梁偉杰， 陳美姬， 何潔儀， 李健豪， 陳 君， 余盛龍， 程 飛， 蘭 軍△

(1廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院心血管內(nèi)科， 2廣州市番禺區(qū)心血管疾病研究所，廣東 廣州 511400； 3中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)兒科，廣東 廣州 510700； 4東莞市第三人民醫(yī)院心血管內(nèi)科， 5東莞市心血管疾病研究所，廣東 東莞 523326)

?

血管緊張素-(1-7)通過抑制TLR4激活和壞死性凋亡的相互作用對(duì)抗高糖引起的H9c2心肌細(xì)胞損傷*

梁偉杰1, 2， 陳美姬3， 何潔儀1, 2， 李健豪1, 2， 陳 君1, 2， 余盛龍1, 2， 程 飛4, 5， 蘭 軍4, 5△

(1廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，2廣州市番禺區(qū)心血管疾病研究所，廣東 廣州 511400；3中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)兒科，廣東 廣州 510700；4東莞市第三人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，5東莞市心血管疾病研究所，廣東 東莞 523326)

目的： 研究血管緊張素-(1-7)[Ang-(1-7)]能否通過抑制Toll樣受體4(TLR4)激活和壞死性凋亡的相互作用對(duì)抗高糖(HG)引起的H9c2心肌細(xì)胞損傷。方法: 應(yīng)用Western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞受體相互作用蛋白3(RIP3; 反映壞死性凋亡的指標(biāo))和TLR4 的表達(dá)水平；CCK-8法測(cè)定心肌細(xì)胞存活率；用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)的活性；ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的分泌水平；雙氯熒光素染色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)水平；羅丹明123 染色法測(cè)定線粒體膜電位(MMP)。結(jié)果: HG(35 mmol/L葡萄糖)作用H9c2心肌細(xì)胞24 h可使RIP3的表達(dá)水平明顯升高，應(yīng)用30 μmol/L TAK-242(TLR4抑制劑)和HG共處理心肌細(xì)胞24 h可抑制HG對(duì)RIP3的上調(diào)；另一方面，HG可上調(diào)TLR4的表達(dá)，100 μmol/L壞死性凋亡的特異性抑制劑necrostatin-1(Nec-1)和HG共處理心肌細(xì)胞24 h可抑制HG對(duì)TLR4的上調(diào)；而1 μmol/L Ang-(1-7)和HG共處理心肌細(xì)胞24 h能同時(shí)抑制HG對(duì)RIP3 和TLR4 的上調(diào)。此外，1 μmol/L Ang-(1-7)、30 μmol/L TAK-242 或100 μmol/L Nec-1與HG 共處理心肌細(xì)胞均能對(duì)抗HG引起的心肌細(xì)胞損傷，細(xì)胞存活率升高，LDH活性降低，ROS生成和MMP丟失減少，同時(shí)IL-1β和TNF-α的分泌減少。結(jié)論: Ang-(1-7)通過抑制TLR4激活和壞死性凋亡的相互作用對(duì)抗高糖引起的H9c2心肌細(xì)胞損傷。

血管緊張素-(1-7)； Toll樣受體4； 壞死性凋亡； 高糖； 心肌細(xì)胞

高血糖是糖尿病的一個(gè)重要始動(dòng)因素，可導(dǎo)致糖尿病心血管并發(fā)癥如冠心病、糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)等的發(fā)生[1]，也是導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的一個(gè)直接原因[2]。壞死性凋亡也稱為程序性壞死，是Degterev等[3]于2005年首次報(bào)道的一種細(xì)胞死亡方式，廣泛參與心血管、神經(jīng)、消化等多個(gè)系統(tǒng)疾病的發(fā)生。壞死性凋亡有獨(dú)特的信號(hào)通路，通常由死亡誘導(dǎo)因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等誘導(dǎo)發(fā)生[3]。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一種跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，參與炎癥反應(yīng)和特異性免疫應(yīng)答[4]。近年來有報(bào)道指出，TLRs如TLR3、TLR4 也可介導(dǎo)壞死性凋亡發(fā)生[5-6]。最近，我們實(shí)驗(yàn)證實(shí)，高糖可引起心肌細(xì)胞壞死性凋亡的發(fā)生[7]，但是，在高糖損傷H9c2 心肌細(xì)胞模型中，壞死性凋亡的發(fā)生能否由TLR4 介導(dǎo)，其兩者之間的關(guān)系及其在高糖引起心肌細(xì)胞損傷和炎癥中的作用如何，目前仍缺乏深入的研究。

另一方面，血管緊張素-(1-7) [angiotensin-(1-7)，Ang-(1-7)]是一種內(nèi)源性多肽激素，可由心肌細(xì)胞產(chǎn)生[8]。Ang-(1-7)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)中的一個(gè)重要的信號(hào)分子，已被證實(shí)具有舒張血管、降血壓及保護(hù)血管內(nèi)皮等心血管保護(hù)作用[9]。最近，我們證實(shí)，Ang-(1-7)可保護(hù)心肌細(xì)胞對(duì)抗高糖引起的H9c2 心肌細(xì)胞損傷[10]。然而，Ang-(1-7)能否抑制壞死性凋亡和TLR4 的活化從而實(shí)現(xiàn)心肌保護(hù)作用，目前國(guó)內(nèi)外仍未見報(bào)道。

為此，本研究在高糖損傷H9c2心肌細(xì)胞模型[11]中探討如下幾點(diǎn)：(1) TLR4激活和壞死性凋亡之間是否存在相互作用；(2) TLR4激活和壞死性凋亡之間的相互作用與高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和炎癥的關(guān)系；(3) Ang-(1-7)能否通過抑制TLR4和壞死性凋亡的相互作用對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和炎癥。

材 料 和 方 法

1 材料

受體相互作用蛋白3 (receptor-interacting protein 3，RIP3; 反映壞死性凋亡的指示)抗體購(gòu)自CST；TLR4 抗體購(gòu)自Abcam；壞死性凋亡抑制劑necrostatin-1(Nec-1)、羅丹明123(rhodamine 123, Rh123)、Ang-(1-7)、雙氯熒光素(2’, 7’-dichlorfluorescein diacetate，DCFH-DA)和乳酸脫氫酶(lactate dehydroge-nase，LDH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Sigma；TAK-242(TLR4 抑制劑)購(gòu)自Invivogen；CCK-8購(gòu)自Dojindo；特級(jí)胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Gibco；DMEM培養(yǎng)基(其葡萄糖濃度為5.5 mmol/L)由HyClone供應(yīng)；IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒由武漢華美生物工程有限公司提供。H9c2 心肌細(xì)胞來源于胚胎期大鼠心臟組織的亞克隆細(xì)胞系，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù)供應(yīng)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) H9c2心肌細(xì)胞置于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，于5% CO2、37 ℃的條件下傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%的融合狀態(tài)可用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為8組：對(duì)照(control)組：DMEM培養(yǎng)基作用心肌細(xì)胞24 h；高糖(high glucose，HG)組：35 mmol/L葡萄糖處理心肌細(xì)胞24 h；Ang-(1-7)+HG組：1 μmol/L Ang-(1-7)與35 mmol/L葡萄糖共處理心肌細(xì)胞24 h；TAK-242+HG組：30 μmol/L TAK-242 與35 mmol/L葡萄糖共處理心肌細(xì)胞24 h；Nec-1+HG組：100 μmol/L Nec-1 與35 mmol/L葡萄糖共處理心肌細(xì)胞24 h；Ang-(1-7)組：1 μmol/L Ang-(1-7)與DMEM培養(yǎng)基共處理心肌細(xì)胞24 h；TAK-242 組：30 μmol/L TAK-242 與DMEM培養(yǎng)基共處理心肌細(xì)胞24 h；Nec-1組：100 μmol/L Nec-1 與DMEM培養(yǎng)基共處理心肌細(xì)胞24 h。

2.3 Western blot 檢測(cè)RIP3 和TLR4 的表達(dá) 在60 mm培養(yǎng)皿中種植H9c2 心肌細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%融合度時(shí)，根據(jù)分組給予相應(yīng)處理后，加入細(xì)胞裂解液，4 ℃搖床上處理30 min，14 000×g高速離心10 min，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。等量的蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入 I 抗，即兔抗鼠RIP3、TLR4 或GAPDH抗體(濃度均為1∶1 000)，4 ℃過夜后加入濃度為1∶2 500的 II 抗，室溫下孵育1.5 h。ECL法使PVDF膜顯色，暗室中曝光到X線片上，凝膠成像掃描系統(tǒng)分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.4 CCK-8法測(cè)定心肌細(xì)胞存活率 于96孔培養(yǎng)板中種植H9c2 心肌細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到大約80%時(shí)，按照設(shè)定的分組分別處理后，棄去上清液，用PBS沖洗3次，于每孔中加入DMEM 90 μL和CCK-8 溶液10 μL，將培養(yǎng)板放置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2.5 h，在酶標(biāo)儀上讀取450 nm處的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率按照以下公式計(jì)算：細(xì)胞存活率(%)=處理組A/對(duì)照組A×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.5 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性 于96孔板中種植H9c2心肌細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到約80%時(shí)，按照設(shè)定的分組分別處理后，嚴(yán)格按照LDH試劑盒說明書步驟，檢測(cè)并計(jì)算出培養(yǎng)液中LDH的活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.6 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α的水平 于96孔板中種植H9c2心肌細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到大約80%時(shí)，按照分組給予不同處理后，收集培養(yǎng)基作待測(cè)標(biāo)本。ELISA操作流程根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行，在終止顯色反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀(λ=450 nm)測(cè)定各孔吸光度(A)值。取5孔A值的平均數(shù)，根據(jù)公式(處理組A/對(duì)照組A×100%)計(jì)算IL-1β和TNF-α的誘導(dǎo)釋放率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.7 DCFH-DA染色熒光顯微鏡照相法測(cè)定胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平 用24孔板培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到約80%時(shí)，按照分組給予相應(yīng)處理后，加入DCFH-DA染液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，熒光顯微鏡下隨機(jī)照片記錄5個(gè)高倍鏡視野，應(yīng)用ImageJ 1.47i軟件計(jì)算出綠色熒光的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)，再對(duì)每組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.8 Rh123 染色熒光顯微鏡照相法檢測(cè)線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP) 用24孔板培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度為80%左右時(shí)，按照分組給予相應(yīng)的處理后，加入Rh123緩沖液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育45 min，熒光顯微鏡下隨機(jī)照片記錄5個(gè)高倍鏡視野，應(yīng)用圖像分析軟件計(jì)算出綠色熒光的MFI，再對(duì)每組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)處理和分析，

計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，單因素方差分析(one-way ANOVA)用于多個(gè)樣本均數(shù)間的比較，SNK-q檢驗(yàn)用于多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TAK-242 抑制HG誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞RIP3 表達(dá)增加

高糖作用H9c2 心肌細(xì)胞24 h可使RIP3 表達(dá)水平明顯升高；30 μmol/L TAK-242和HG共處理心肌細(xì)胞24 h可減少RIP3 的表達(dá)，與HG組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。TAK-242 本身對(duì)心肌細(xì)胞RIP3 的基礎(chǔ)表達(dá)無明顯影響，見圖1。

Figure 1.TAK-242 (an inhibitor of TLR4) attenuated high glucose (HG)-induced up-regulation of RIP3 expression in H9c2 cardiac cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖1 TAK-242減弱HG對(duì)心肌細(xì)胞RIP3表達(dá)的上調(diào)作用

2 Nec-1 抑制HG誘導(dǎo)的TLR4 表達(dá)增加

圖2顯示，HG作用心肌細(xì)胞24 h可使TLR4 表達(dá)明顯增加；應(yīng)用100 μmol/L Nec-1和HG共處理心肌細(xì)胞24 h，TLR4 表達(dá)水平有所下降，與HG組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。Nec-1 本身對(duì)心肌細(xì)胞TLR4 基礎(chǔ)表達(dá)無明顯的影響。

3 Ang-(1-7)抑制HG對(duì)RIP3 和TLR4 表達(dá)的上調(diào) 如前所述，HG處理心肌細(xì)胞24 h可明顯促進(jìn)RIP3和TLR4 表達(dá)，應(yīng)用1 μmol/L Ang-(1-7)和HG共處理心肌細(xì)胞24 h，RIP3 和TLR4 的表達(dá)均明顯減少，分別與HG組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。單純應(yīng)用100 μmol/L Ang-(1-7)處理心肌細(xì)胞對(duì)RIP3 和TLR4 的基礎(chǔ)表達(dá)無明顯影響，見圖3。

Figure 2.Nec-1 (a specific inhibitor of necroptosis) attenuated high glucose (HG)-induced up-regulation of TLR4 expression in H9c2 cardiac cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖2 Nec-1減弱HG對(duì)心肌細(xì)胞TLR4 表達(dá)的上調(diào)作用

Figure 3.Ang-(1-7) attenuated high glucose (HG)-induced up-regulation of TLR4 and RIP3 expression in H9c2 cardiac cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖3 Ang-(1-7)抑制HG對(duì)心肌細(xì)胞TLR4 和RIP3 表達(dá)的上調(diào)作用

4 Ang-(1-7)、TAK-242 和Nec-1 抑制HG引起的心肌細(xì)胞毒性

HG作用心肌細(xì)胞24 h可誘導(dǎo)明顯的心肌細(xì)胞毒性，使心肌細(xì)胞存活率下降，培養(yǎng)液中的LDH活性增加。應(yīng)用1 μmol/L Ang-(1-7)和HG共處理心肌細(xì)胞24 h，細(xì)胞存活率有明顯的上升，LDH活性明顯降低，與HG組分別比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。與Ang-(1-7)作用類似，30 μmol/L TAK-242 或100 μmol/L Nec-1 和HG共處理心肌細(xì)胞24 h也能提高細(xì)胞存活率，降低LDH活性，分別與HG組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。Ang-(1-7)、TAK-242 和Nec-1本身沒有產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性，見圖4。

Figure 4.Ang-(1-7), TAK-242 (an inhibitor of TLR4) and Nec-1 (a specific inhibitor of necroptosis) attenuated HG-induced decrease in cell viability and increase in the activity of lactate dehydrogenase (LDH) in the culture medium. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖4 Ang-(1-7)、TAK-242 和Nec-1 抑制HG引起的細(xì)胞存活率降低和細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性增加

5 Ang-(1-7)、TAK-242 和Nec-1 抑制HG引起的心肌細(xì)胞內(nèi)ROS堆積

H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)HG作用24 h，胞內(nèi)DCFH-DA的MFI明顯增強(qiáng)，與control組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。然而，在HG作用前，應(yīng)用1 μmol/L Ang-(1-7)和HG共處理心肌細(xì)胞24 h，可使MFI明顯降低，與HG組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。與Ang-(1-7)作用類似，30 μmol/L TAK-242或100 μmol/L Nec-1和HG共處理心肌細(xì)胞24 h也能使DCFH-DA的MFI明顯降低，分別與HG組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。1 μmol/L Ang-(1-7)、30 μmol/L TAK-242 或100 μmol/L Nec-1 本身對(duì)心肌細(xì)胞ROS的生成無明顯的影響，見圖5。

Figure 5.Ang-(1-7), TAK-242 (an inhibitor of TLR4) and Nec-1 (a specific inhibitor of necroptosis) attenuated HG-induced increase in intracellular ROS generation in H9c2 cardiac cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖5 Ang-(1-7)、TAK-242 和Nec-1 抑制HG引起的心肌細(xì)胞內(nèi)ROS堆積

6 Ang-(1-7)、TAK-242 和Nec-1 抑制HG引起的心肌細(xì)胞MMP丟失

HG可使心肌細(xì)胞內(nèi)Rh123 的MFI從(28.50±1.36)%降低至(7.70±0.90)%(P<0.01)。采用1 μmol/L Ang-(1-7)和HG共處理心肌細(xì)胞24 h，可使MFI升高至(18.70±1.24)%，與HG組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。與Ang-(1-7)作用類似，30 μmol/L TAK-242或100 μmol/L Nec-1和HG共處理心肌細(xì)胞24 h也能使MFI明顯升高，分別與HG比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。1 μmol/L Ang-(1-7)、30 μmol/L TAK-242 或100 μmol/L Nec-1 本身對(duì)心肌細(xì)胞MMP無明顯的影響，見圖6。

7 Ang-(1-7)、TAK-242 和Nec-1 抑制HG引起的炎癥細(xì)胞因子分泌

如圖7所示，HG作用心肌細(xì)胞24 h可使炎癥細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的分泌水平明顯升高，與control組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。1 μmol/L Ang-(1-7)和HG共處理心肌細(xì)胞24 h可使IL-1β和TNF-α的分泌水平明顯降低，與HG組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。與Ang-(1-7)的作用相類似，30 μmol/L TAK-242 或100 μmol/L Nec-1 共處理心肌細(xì)胞24 h也能使IL-1β和TNF-α的分泌水平降低，分別與HG組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。1 μmol/L Ang-(1-7)、30 μmol/L TAK-242 或100 μmol/L Nec-1 本身不影響炎癥細(xì)胞因子的基礎(chǔ)分泌水平。

討 論

在本研究中，我們觀察到HG可引起心肌細(xì)胞RIP3 表達(dá)水平升高，再次證實(shí)HG可引起心肌細(xì)胞壞死性凋亡的發(fā)生，這與我們之前[7]的報(bào)道相一致。

Figure 6.Ang-(1-7), TAK-242 (an inhibitor of TLR4) and Nec-1 (a specific inhibitor of necroptosis) attenuated HG-induced dissipation of mitochondrial membrane potential (MMP) in H9c2 cardiac cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖6 Ang-(1-7)、TAK-242 和Nec-1 抑制HG引起的心肌細(xì)胞MMP丟失

Figure 7.Ang-(1-7), TAK-242 (an inhibitor of TLR4) and Nec-1 (a specific inhibitor of necroptosis) attenuated HG-induced secretion of inflammatory cytokines in H9c2 cardiac cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

圖7 Ang-(1-7)、TAK-242 和Nec-1 抑制HG引起的炎癥細(xì)胞因子分泌

壞死性凋亡通常是由TNF-α誘導(dǎo)而啟動(dòng)，但近期有報(bào)道指出，在小鼠的巨噬細(xì)胞模型中，TLR4 也可介導(dǎo)壞死性凋亡的發(fā)生[5-6]。TLR4 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的TLR相關(guān)蛋白，在心肌細(xì)胞中有大量的表達(dá)[12]，是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的一種重要的上游信號(hào)分子。在本研究中，我們首先觀察了TLR4 的抑制劑TAK-242 對(duì)HG上調(diào)RIP3 表達(dá)的影響，結(jié)果表明TAK-242 能明顯抑制HG對(duì)RIP3 表達(dá)的上調(diào)，提示在HG損傷心肌細(xì)胞的模型中，TLR4 可誘導(dǎo)壞死性凋亡的發(fā)生。另一方面，壞死性凋亡和細(xì)胞炎癥反應(yīng)的關(guān)系非常密切，有研究指出，壞死性凋亡可介導(dǎo)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[13]，而TLR4 是炎癥反應(yīng)的重要信號(hào)分子，因此我們推測(cè)壞死性凋亡對(duì)TLR4 可能有調(diào)控作用。在本研究中，我們觀察到HG可引起TLR4 表達(dá)增多，而壞死性凋亡的特異性抑制劑Nec-1 可抑制HG對(duì)TLR4 表達(dá)的上調(diào)，表明HG可激活TLR4 通路，其作用機(jī)制之一可能與壞死性凋亡有關(guān)。此外，應(yīng)用TAK-242 和Nec-1 共處理心肌細(xì)胞均能對(duì)抗HG引起的心肌細(xì)胞損傷和炎癥，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率升高，LDH活性降低，ROS生成、MMP丟失及炎癥細(xì)胞因子分泌減少。上述結(jié)果清晰地提示TLR4 激活和壞死性凋亡之間存在正反饋?zhàn)饔?，一方面，HG引起TLR4 激活后可誘導(dǎo)壞死性凋亡發(fā)生，另一方面，壞死性凋亡反過來可引起TLR4 的激活。TLR4 激活和壞死性凋亡之間的相互作用可能是HG引起心肌細(xì)胞損傷和炎癥的一種新的作用機(jī)制，這為尋找防治糖尿病心血管并發(fā)癥的作用靶點(diǎn)提供了新穎的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

重要的是，我們還證實(shí)了Ang-(1-7)可通過抑制TLR4 激活和壞死性凋亡的相互作用對(duì)抗HG引起的心肌細(xì)胞損傷和炎癥。Ang-(1-7)是一個(gè)由7個(gè)氨基酸組成的多肽，主要分布于血管、心臟、腎臟等處和血液中，在心血管系統(tǒng)的病理生理過程中發(fā)揮重要的作用[9, 14-15]。最近，我們證實(shí)了Ang-(1-7)可通過調(diào)控核因子-κB(nuclear factor κB, NF-κB)通路對(duì)抗高糖引起的H9c2 心肌細(xì)胞損傷[10]，但Ang-(1-7)的心肌保護(hù)機(jī)制是非常復(fù)雜的，還可能涉及更多未知的作用機(jī)制。本研究中我們重點(diǎn)探討了Ang-(1-7)對(duì)HG激活的TLR4 和壞死性凋亡的影響。研究結(jié)果表明，Ang-(1-7)能抑制HG對(duì)心肌細(xì)胞TLR4 和RIP3 表達(dá)的上調(diào)作用，并可抑制HG誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激、線粒體損傷和炎癥反應(yīng)，而Ang-(1-7)的上述心肌保護(hù)作用，與TAK-242 阻斷TLR4 通路及Nec-1 阻斷壞死性凋亡所產(chǎn)生的心肌保護(hù)作用是相類似的。因此，上述結(jié)果有力地證實(shí)，抑制TLR4 激活和壞死性凋亡之間的正相互作用，可能是Ang-(1-7)保護(hù)H9c2 心肌細(xì)胞對(duì)抗HG引起的損傷和炎癥的重要機(jī)制之一。

綜上所述，本研究在HG損傷H9c2 心肌細(xì)胞的模型中，首次證實(shí)TLR4 激活和壞死性凋亡之間的正相互作用介導(dǎo)HG引起的心肌細(xì)胞損傷和炎癥；抑制TLR4 活化和壞死性凋亡之間的正相互作用可能是Ang-(1-7)對(duì)抗HG引起的心肌細(xì)胞損傷和炎癥的重要作用機(jī)制之一。

[1] Kengne AP, Turnbull F, MacMahon S. The Framingham Study, diabetes mellitus and cardiovascular disease: tur-ning back the clock[J]. Prog Cardiovasc Dis, 2010, 53(1):45-51.

[2] Cai L, Kang YJ. Cell death and diabetic cardiomyopathy[J]. Cardiovasc Toxicol, 2003, 3(3):219-228.

[3] Degterev A, Zhou W, Maki JL, et al. Assays for necroptosis and activity of RIP kinases[J]. Methods Enzymol, 2014, 545:1-33.

[4] Montecucco F, Braunersreuther V, Burger F, et al. Anti-apoA-1 auto-antibodies increase mouse atherosclerotic plaque vulnerability, myocardial necrosis and mortality triggering TLR2 and TLR4[J]. Thromb Haemost, 2015, 114(2):410-422.

[5] He S, Liang Y, Shao F, et al. Toll-like receptors activate programmed necrosis in macrophages through a receptor-interacting kinase-3-mediated pathway[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(50):20054-20059.

[6] Kaiser WJ, Sridharan H, Huang C, et al. Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL[J]. J Biol Chem, 2013, 288(43): 31268-31279.

[7] 梁偉杰，何潔儀，張穩(wěn)柱，等. 硫化氫通過抑制壞死性凋亡對(duì)抗高糖引起的H9c2心肌細(xì)胞損傷[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2016, 32(3):385-391.

[8] Tallant EA, Ferrario CM, Gallagher PE. Angiotensin-(1-7) inhibits growth of cardiac myocytes through activation of the mas receptor[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2005, 289(4):H1560-H1566.

[9] Jarajapu YP, Bhatwadekar AD, Caballero S, et al. Activation of the ACE2/angiotensin-(1-7)/Mas receptor axis enhances the reparative function of dysfunctional diabetic endothelial progenitors[J]. Diabetes, 2013, 62(4): 1258-1269.

[10]梁偉杰，陳景福，宋明才，等. 血管緊張素-(1-7)/Mas受體軸通過調(diào)控NF-κB通路保護(hù)心肌細(xì)胞對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的損傷[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2015, 31(2):267-273.

[11]Xu W, Wu W, Chen J, et al. Exogenous hydrogen sulfide protects H9c2 cardiac cells against high glucose-induced injury by inhibiting the activities of the p38 MAPK and ERK1/2 pathways[J]. Int J Mol Med, 2013, 32(4): 917-925.

[12]Dasu MR, Devaraj S, Park S, et al. Increased toll-like receptor (TLR) activation and TLR ligands in recently diagnosed type 2 diabetic subjects[J]. Diabetes Care, 2010, 33(4):861-868.

[13]Liu ZY, Wu B, Guo YS, et al. Necrostatin-1 reduces intestinal inflammation and colitis-associated tumorigenesis in mice[J]. Am J Cancer Res, 2015, 5(10):3174-3185.

[14]杜 軍，陳長(zhǎng)勛. 血管緊張素(1-7)的心血管效應(yīng)[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2007, 23(5):572-574.

[15]Loot AE, Roks AJ, Henning RH, et al. Angiotensin-(1-7) attenuates the development of heart failure after myocardial infarction in rats[J]. Circulation, 2002, 105(13):1548-1550.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Angiotensin-(1-7) protects H9c2 cardiac cells against high glucose-induced injury and inflammation by inhibiting the interaction between TLR4 activation and necroptosis

LIANG Wei-jie1, 2, CHEN Mei-ji3, HE Jie-yi1, 2, LI Jian-hao1, 2, CHEN Jun1, 2, YU Sheng-long1, 2, CHENG Fei4, 5, LAN Jun4, 5

(1DepartmentofCardiology,CentralHospitalofPanyuDistrict，2CardiovascularInstituteofPanyuDistrict,Guangzhou511400,China;3DepartmentofPediatrics,HuangpuDivisionofTheFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510700,China;4DepartmentofCardiology,TheThirdPeople’sHospitalofDongguanCity,5CardiovascularInstituteofDongguanCity,Dongguan523326,China.E-mail:dgsdsrmyylj@126.com)

AIM: To investigate whether angiotensin-(1-7) [Ang-(1-7)] protects H9c2 cardiac cells against high glucose (HG)-induced injury and inflammation by inhibiting the interaction between Toll-like receptor 4 (TLR4) activation and necroptosis.METHODS: The expression levels of receptor-interacting protein 3 (RIP3; an indicator of necroptosis) and TLR4 were determined by Western blot. Cell viability was measured by CCK-8 assay. The activity of lactate dehydrogenase (LDH) in the culture medium was measured with a commercial kit. The releases of interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were measured by ELISA. The intracellular level of reactive oxygen species (ROS) was analyzed by 2’, 7’-dichlorfluorescein-diacetate (DCFH-DA) stating followed by photofluorography. Mitochondrial membrane potential (MMP) was examined by rhodamine 123 staining followed by photofluorography.RESULTS: After the H9c2 cardiac cells were treated with HG (35 mmol/L glucose) for 24 h, the expression of RIP3 was obviously increased. Co-treatment of the cells with 30 μmol/L TAK-242 (an inhibitor of TLR4) attenuated the up-regulation of RIP3 induced by HG. Furthermore, the expression of TLR4 was significantly increased after the cells were exposed to HG for 24 h, and co-treatment of the cells with 100 μmol/L necrostatin-1 (Nec-1; a specific inhibitor of necroptosis) and HG for 24 h attenuated the up-regulation of TLR4 expression induced by HG. Moreover, 1 μmol/L Ang-(1-7) simultaneously blocked the up-regulation of the RIP3 and TLR4 induced by HG. On the other hand, co-treatment of the cells with 1 μmol/L Ang-(1-7), 30 μmol/L TAK-242 or 100 μmol/L Nec-1 and HG for 24 h attenuated HG-induced injuries and inflammatory response, leading to the increase in the cell viability, and the decreases in the activity of LDH, ROS generation, MMP loss as well as the releases of IL-1β and TNF-α.CONCLUSION: Ang-(1-7) protects H9c2 cardiac cells against HG-induced injury and inflammation by inhibiting the interaction between TLR4 activation and necroptosis.

Angiotensin-(1-7); Toll-like receptor 4; Necroptosis; High glucose; Cardiomyocytes

1000- 4718(2016)10- 1750- 07

2016- 05- 09

2016- 06- 30

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2015A030313690)；番禺區(qū)中心醫(yī)院青年基金資助項(xiàng)目(No. 2014-Q-01)

△通訊作者 Tel: 0769-81368315； E-mail： dgsdsrmyylj@126.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.004

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net