韓寧娟，杜 瑋，常 春，傅 強(qiáng)*

(1.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061；2.西安培華學(xué)院，西安 710125)

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·藥物分析·

食品中β2受體激動(dòng)劑快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

韓寧娟1,2，杜 瑋1，常 春1，傅 強(qiáng)1*

(1.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061；2.西安培華學(xué)院，西安 710125)

目的 以4種β2受體激動(dòng)劑為研究對(duì)象，建立薄層色譜法用于食品中非法添加的鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。方法 考察不同固定相與展開(kāi)劑，不同檢測(cè)方式對(duì)食品中β2受體激動(dòng)劑薄層色譜行為的影響并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果 以硅膠HPGF254為薄層色譜的固定相，以異丙醇-環(huán)己烷-甲酸(13∶10∶1)為展開(kāi)劑，碘蒸氣熏蒸后，在紫外光燈254 nm下檢測(cè)4種β2受體激動(dòng)劑鑒別特征明顯，內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)干擾。結(jié)論 該方法靈敏度高，專屬性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，可快速檢測(cè)出食品中非法添加的鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林4種β2受體激動(dòng)劑。

β2受體激動(dòng)劑；快速分析；薄層色譜法

A.stract:Objective To develop a TLC method for rapid detection of 4 kinds ofβ2agonists illegal additives (clenbuterol hydrochloride，ractopamine，salbutamol，and terbutaline sulfate) in food. Methods The TLC conditions， such as the stationary phase， the mobile phase and the different detection methods were investigated. And the established TLC method was validated for the real sample analysis. Results The optimal conditions were as follows: high performance silica gel HPGF254as the stationary phase， alcohol-cyclohexane-formic acid (13∶10∶1) as the mobile phase. After developed and colorized with iodine vapor，the coloration spots of the 4 kinds ofβ2agonists were obvious and no internal interference was observed under 254 nm wavelength. The developed method was sensitive and specific. Conclusion The established method is simple and accurate， and could be used for the rapid detection of the 4 kinds ofβ2agonists in food.

β2受體激動(dòng)劑是一類結(jié)構(gòu)和功能都類似腎上腺素的苯乙胺類衍生物[1]，臨床上可用于擴(kuò)張支氣管和增加肺通氣量，治療支氣管哮喘、平滑肌痙攣和休克等癥[2]，具有脂肪再分配作用。然而，不法商販將其添加于喂養(yǎng)動(dòng)物的飼料中，以提高瘦肉產(chǎn)率，從中牟取暴利，這類肉制品或內(nèi)臟被人食用后會(huì)在體內(nèi)蓄積，產(chǎn)生心悸、四肢肌肉顫動(dòng)、心律失常等不良反應(yīng)[3]。因此，建立食品中這4種β2受體激動(dòng)劑的檢測(cè)方法具有重要意義。

目前，有文獻(xiàn)報(bào)道檢測(cè)食品中這4種β2受體激動(dòng)劑主要采用的方法有高效液相色譜法[4-6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8]、毛細(xì)管電泳法[9]和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法[10]等，這些方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)，但分析成本高，儀器價(jià)格及日常維護(hù)費(fèi)用昂貴，需要專門的儀器和專業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，不能進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)操作。酶聯(lián)免疫分析法具有靈敏度高、簡(jiǎn)便、快捷等特點(diǎn)，但存在假陽(yáng)性和單一性問(wèn)題，不能滿足多殘留分析的要求[11]。為實(shí)現(xiàn)快速篩選食品中這4種β2受體激動(dòng)劑，在已有報(bào)道的基礎(chǔ)上[12]，本實(shí)驗(yàn)建立了薄層色譜法用于食品中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林的快速檢測(cè)，該方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，可用于食品中非法添加的鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林的現(xiàn)場(chǎng)快速分析。

1 儀器與材料

1.1 儀器 KH5200數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；FA2004電子分析天平(上海精科天平有限公司)；KHB單道可調(diào)移液器(大龍醫(yī)療設(shè)備(上海)有限公司)；MTN-2800W氮?dú)鉂饪s裝置(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；SK-1快速混勻器(江蘇鹽城市華康科學(xué)儀器廠)；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；微量點(diǎn)樣器(寧波市鎮(zhèn)海玻璃儀器廠)。

1.2 材料 雙槽展開(kāi)缸(20 cm×20 cm)；薄層板(10 cm×20 cm)；薄層板(20 cm×20 cm)；毛細(xì)管(φ0.3 mm)；硅膠G板、硅膠GF254板(青島海洋化工廠)；硅膠HPGF254板(煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.3 試藥 鹽酸克倫特羅(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)C11668550)；萊克多巴胺(武漢剛正生物科技公司，批號(hào)20071020)；沙丁胺醇(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100204-201103)；硫酸特布他林(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)C17295000)。薄層層析硅膠H、硅膠G、硅膠GF254(化學(xué)純，青島海洋化工有限公司)；甲醇、氨水、異丙醇、環(huán)己烷、甲酸、醋酸、乙酸乙酯(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠)。

1.4 樣品 2批豬肉和2批羊肉分別購(gòu)于西安市不同農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別稱取鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林對(duì)照品各10 mg，精密稱定，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別稱取鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林對(duì)照品各10 mg，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取豬肉或羊肉樣品2 g，精密稱定，加生理鹽水4 mL勻漿，并精密吸取上述對(duì)照品溶液100 μL，加入到勻漿液中，超聲分散后加8 mL乙腈沉淀蛋白，以10 000 r·min-1離心10 min，上清液再以12 000 r·min-1離心10 min，氮?dú)獯蹈?，?00 μL甲醇溶解，得到不同質(zhì)量濃度不同類型的生物模擬樣品溶液，同法制備空白溶液和樣品溶液。

2.4 顯色與觀察 碘蒸氣熏蒸后，在紫外光燈254 nm處觀測(cè)。

2.5 薄層色譜條件考察

2.5.1 不同固定相考察 分別吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于硅膠G、硅膠GF254和高效硅膠GF254不同類型的薄層板上，以異丙醇-環(huán)己烷-甲酸(13∶10∶1)為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，在碘蒸氣中熏蒸至斑點(diǎn)清晰，置于紫外光燈254 nm處檢視，比較斑點(diǎn)清晰度和分離度，結(jié)果高效硅膠GF254板分離效果較好，重復(fù)性較好。

2.5.2 展開(kāi)劑的選擇 配制乙酸乙酯-甲醇-醋酸(8∶1∶0.8)，濃氨溶液-水-異丙醇(4∶16∶5)，異丙醇-環(huán)己烷-甲酸(13∶10∶1)等混合溶液，將鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林對(duì)照品溶液和混合對(duì)照品溶液在同一薄層板(10 cm×20 cm)上點(diǎn)樣，分別以上述這3種混合溶液作為展開(kāi)劑，在展開(kāi)缸里展開(kāi)，取出，晾干，在碘蒸氣下熏蒸后,置于紫外光燈254 nm處檢視，結(jié)果見(jiàn)圖1。記錄Rf值，并照相記錄，展開(kāi)效果最好的展開(kāi)系統(tǒng)是異丙醇-環(huán)己烷-甲酸(13∶10∶1)，在此條件下各個(gè)斑點(diǎn)可清晰分離。

圖1 不同展開(kāi)系統(tǒng)薄層色譜圖

A.乙酸乙酯-甲醇-醋酸(8∶1∶0.8)； B. 濃氨溶液-水-異丙醇(4∶16∶5)； C.異丙醇-環(huán)己烷-甲酸(13∶10∶1)；

1.鹽酸克倫特羅；2.萊克多巴胺；3.沙丁胺醇；4.硫酸特布他林；5.混合對(duì)照品溶液

Fig.1 TLC chromatograms of different developing systems

A. ethyl acetate-methanol-acetic acid (8∶1∶0.8)； B. concentrated ammonia solution-water-isopropyl alcohol (4∶16∶5)； C. isopropyl alcohol-cyclohexane-formic acid (13∶10∶1)；

1.clenbuterol hydrochloride；2.ractopamine；3.salbutamol；4.terbutaline sulfate；5.the mixed standard solution

2.5.3 點(diǎn)樣量的選擇 依次取對(duì)照品溶液2，3，4，5和6 μL，點(diǎn)于同一薄層板上，以異丙醇-環(huán)己烷-甲酸(13∶10∶1)作為展開(kāi)劑在展開(kāi)缸里展開(kāi)，取出，晾干，在紫外光燈254 nm處檢視，根據(jù)斑點(diǎn)顏色的分離度確定最佳點(diǎn)樣量為5 μL。

2.5.4 不同檢視方式的考察 分別點(diǎn)鹽酸克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林對(duì)照品溶液和混合對(duì)照品溶液點(diǎn)于同一薄層板上，以異丙醇-環(huán)己烷-甲酸(13∶10∶1)為展開(kāi)系統(tǒng)，展開(kāi)，取出，晾干，在碘蒸氣中熏蒸至斑點(diǎn)清晰，在3種檢視條件下(紫外光燈254和366 nm及可見(jiàn)光)進(jìn)行檢視，結(jié)果見(jiàn)圖2，這4種β2受體激動(dòng)劑在紫外燈254 nm處均斑點(diǎn)清晰，表明紫外光燈254 nm為最佳檢測(cè)方法。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 最低檢測(cè)限的考察 將鹽酸克倫特羅對(duì)照品溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09和0.10 mg·mL-1的溶液，用微量點(diǎn)樣器在同一個(gè)薄層板(10 cm×20 cm)進(jìn)行點(diǎn)樣8 μL，用異丙醇-環(huán)己烷-甲酸(13∶10∶1)作為展開(kāi)劑在展開(kāi)缸里展開(kāi)30 min，取出，晾干，在碘蒸氣中熏蒸至斑點(diǎn)清晰，在紫外光燈254 nm處檢視，記錄Rf值。取萊克多巴胺8 μL、沙丁胺醇12 μL和硫酸特布他林5 μL對(duì)照品溶液，以同樣方法進(jìn)行最低檢測(cè)限考察，當(dāng)對(duì)照品斑點(diǎn)的大小與顏色達(dá)到肉眼剛能清晰辨認(rèn)時(shí)確定為最低檢測(cè)量，各藥物的最低檢測(cè)限見(jiàn)表1，鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林的最低檢測(cè)限分別為0.24，0.24，0.48和0.20 μg。

圖2 不同檢測(cè)方式薄層色譜圖

A.紫外光燈366 nm； B. 紫外光燈254 nm C. 可見(jiàn)光

1.鹽酸克倫特羅；2.萊克多巴胺；3.沙丁胺醇；4.硫酸特布他林；5.混合對(duì)照品溶液

Fig.2 TLC chromatograms of different detection methods

A.under UV light at 366 nm； B.under UV light at 254 nm；C.under visible light

1.clenbuterol hydrochloride；2.ractopamine；3.salbutamol；4.terbutaline sulfate；5.the mixed standard solution

表1 最低檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Limit of detection (LOD) of the 4 kinds ofβ2agonists

對(duì)照品質(zhì)量濃度/mg·mL-1鹽酸克倫特羅(8μL)萊克多巴胺(8μL)沙丁胺醇(12μL)硫酸特布他林(5μL)0.01----0.02----0.03++--0.04++++0.05++++0.06++++0.07++++0.08++++0.09++++0.10++++

2.6.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 將質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林對(duì)照品溶液和混合對(duì)照品溶液在同一薄層板(10 cm×20 cm)點(diǎn)樣展開(kāi)，重復(fù)6次，記錄Rf值，并計(jì)算RSD值。結(jié)果鹽酸克倫特羅的RSD值為4.11%，萊克多巴胺的RSD值為3.04%，沙丁胺醇的RSD值為5.84%，硫酸特布他林的RSD值為5.73%，結(jié)果表明，該薄層色譜法重復(fù)性較好。2.7 薄層鑒別系統(tǒng)驗(yàn)證 分別吸取鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林對(duì)照品溶液、混合對(duì)照品溶液和豬肉、羊肉的模擬樣品溶液，對(duì)照品溶液各取5 μL，樣品溶液各取30 μL，點(diǎn)于同一薄層板上，以異丙醇-環(huán)己烷-甲酸(13∶10∶1)展開(kāi)，取出，晾干，在碘蒸氣中顯色后，置于紫外光燈254 nm處檢視，結(jié)果見(jiàn)圖3，豬肉、羊肉樣品色譜圖中，在與對(duì)照品溶液相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

圖3 薄層系統(tǒng)驗(yàn)證色譜圖

1.鹽酸克倫特羅對(duì)照品溶液；2.萊克多巴胺對(duì)照品溶液； 3.沙丁胺醇對(duì)照品溶液；4.硫酸特布他林對(duì)照品溶液；5.混合對(duì)照品溶液；6.空白豬肉樣品溶液；7.鹽酸克倫特羅豬肉樣品溶液；8.萊克多巴胺豬肉樣品溶液；9.沙丁胺醇豬肉樣品溶液；10.硫酸特布他林豬肉樣品溶液；11.混合豬肉樣品溶液；12.空白羊肉樣品溶液；13.鹽酸克倫特羅羊肉樣品溶液；14.萊克多巴胺羊肉樣品溶液；15.沙丁胺醇羊肉樣品溶液；16.硫酸特布他林羊肉樣品溶液；17.混合羊肉樣品溶液

Fig.3 TLC verification chromatogram

1.clenbuterol hydrochloride standard solution；2.ractopamine standard solution；3.salbutamol standard solution；4.terbutaline sulfate standard solution；5.the mixed standard solution；6.blank pork sample solution；7.spiked pork samples solution(clenbuterol hydrochloride)；8.spiked pork samples solution(ractopamine)；9.spiked pork samples solution(salbutamol)；10.spiked pork samples solution(terbutaline sulfate)；11.spiked pork samples solution(mixed)；12.blank mutton samples solution；13.spiked mutton samples solution(clenbuterol hydrochloride)；14.spiked mutton samples solution(ractopamine)；15.spiked mutton samples solution (salbutamol)；16.spiked mutton samples solution(terbutaline sulfate)；17.spiked mutton samples solution (mixed)

3 實(shí)際樣品的測(cè)定

購(gòu)于西安市不同農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的2批豬肉和2批羊肉，采用已建立的TLC對(duì)該樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，有1批豬肉樣品中含有鹽酸克倫特羅，其他均未發(fā)現(xiàn)鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林。

4 討論

4.1 固定相的選擇 實(shí)驗(yàn)中采用硅膠G、硅膠GF254和硅膠HPGF254分別制備薄層板，并用其對(duì)鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林混合對(duì)照品溶液以異丙醇-環(huán)己烷-甲酸(13∶10∶1)作為展開(kāi)劑展開(kāi)，在碘蒸氣中熏蒸后，置于紫外光燈中檢視，使用硅膠G作為固定相時(shí)無(wú)法觀察到明顯的斑點(diǎn)，使用硅膠GF254作為固定相時(shí)，斑點(diǎn)有拖尾現(xiàn)象，而使用硅膠HPGF254展開(kāi)效果良好，且所得斑點(diǎn)清晰，因此選用硅膠HPGF254作為固定相。

4.2 展開(kāi)劑的選擇 實(shí)驗(yàn)中通過(guò)優(yōu)化展開(kāi)劑的方法同時(shí)檢測(cè)鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林，考察了乙酸乙酯-甲醇-醋酸(8∶1∶0.8)、濃氨溶液-水-異丙醇(4∶16∶5)和異丙醇-環(huán)己烷-甲酸(13∶10∶1)這3種展開(kāi)劑對(duì)目標(biāo)化合物的展開(kāi)效果，結(jié)果表明，以異丙醇-環(huán)己烷-甲酸(13∶10∶1)作為展開(kāi)劑可以同時(shí)檢測(cè)上述4種目標(biāo)化合物，且分離效果良好，因此選用異丙醇-環(huán)己烷-甲酸(13∶10∶1)作為本實(shí)驗(yàn)的展開(kāi)劑。

4.3 檢視方式的選擇 實(shí)驗(yàn)在3種檢視條件下(紫外光燈254和366 nm及可見(jiàn)光)進(jìn)行檢視，可見(jiàn)光下無(wú)法觀察到明顯斑點(diǎn)，366 nm處沙丁胺醇顯藍(lán)色斑點(diǎn)，其他的斑點(diǎn)顏色不明顯，在紫外光燈254 nm處可觀察到明顯的斑點(diǎn)，另外碘蒸氣熏蒸后可明顯提高萊克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林檢測(cè)方法的靈敏度，故選擇碘蒸氣熏蒸后在紫外光燈254 nm處進(jìn)行檢視。

本研究建立的TLC方法具有靈敏度高、專屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)單、不需要特殊的設(shè)備等特點(diǎn)?？赏瑫r(shí)對(duì)生物樣品中的鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和硫酸特布他林4種β2受體激動(dòng)劑進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，為食品安全快速檢測(cè)提供了理論依據(jù)。

[1] 高照， 張?jiān)?張亦農(nóng)， 等. 動(dòng)物組織內(nèi)殘留β2-受體激動(dòng)劑的檢測(cè)方法研究進(jìn)展 [J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2014，33(4):370-378.

[2] 劉暢. 動(dòng)物源性食品中常見(jiàn)藥物殘留檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用 [D]. 上海: 第二軍醫(yī)大學(xué)，2008.

[3] 熊琳，李維紅，高雅琴，等. 肉品中β-受體激動(dòng)劑類藥物殘留檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展 [J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)， 2015， 6(2): 528-533.

[4] Du W，F(xiàn)u Q，Zhao G，et al. Dummy-template molecularly imprinted solid phase extraction for selective analysis of ractopamine in pork [J]. Food Chem， 2013， 139(1-4): 24-30.

[5] Du W，F(xiàn)u Q，Zhao G，et al. Combined microextraction by packed sorbent and high-performance liquid chromatography-ultraviolet detection for rapid analysis of ractopamine in porcine muscle and urine samples [J]. Food Chem， 2014，145: 789-795.

[6] Du W，Lei C，Zhang S，et al. Determination of clenbuterol from pork samples using surface molecularly imprinted polymers as the selective sorbents for microextraction in packed syringe [J]. J Pharm Biomed Anal， 2014， 91: 160-168.

[7] 劉佳， 謝云峰， 任丹丹， 等. 反相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)豬肝中26種β2-受體激動(dòng)劑類藥物殘留[J]. 分析化學(xué)， 2014， 42(10): 1486-1492.

[8] 楊正慧. 氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)β-受體激動(dòng)劑殘留量的方法研究[D]. 吉林: 吉林大學(xué)， 2012.

[9] 趙凌國(guó)， 丘汾， 李偉， 等. 納米金涂層毛細(xì)管電泳法快速檢測(cè)豬肉和內(nèi)臟中3種β2受體激動(dòng)劑 [J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2015， 25(10): 1503-1507.

[10]王藝熹. 沙丁胺醇兔單克隆抗體的制備及ELISA快速檢測(cè)試劑盒的研制 [D]. 杭州：浙江大學(xué)， 2008.

[11]魯立良， 羅力力， 王遠(yuǎn)， 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品中4種β2-受體激動(dòng)劑類藥物殘留[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊， 2012， (5): 108-111.

[12]王鐵松， 仝禹， 鄭潔， 等. 薄層色譜法快速篩查降脂、降壓、止咳平喘類中藥制劑中的29種添加化學(xué)藥物 [J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志， 2010， 45(11): 857-861.

Establishment and application of thin layer chromatography method for rapid detection of 4 kinds of β2agonists in food

HAN Ningjuan1，2，DU Wei1，CHANG Chun1，F(xiàn)U Qiang1*

(1.School of Pharmacy， Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710061， China；2.Xi′an Peihua College，Xi′an 710125， China)

β2agonists；rapid analysis； thin layer chromatography (TLC)

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81573391和81503034)：陜西省衛(wèi)生廳科研資助項(xiàng)目(編號(hào)：2014D73)

韓寧娟，女，在讀碩士研究生

*通信作者：傅強(qiáng)，男，教授，博士生導(dǎo)師

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.007

R927.2

A

1004-2407(2016)06-0574-05

2016-04-28)