何蘇琴, 白 濱, 文朝慧, 荊卓瓊

(1. 甘肅省農業(yè)科學院植物保護研究所, 蘭州 730070;2. 甘肅省農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所, 蘭州 730070; 3. 甘肅出入境檢驗檢疫局, 蘭州 730020)

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甘肅省桃果實褐斑病病原鑒定

何蘇琴1*, 白 濱2, 文朝慧3, 荊卓瓊1

(1. 甘肅省農業(yè)科學院植物保護研究所, 蘭州 730070;2. 甘肅省農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所, 蘭州 730070; 3. 甘肅出入境檢驗檢疫局, 蘭州 730020)

近年來,桃果實褐斑病在甘肅省中部的蘭州、臨洮等地的桃園中危害嚴重。在疏于防治的桃園,受害嚴重的中晚熟桃,病果率超過70%。經病原菌分離培養(yǎng)、柯赫氏法則證病,及病原菌形態(tài)學和分子生物學鑒定(GenBank accession number:KT002183),明確其病原為Thyrostromacarpophilum(Lév.) B.Sutton。在罹病桃果實上,病斑圓形,褐色,散生,稍凹陷,直徑0.5～1.5 cm,病斑上有時可見環(huán)生的黑色粉粒狀分生孢子座;病菌分生孢子淡褐色至褐色,聚集時呈黑色,梭形或蠕蟲形,端細胞錐狀或鈍圓,具2～9個橫隔膜,偶見1～2個斜隔膜,分隔處縊縮,孢子大小為(24.68～72.21) μm×(9.36～14.94) μm,平均(53.58±8.95) μm×(12.65±1.15) μm。病菌適宜生長溫度為20℃;30℃幾乎不生長;35℃培養(yǎng)7 d,部分培養(yǎng)物即死亡。

桃; 果實褐斑病;Thyrostromacarpophilum; 形態(tài)特征; ITS序列

甘肅是桃的原產地之一,桃樹栽培歷史悠久[1-3]。2005 年甘肅省桃樹栽培面積達14 167 hm2,產量10.2萬t,桃已成為甘肅省優(yōu)勢果樹產業(yè)之一[4]。近年來,桃果實褐斑病在甘肅省中部的蘭州、臨洮等地的桃園中危害嚴重。在疏于防治的桃園,受害嚴重的中晚熟桃,病果率超過70%。套袋桃果實在取袋(9月上旬)后,亦可被侵染。病斑生于果實表面,褐色,圓形,散生或相連成片,嚴重影響了果實的商品性。經病原菌分離培養(yǎng)、柯赫氏法則證病,及病原菌形態(tài)特征和分子生物學鑒定,明確了病原菌種類,同時對病原菌適宜生長溫度進行了測定。研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 用于病原菌分離的標樣來源

罹病桃果實(品種:‘中華壽桃’):5枚,2006年10月25日采集自甘肅省臨洮縣;罹病桃果實(品種:‘崗山白’):2枚,2007年9月5日采集自甘肅省皋蘭縣;罹病桃果實(品種:‘崗山白’):3枚,2012年9月5日采集自甘肅省皋蘭縣。

1.2 培養(yǎng)基配方

PDA:馬鈴薯200 g,葡萄糖15 g,瓊脂粉12 g,自來水1 000 mL。PSA:馬鈴薯200 g,蔗糖15 g,瓊脂粉12 g,自來水1 000 mL。PD培養(yǎng)液:馬鈴薯200 g,葡萄糖15 g,自來水1 000 mL。

1.3 病原菌分離

采用組織分離法和孢子稀釋法分離病原[5]。新鮮病組織經75%乙醇表面消毒,滅菌水沖洗4次,置于PDA平板上;或自病斑表面挑取少許孢子,用滅菌水稀釋后,取1 mL涂于PDA平板上。25℃培養(yǎng),挑取菌落尖端菌絲或單孢子菌落進行純化后留存并用于后續(xù)的試驗。

1.4 Koch’s法則證病

在PDA平板上，接種菌株gt-1-1 25℃下培養(yǎng)4～5 d,切取5 mm×5 mm菌絲塊,貼接于桃果實上,每個果實貼接1個菌絲塊;切取2 mm×2 mm菌絲塊,分別貼接于桃葉片正面和背面,每個葉片貼接4個菌絲塊;室溫(22～24℃)下保濕培養(yǎng)(接菌果實置于盛水的干燥器內保濕培養(yǎng);接菌葉片置于皿徑18 cm的放有濕濾紙的培養(yǎng)皿內保濕培養(yǎng)),每處理9枚果實或葉片(共3個處理:接種于果實、葉片正面和葉片背面),以不接菌為對照。每天觀察發(fā)病情況,對發(fā)病葉片和果實進行病原菌的重分離。

1.5 病原菌形態(tài)特征觀察

觀察描述病菌在自然寄主上的顯微形態(tài)特征和試驗菌株在PDA平板上25℃培養(yǎng)15 d的培養(yǎng)特征,依據病菌形態(tài)特征進行種類鑒定。

1.6 病原菌分子生物學鑒定

取在PD營養(yǎng)液中20～25℃培養(yǎng)7 d的菌株gt-1-1的菌絲,利用Universal Genomic DNA Extraction Kit (大連寶生物工程有限公司)提取總DNA。選用真菌通用引物ITS4(5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和 ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)擴增其ITS基因。反應體系包括10×PCR reaction buffer 2.5 μL,1.5 mmol/L MgCl22 μL,dNTPs (2.5 mmol/L) 1 μL,引物(10 μmol/L)各0.5 μL,TaqDNA聚合酶 (5 U/μL) 0.3 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 16.2 μL。反應條件:94℃預變性3 min;94℃ 30 s,55℃ 45 s,72℃ 1 min,30個循環(huán);72℃延伸10 min,4℃保存。PCR產物經1.0%瓊脂糖電泳檢測。擴增產物回收后,送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結果在http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov數據庫進行Blastn分析。

1.7 病原菌生長溫度測定

設置 5、10、15、20、25、30和35℃ 7 個溫度。菌株gt-1-1和gt-2-2在PSA 平板上25℃黑暗培養(yǎng)14 d后,自菌落邊緣取直徑5 mm的菌餅,接種于 PSA 平板中央,置不同溫度下恒溫黑暗培養(yǎng),3次重復。培養(yǎng)7 d后用十字交叉法測量菌落直徑。在30℃ 和35℃下培養(yǎng)7 d的試驗處理,轉放至20℃繼續(xù)培養(yǎng),15 d后,觀察試驗菌株恢復生長的情況。其余處理連續(xù)培養(yǎng)至15～25 d,觀察不同溫度條件下菌落形態(tài)及產孢情況。

2 結果與分析

2.1 田間病害癥狀

病斑生于果實表面,圓形,褐色,散生,嚴重時相連成片,病斑稍凹陷,有或無紫紅色暈圈,直徑0.5～1.5 cm,病斑上有時可見環(huán)生的黑色粉粒狀分生孢子座(圖1 a～f)。

2.2 病原菌分離

通過對10個病果進行直接鏡檢和病原菌分離,共分離得到20個顯微形態(tài)相近的真菌菌株,病原菌分出率達100%。將顯微形態(tài)一致而菌落形態(tài)不同的gt-1-1和gt-2-2作為代表菌株用于后續(xù)的試驗。

2.3 Koch’s法則證病

在22～24℃下,桃果實和葉片于接種后48 h內顯癥;病斑褐色,近圓形,果實上的病斑略下陷(圖1g～i)。桃果實接種后8 d,病斑直徑最大可達13 mm,發(fā)病率達100%;桃葉片接種后8 d,病斑直徑最大可達12 mm,侵染率16.7%～80.6%,葉背面接種的侵染率高于葉正面。對照未發(fā)病。對發(fā)病組織進行病原菌的再分離,原接種菌的分離率達100%。

圖1 桃果實褐斑病自然發(fā)病癥狀及人工接菌后發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms of peach fruit brown spot caused by Thyrostroma carpophilum in orchards and after inoculation

2.4 病原菌形態(tài)特征

在自然寄主上,病菌分生孢子淡褐色至褐色,聚集時呈黑色,梭形或蠕蟲形,偶見“Y”形孢子,端細胞錐狀或鈍圓,具2～9個橫隔膜,偶見1～2個斜隔膜,分隔處縊縮,孢子大小為(24.68～72.21) μm×(9.36～14.94) μm,平均(53.58±8.95) μm×(12.65±1.15) μm。分生孢子可再育多次,產生新的分生孢子(圖2 a～f)。

病菌在PDA平板,25℃培養(yǎng)15 d,菌落薄氈狀,氣生菌絲近白色至灰黃褐色,菌落邊緣整齊或不齊,分生孢子座散生,菌落背面土黃色至灰褐色;分生孢子形態(tài)與自然寄主上相近,多數孢子具2～4個橫隔膜;頂生或間生于菌絲上的厚垣孢子黃褐色,柱狀,多細胞(圖2g～i)。

病菌形態(tài)特征與Thyrostromacarpophilum(Lév.) B.Sutton [異名:HelminthosporiumcarpophilumLév.;Clasterosporiumcarpophilum(Lév.) Aderh.;Coryneumcarpophilum(Lév.) Jauch;Stigminacarpophila(Lév.) M.B.Ellis;Sciniatosporiumcarpophilum(Lév.) Morgan-Jones;Sporocaduscarpophilus(Lév.) Arx;Wilsonomycescarpophilus(Lév.) Adask., J.M. Ogawa & E.E.Butler;MacrosporiumrhabdiferumBerk.;PassalorabrunaudiiSacc.;CoryneumbeyerinckiiOudem.]形態(tài)特征基本一致[6-7]。

2.5 病原菌分子生物學鑒定

擴增出的ITS序列(GenBank accession:KT002183)測序后(550 bp),BLASTn分析結果表明,該序列與Thyrostromacarpophilum(Genbank accession:HM107423和JN208892)的18S rRNA部分序列、ITS1、5.8S rRNA、ITS2及28S rRNA部分序列同源性達99%,分子生物學鑒定結果與形態(tài)學鑒定結果一致。

依據病菌形態(tài)特征和分子生物學鑒定結果,將甘肅省桃果實褐斑病的病原鑒定為Thyrostromacarpophilum(Lév.) B.Sutton。

圖2 病原菌光學顯微形態(tài)Fig.2 Light micrographs of the pathogen

2.6 病原菌適宜生長溫度測定

試驗菌株菌絲生長的適宜溫度為20℃;30℃基本不生長(菌落不擴展但接種菌塊上可見少許萌動菌絲);35℃不生長。在30℃ 和35℃下培養(yǎng)7 d的試驗處理,轉放至20℃培養(yǎng)15 d:30℃的所有試驗處理均可恢復正常生長;35℃的試驗處理,gt-1-1的3枚菌絲塊均未恢復生長,gt-2-2有1/3的菌絲塊恢復生長。結果見圖3。

圖3 培養(yǎng)溫度對桃果實褐斑病菌的2個菌株菌落 生長的影響(PSA,7 d)Fig.3 Effects of culture temperature on colonial growth of two strains of Thyrostroma carpophilum (PSA, 7 d)

試驗菌株在不同溫度下菌落形態(tài)差異較大:5～15℃培養(yǎng),菌落呈豆沙色至酒紅色;20～25℃培養(yǎng),菌落呈黃褐色至灰褐色。不同菌株,甚至同一菌株的不同重復間,菌落形態(tài)和產孢特性也存在差異。15～25℃培養(yǎng)7～10 d病菌即可大量產生分生孢子,而10℃需培養(yǎng)25 d、5℃需培養(yǎng)54 d病菌方可產孢(5℃和10℃ 培養(yǎng)15 d,部分接種菌絲塊上可產孢)(圖4)。

3 討論

Thyrostromacarpophilum侵染桃樹引起的病害曾被稱為棒盤孢病、穿孔病、皰疹斑病等,最早于1843年發(fā)現于法國,隨后在南、北美洲,非洲,澳大利亞和新西蘭,伊朗發(fā)現[8-9]。其自然寄主均為李屬、桃屬、杏屬植物(PrunusL.,AmygdalusL.,ArmeniacaL.),桃(Amygdaluspersica)、杏(Armeniacavulgaris)、油桃(Amygdaluspersicavar.nectarina)、扁桃(A.communis)、甜櫻桃(P.avium)為其主要寄主,其他已知的寄主還包括歐李(P.domestica)、野生櫻桃(P.serótina,P.virginiana,和Padusracemosa)、桂櫻(P.laurocerasus),及山桃(Amygdalusdavidiana)等[8]。病菌可侵染寄主植物休眠的葉芽、花芽、花、葉、果實及枝條[8]。

圖4 不同培養(yǎng)溫度下菌株gt-1-1和gt-2-2的菌落形態(tài)Fig.4 Colony morphology of Thyrostroma carpophilum strains gt-1-1 and gt-2-2 cultured at different temperatures

關于病害發(fā)生規(guī)律和病菌生物學特性等國外已有較多的研究報道。在美國,枝條和芽的侵染率及在初侵染中的作用在不同寄主上存在差異:在杏樹上,枝條很少被侵染,染病的休眠芽是主要的初侵染源;對桃和油桃樹而言,染病的枝條和芽是同等重要的初侵染源;在扁桃樹上,染病的包含花蕾的短枝(spurs)可能比染病的芽是更為重要的初侵染源;由于在果斑上很少產生分生孢子,因此病果不是主要的初侵染源[8, 10]。在伊朗,不同地區(qū)的T.carpophilum菌株具有高水平的遺傳多樣性;病菌適宜生長溫度為21℃,低于5℃和高于30℃不生長,在PDA、APDA 和MEA培養(yǎng)基上易于產生厚垣孢子[9,11]。

涼爽的溫度和持續(xù)的濕潤(降雨或灌溉)是病害發(fā)生的有利條件,在持續(xù)濕潤的條件下,當溫度低至2.2℃時,病菌24 h就可在寄主組織中定殖,當溫度達到25℃時,只需6 h就能形成侵染[12]。較高的溫度(22℃)比低溫(15℃和8℃)條件下,葉片上的病斑更易脫落形成穿孔癥狀[13]。

在我國的甘肅、新疆、河北、河南、吉林、四川、安徽、湖北、江蘇等省區(qū),該病菌(嗜果刀孢菌Clasterosporiumcarpophilum(Lév.) Aderh.)記載生于桃、杏、李等李屬植物上[14],可危害葉片、果實和枝梢[15]。從我們的研究結果來看,甘肅桃果實褐斑病菌的適宜生長溫度及最高生長溫度與分離自美國、伊朗和羅馬尼亞的菌株相近[7, 11, 16];病害發(fā)生特點與國外已有報道存在差異,如在果實上較易產生分生孢子。

保存于PDA和PSA試管斜面上(以聚丙烯薄膜封口)的試驗菌株,在室溫(15～30℃)和低溫(5～10℃)條件下貯存7個月即死亡,試驗菌株的意外死亡影響了試驗的完整性。

病菌在自然條件下的存活時間和初侵染源有待于今后的試驗研究。在病區(qū)進一步開展病害發(fā)生規(guī)律的研究,對有效地進行病害防治,減輕病害損失具有積極作用。

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(責任編輯：田 喆)

Identification of the pathogen of the brown spot of peach fruit in Gansu, China

He Suqin1, Bai Bin2, Wen Zhaohui3, Jing Zhuoqiong1

(1. Institute of Plant Protection, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070, China; 2. Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology, Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730070, China; 3. Gansu Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Lanzhou 730020, China)

In recent years, the brown spot disease of peach fruit has caused serious damages in Lanzhou area and Lintao County in central Gansu Province, and diseased fruit incidences were more than 70% in peach orchards without control measures. Through the pathogen isolation and culture, the disease was confirmed by Koch’s rule, and based on the morphological and molecular identification (GenBank accession no. KT002183), the pathogen was identified asThyrostromacarpophilum(Lév.) B.Sutton. On the fruits, lesions were brown, circular, scattered, slightly concaved, 0.5-1.5 cm in diameter, sometimes with visible black powdery sporodochia and circle on the surface of lesions. Conidia were light brown to brown, black in mass, fusiform or silkworm-shaped, with tapering or obtuse terminal cells, 2-9 dark transverse septa and occasionally 1-2 oblique septa, usually constricted at septa; they were (24.68-72.21)μm×(9.36-14.94)μm in size, (53.58±8.95)μm×(12.65±1.15)μm on average. The optimum growth temperature of the pathogen was 20℃; almost no growth was observed at 30℃, and part of the cultures were dead when cultured for 7 d at 35℃.

Amygdaluspersica; brown spot of peach fruit;Thyrostromacarpophilum; morphological character; ITS sequence

2015-11-09

2015-12-23

S 436.61

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.05.008

* 通信作者 E-mail：gshesuqin@sina.com