孔 燕，陳 偉，江國榮*

(1.徐州市中醫(yī)院，徐州 221009;2.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院,蘇州市吳門醫(yī)派研究院，蘇州 215009)

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高效液相色譜法測(cè)定白駁丸中4種重樓皂苷含量

孔 燕1，陳 偉2，江國榮2*

(1.徐州市中醫(yī)院，徐州 221009;2.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院,蘇州市吳門醫(yī)派研究院，蘇州 215009)

目的 建立高效液相色譜法測(cè)定白駁丸中4種重樓皂苷的含量。方法 采用Agilent Zorbax SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫35 ℃；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水，進(jìn)行梯度洗脫；流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長203 nm。結(jié)果 4種重樓皂苷質(zhì)量濃度在18.12～465.9 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(r=0.999 9)；平均回收率在95.11%～99.74%之間；RSD值均小于3.0%。結(jié)論 該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好、具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可用于白駁丸的質(zhì)量控制。

重樓皂苷；白駁丸；高效液相色譜法；含量測(cè)定

A.stract:Objective To establish an HPLC method for simultaneously determining the contents of 4 polyphyllins in Baibo Pills. Methods HPLC system consisted of Agilent Zorbax SB C18Column， gradient eluted with acetonitrile-water solution， the flow rate of the mobile phase was 1.0 mL·min-1， UV detection wavelength was set at 203 nm and column temperature was maintained at 35 ℃.Results 4 polyphyllins showed good linearity within the tested concentration scope(18.12-465.9 μg·mL-1，r=0.999 9)；the method was validated and the recoveries of 4 polyphyllins were 95.11%～99.74%；RSD<3.0%. Conclusion This method is simple， accurate and reproducible，and can be used for the quality control for Baibo Pills.

白駁丸為徐州市中醫(yī)院皮膚科常用制劑，具有補(bǔ)腎健脾、養(yǎng)血通絡(luò)、祛風(fēng)退斑的作用；已在臨床使用多年，對(duì)白癜風(fēng)、脂溢性脫發(fā)有顯著的療效。白駁丸組方藥味較多，主要由重樓等中草藥復(fù)方組成， 成分比較復(fù)雜。重樓為百合科植物云南重樓ParispolyphyllaSmith var．yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz. 或七葉一枝花ParispolyphyllaSmith var．chinensis(Franch.)Hara 的干燥根莖[1-2]；味苦，微寒，有小毒；歸肝經(jīng)；清熱解毒，消腫止痛，涼肝定驚，主要用于療瘡癰腫[3]，是一種臨床常用的皮膚科用藥。重樓主含甾體皂苷類成分，約占化合物總含量的80%[4]。

為有效監(jiān)測(cè)該制劑的產(chǎn)品質(zhì)量，本研究采用高效液相色譜法測(cè)定重樓中4種皂苷含量，所得定性、定量分析方法可客觀地反映本制劑的內(nèi)在品質(zhì)，為白駁丸的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)指標(biāo)提供了理論依據(jù)[5-7]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Waters e2695-2998，PDA檢測(cè)器，Empower 3色譜工作站)；Agilent Zorbax SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；電子天平(Sartorius公司， BP115D，d=0.1 mg)；高速離心機(jī)(美國Thermo公司)；超聲波清洗儀(KQ-400GKDV，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 甲醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)；乙腈(Sigma-Aldrich公司，色譜純)；去離子水(Milli-Q超純水機(jī)制備，美國Millipore公司生產(chǎn))。4種重樓皂苷對(duì)照品：重樓皂苷Ⅰ(批號(hào)201103)、重樓皂苷Ⅱ(批號(hào)201103)、重樓皂苷Ⅵ(批號(hào)201203)和重樓皂苷Ⅶ(批號(hào)201303)，均購自中國食品藥品檢定研究院。9批白駁丸，批號(hào)：150322，150418，150605，150703，150812，150917，151008，20151123，151212，均由徐州市中醫(yī)醫(yī)院制劑部生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Agilent Zorbax SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為35 ℃；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水，梯度洗脫[8-9]:0～40 min A 30%～60%,40～50 min A 60%～30%;流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長為203 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別取4種重樓皂苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成1 mL分別含重樓皂苷Ⅰ0.39 mg、重樓皂苷Ⅱ0.36 mg、重樓皂苷Ⅵ 0.47 mg和重樓皂苷Ⅶ 0.39 mg的混合溶液，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取白駁丸適量，研細(xì)，混勻，精密稱取1 g，置于25 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲30 min，放冷，用甲醇定容至刻度，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 空白溶液 以相應(yīng)的溶劑為空白溶液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白溶液各10 μL，按照2.1項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè)，4種重樓皂苷色譜峰分離度良好，空白無干擾，色譜圖見圖1。重樓皂苷Ⅶ對(duì)照品峰的理論板數(shù)為63 966，主峰和雜質(zhì)分離良好，分離度為14.8，拖尾因子0.87。

圖1 HPLC圖

A.空白；B.對(duì)照品；C.白駁丸樣品20150605；1.重樓皂苷Ⅵ；2.重樓皂苷Ⅶ；3.重樓皂苷Ⅱ；4.重樓皂苷Ⅰ

Fig.1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系 精密吸取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0和2.0 mL，分別置于2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，進(jìn)樣10 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。分別以重樓皂苷質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。將上述對(duì)照品溶液再稀釋后進(jìn)樣，根據(jù)峰高以信噪比S/N=3確定檢出下限，S/N=10確定定量下限。結(jié)果見表1。

表1 4種重樓皂苷線性關(guān)系

Tab.1 The linearity relationship of 4 polyphyllins

對(duì)照品回歸方程r線性范圍/μg·mL-1檢出下限(S/N3∶1)/μg·mL-1定量下限(S/N10∶1)/μg·mL-1重樓皂苷ⅠY=6847X-348650.999919.71～394.26.5719.71重樓皂苷ⅡY=5926X-247030.999918.12～362.46.0418.12重樓皂苷ⅥY=4808X-272920.999923.30～465.97.76623.30重樓皂苷ⅦY=9859X-414340.999919.33～386.66.44319.33

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)20150605樣品的供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算4種重樓皂苷進(jìn)樣精密度，重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ和重樓皂苷Ⅶ 的RSD值分別為1.76%,1.22%，0.89%和1.04%，說明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)20150605樣品的供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0，4，6，8，12和24h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算4種重樓皂苷的穩(wěn)定性，重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ和重樓皂苷Ⅶ的RSD值分別為1.11%，1.26%，1.89%和0.98%，說明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取批號(hào)20150605樣品6份，每份1g，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算4種重樓皂苷含量，其RSD值在0.77%～1.54%之間，說明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已測(cè)得含量的批號(hào)為20150605的樣品6份，各0.5g，分別置于25mL量瓶中，精密加入2.2.1項(xiàng)下混合重樓皂苷對(duì)照品溶液2.0mL，加甲醇適量，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率和RSD值，結(jié)果見表2。

表2 4種重樓皂苷加樣回收率

Tab.2 The recovery of 4 polyphyllins(n=6)

2.9 樣品測(cè)定 取白駁丸樣品9批，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定4種重樓皂苷含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果

Tab.3 The results of content of 4 polyphyllins in Baibo Pills(mg·g-1)

3 討論

白駁丸是筆者所在醫(yī)院的臨床常用藥，主要由蒺藜、紅花和重樓等中藥組方而成。目前尚未制定對(duì)該制劑快速有效的質(zhì)量控制方法。重樓是白駁丸中有小毒的主要藥材，選定重樓中的主要成分進(jìn)行含量測(cè)定，并建立穩(wěn)定可靠的質(zhì)量控制方法比較符合制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究思路。

由于中藥復(fù)方中成分眾多，等度洗脫難以充分分離，所以采用梯度洗脫的方法。選用AgilentZorbaxSBC18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，采用梯度洗脫方法，比較了不同流動(dòng)相系統(tǒng)乙腈水溶液、甲醇水、乙腈醋酸水溶液。結(jié)果表明，乙腈水溶液系統(tǒng)優(yōu)于其他流動(dòng)相系統(tǒng)，故選用乙腈水溶液流動(dòng)相系統(tǒng)作為本制劑指紋圖譜流動(dòng)相系統(tǒng)。

對(duì)樣品處理方法進(jìn)行比較。采用甲醇與水超聲提取，比較了甲醇的不同體積分?jǐn)?shù)(20%，40%，50%，60%，70%，80%，90%和100%)、不同提取方法(超聲、加熱回流、浸漬等)以及不同超聲時(shí)間(5，10，15，20，30，40，50和60min)。結(jié)果表明，甲醇優(yōu)于水；對(duì)不同提取方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，超聲提取峰面積大、時(shí)間短；對(duì)不同超聲時(shí)間進(jìn)行比較，結(jié)果表明，甲醇超聲30min以后，重樓4種皂苷各個(gè)峰的面積不增加。綜合上述各因素，選擇體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇超聲30min。

對(duì)不同柱溫與流速進(jìn)行比較，柱溫超過或低于35 ℃，色譜峰分離度?。涣魉俑哂诨虻陀?.0mL·min-1，色譜峰分離度差。因此，選擇便于控制的柱溫35 ℃與流速1.0mL·min-1。

本文建立了重樓4種皂苷含量測(cè)定方法，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均符合要求。上述方法為制定白駁丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)。

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Content determination of 4 polyphyllin in Baibo Pills by HPLC

KONG Yan1，CHEN Wei2，JIANG Guorong2*

(1.Xuzhou Hospital of Chinese Medicine，Xuzhou 221009，China；2.Suzhou Hospital of Chinese Medicine，Suzhou Academy of Wumen Chinese Medicine，Suzhou 215009，China)

polyphyllin；Baibo Pills；HPLC；content determination

reference substances；C.Baibo Pills；1.polyphyllinⅥ；2.polyphylli Ⅶ；3.polyphyllinⅡ；4.polyphyllinⅠ

國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(編號(hào)：81303276)

孔燕，女，副主任中藥師

*通信作者：江國榮，男，主任中藥師

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.008

R927.2

A

1004-2407(2016)06-0578-03

2016-05-25)