依據(jù)。

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Determination of daidzin and genistin glycosides in the flower of kudzuvine by HPLC

XU Guixin，ZHANG Zhuanping，TAN Huasen

(Ankang Inspection and Testing Center of Food and Drug，Ankang 725000，China)

flower of kudzuvine；daidzin；genistin glycosides；HPLC

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.006

R927.2

A

1004-2407(2016)06-0571-03

2016-03-21)