易汪雪, 宋紹祎, 吳東妮, 代歡歡, 楊翠云, 于 翠*

(1. 上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心, 上海 200135; 2. 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院, 上海生命科學(xué)信息中心, 上海 200031; 3. 合肥師范學(xué)院, 合肥 230601)

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實驗方法與技術(shù)ExperimentalMethod&Technology

單管多重RT-PCR同時檢測大豆種子中三種檢疫性植物病毒

易汪雪1, 宋紹祎1, 吳東妮2, 代歡歡3, 楊翠云1, 于 翠1*

(1. 上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心, 上海 200135; 2. 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院, 上海生命科學(xué)信息中心, 上海 200031; 3. 合肥師范學(xué)院, 合肥 230601)

我國大豆年進口量持續(xù)增長,快速、準(zhǔn)確地檢測進境大豆種子中可能攜帶的病原物是防止檢疫性有害生物入境傳播和擴散的有效手段。菜豆莢斑駁病毒(BPMV)、煙草環(huán)斑病毒(TRSV)和番茄環(huán)斑病毒(ToRSV)均是被大豆種子攜帶的檢疫性有害生物。本研究建立了在單一PCR管中同時檢測這3種檢疫性植物病毒及大豆內(nèi)源基因Bd-30 K的多重RT-PCR方法。研究結(jié)果表明,所建立的多重RT-PCR方法具有較好的特異性和靈敏度,檢測含BPMV、TRSV和ToRSV RNA的最低濃度分別為0.45、0.0093和0.004 ng/μL,從大豆種子中同時檢測3種病毒的最低RNA濃度為0.58 ng/μL。

菜豆莢斑駁病毒; 煙草環(huán)斑病毒; 番茄環(huán)斑病毒; 多重RT-PCR; 同時檢測

RT-PCR技術(shù)是當(dāng)前口岸檢疫性病毒檢測的重要手段之一,具有準(zhǔn)確、快速、靈敏、操作簡單和經(jīng)濟實用等優(yōu)點。盡管已有利用多重PCR技術(shù)對數(shù)種植物病毒同時檢測的研究報道[4-6],但這些研究所用的試驗樣品多為感病葉片材料,在國內(nèi)尚未見直接從大豆種子中同時檢測多種檢疫性植物病毒的報道。為了應(yīng)對國際貿(mào)易中快速、準(zhǔn)確地對多種檢疫性植物病毒同時檢測的需要,我們開展了從大豆種子中同時檢測BPMV、TRSV和ToRSV的檢測方法研究,同時為控制整個試驗過程,我們設(shè)置了大豆內(nèi)源基因Bd 30K作為內(nèi)控對照。本文報道單管多重RT-PCR同時檢測這3種檢疫性植物病毒的方法。

1 材料和方法

1.1 供試材料

帶有BPMV的大豆由上海出入境檢驗檢疫局口岸截獲。TRSV和ToRSV毒源由實驗室保存,在隔離檢疫溫室中將兩種病毒分別接種大豆幼葉,待其結(jié)籽后獲得。南方菜豆花葉病毒(Southernbeanmosaicvirus,SBMV)和花生矮化病毒(Peanutstuntvirus,PSV)作為特異性對照,購自Agdia公司,于實驗室-20 ℃冰箱保存。

1.2 引物的設(shè)計

根據(jù)GenBank發(fā)表的TRSV(GenBank登錄號:AF461163,AY363727,AY787756,L09205,NC-005096)和ToRSV(GenBank登錄號:AF135407,AB451183,FJ577795,EF370299和NC-003839)CP基因的序列保守區(qū)分別設(shè)計特異性引物,BPMV和大豆內(nèi)源基因Bd 30K的引物按照文獻[7-8],均由上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成。引物的序列及擴增片段的長度見表1。

表1 檢測BPMV、TRSV、ToRSV和大豆內(nèi)源基因 Bd 30K的引物序列及擴增長度Table 1 Sequences of primers used for PCR detection of BPMV, TRSV, ToRSV and Bd 30K

1.3 RNA提取

將攜帶BPMV、TRSV、ToRSV及健康的大豆種子粉碎成大豆粉后,分別稱取60 mg,利用Tiangen公司的RNAprep植物總RNA提取試劑盒提取總RNA,用于建立單個病毒及內(nèi)源基因RT-PCR方法。

準(zhǔn)確地表征涂層界面性能是了解界面性質(zhì)并進而控制和改善最重要的基礎(chǔ)之一，但由于界面通常受界面斷裂韌性和應(yīng)力狀態(tài)等較多因素的影響，迄今為止對涂層界面的結(jié)合強度還沒有標(biāo)準(zhǔn)的測定方法?？梢灶A(yù)料，隨著現(xiàn)代測定方法和噴涂設(shè)備的改進人們對涂層界面的認(rèn)識將不斷深化，并用于指導(dǎo)和控制界面和材料性能，達到提高界面結(jié)合強度的目的，以滿足不同使用條件的要求。

分別稱取30 mg攜帶BPMV、TRSV、ToRSV的大豆粉,兩兩混合后,利用Tiangen公司的RNAprep植物總RNA提取試劑盒提取總RNA,用于建立雙重RT-PCR方法。

分別稱取20 mg攜帶BPMV、TRSV、ToRSV的大豆粉,三者混合后,利用Tiangen公司的RNAprep植物總RNA提取試劑盒提取總RNA。用于建立3種病毒的三重RT-PCR方法及3種病毒和大豆內(nèi)源基因Bd 30K的四重RT-PCR方法。

1.4 cDNA第一鏈的合成

單一反應(yīng)cDNA的合成:每種病毒各自進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系:2 μL模板RNA、1 μL AMV反轉(zhuǎn)錄酶(10 U/μL,Promega)、0.25 μL RNase抑制劑(40 U/μL,Promega)、0.5 μL下游引物(20 μmol/L)、4 μL dNTPs(各2.5 mmol/ L)和5 μL 5×AMV buffer,加水補足25 μL。

雙重和多重反應(yīng)cDNA的合成:提取含混合病毒樣本的總RNA,在單一管中進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系同單一反應(yīng)cDNA的合成,但需同時加入合成相應(yīng)病毒cDNA的下游引物。

1.5 PCR檢測

單一PCR檢測:分別完成3種病毒和內(nèi)源基因Bd 30K的PCR檢測。PCR檢測體系:cDNA 1 μL、10×buffer (含Mg2+) 3 μL、dNTPs (2.5 mmoL/L) 4 μL、上下游引物(20 μmoL/L)各0.25 μL、rTaq0.25 μL,滅菌水補足30 μL。PCR條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,55℃復(fù)性45 s,72℃延伸45 s,35個循環(huán);72℃ 7 min后保存于4℃。

雙重和多重PCR:在同一管中完成雙重或多重PCR反應(yīng)。其反應(yīng)體系和條件基本同單一PCR檢測,但在添加引物時,需同時加入擴增相應(yīng)目的基因的引物,如檢測內(nèi)源基因,其引物濃度為病毒引物濃度的2倍。

1.6 引物的特異性試驗

分別提取帶有BPMV、TRSV、ToRSV的大豆粉總RNA,侵染大豆的SBMV、PSV陽性對照RNA,及健康大豆種子的總RNA,以BPMV、TRSV、ToRSV及Bd 30K引物分別進行擴增,檢測4對引物的特異性。

1.7 PCR檢測靈敏度

將分別攜帶BPMV、TRSV、ToRSV的大豆總RNA和健康的大豆總RNA,利用分光光度計測定總RNA的濃度分別為0.045、0.093、0.004和0.19 μg/μL。將提取的總RNA進行10倍梯度稀釋,用于單一病毒RT-PCR靈敏度測定。

將同時含有3種病毒的大豆總RNA(濃度為0.058 μg/μL)進行10倍梯度稀釋,用于四重RT-PCR靈敏度測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR檢測的特異性

分別從攜帶BPMV、TRSV、ToRSV及健康的大

豆種子中提取總RNA進行反轉(zhuǎn)錄后,以設(shè)計的特異引物對其RT-PCR檢測,結(jié)果均能擴增出預(yù)期大小的DNA條帶,而從南方菜豆花葉病毒(圖1)、花生矮化病毒、健康大豆中未能擴增到病毒特異條帶(圖片未顯示),表明針對BPMV、TRSV、ToRSV設(shè)計的引物特異性好。

圖1 BPMV、TRSV、ToRSV和Bd 30K引物特異性的檢測Fig.1 Specificity of primers for detection of BPMV, TRSV, ToRSV and Bd 30K in soybean seeds

2.2 雙重和多重RT-PCR檢測結(jié)果

將攜帶BPMV、TRSV、ToRSV的大豆種子兩兩混合和三者混合后提取總RNA進行反轉(zhuǎn)錄,以相應(yīng)引物進行雙重或多重PCR反應(yīng),結(jié)果每個雙重RT-PCR反應(yīng)都能擴增到2條預(yù)期大小的DNA條帶(見圖2a),在三重RT-PCR中均能擴增出3條預(yù)期大小的DNA條帶(見圖2b),在四重RT-PCR中能擴增出BPMV、TRSV、ToRSV和內(nèi)源基因的特異性片段(見圖2c)。多重RT-PCR均能擴增出目的片段,為在實踐中進行病毒的檢測節(jié)省了成本和時間,同時以內(nèi)源基因作為參照,避免了假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。

圖2 兩重、三重和四重RT-PCR的建立Fig.2 Development of multiplex RT-PCR

2.3 單一RT-PCR與多重RT-PCR靈敏度比較

將提取的含單一病毒的RNA、混合病毒RNA及健康大豆RNA按10倍梯度稀釋后反轉(zhuǎn)錄成cDNA進行單一和多重RT-PCR靈敏度檢測。結(jié)果表明隨著RNA含量的逐漸減少,擴增條帶也越來越弱。當(dāng)含有BPMV、TRSV、ToRSV和Bd 30K的RNA分別稀釋至10-2、10-4、10-3和10-2時,條帶開始變?nèi)?圖3a～d),即單一RT-PCR檢測BPMV、TRSV、ToRSV和Bd 30K RNA最低濃度分別是0.45、0.009 3、0.004和1.9 ng/μL。含有3種病毒及大豆內(nèi)源基因的RNA稀釋低于10-2時,則只能擴增TRSV的特異性條帶,及多重RT-PCR檢測的最低濃度為 0.58 ng/μL(圖3e)。

圖3 單一RT-PCR和多重RT-PCR檢測靈敏度測定Fig.3 Sensitivity of detection for BPMV, TRSV, ToRSV and Bd 30K by single RT-PCR and multiplex RT-PCR

3 討論

此前針對大豆攜帶病毒的檢測已有較多的分子檢測方法研究[9-10],但大多是針對單一病毒研究建立RT-PCR或?qū)崟r熒光RT-PCR方法。進境大豆主要是以種子的形式入境,所以針對種子建立快速、靈敏的檢測方法是既實現(xiàn)快速通關(guān)又防止檢疫性有害生物傳播的有效途徑。但由于病毒在種子中的含量很低且分布不均勻,建立多重RT-PCR檢測方法需要從RNA提取、引物配對篩選等方面進行優(yōu)化。同時在對樣品的檢測過程中,極有可能造成假陰性的結(jié)果。因此我們在設(shè)計多重RT-PCR試驗時,以大豆的一個內(nèi)源基因作為參照,以保證整個PCR過程正確,防止由于操作失誤引起假陰性結(jié)果。

盡管多重實時熒光RT-PCR檢測的靈敏度更高,在醫(yī)學(xué)檢測上也有采用三重以上的實時熒光RT-PCR方法[11-12],此前我們也建立過雙重實時熒光RT-PCR方法,靈敏度高[13],操作簡便,但如果在此試驗中再增加一種病毒,其靈敏度會顯著下降。此外,多重實時熒光RT-PCR方法還需在探針上標(biāo)記不同的熒光集團,費用較高,保存期限短,因此采用多重RT-PCR方法是一種滿足口岸實際檢測需求的方法。本研究利用4對特異性引物,在一次RT-PCR反應(yīng)中擴增出病毒BPMV(275 bp)、TRSV(580 bp)、ToRSV(794 bp)及內(nèi)源基因Bd 30K(104 bp)的特異性片段,建立了BPMV、TRSV、ToRSV、Bd 30K的四重PCR檢測方法,結(jié)果表明該方法的特異性和靈敏度能達到檢測要求,比單項檢測減少了70%左右的時間和2/3左右的試劑,對這3種植物病毒的鑒別診斷和混合感染檢測具有重要的應(yīng)用價值。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Simultaneous detection of three quarantine plant viruses from soybean seeds by multiplex RT-PCR in single PCR tube

Yi Wangxue1, Song Shaoyi1, Wu Dongni2, Dai Huanhuan3, Yang Cuiyun1, Yu Cui1

(1. Technical Center for Animal, Plant and Food Inspection and Quarantine, Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China; 2. Shanghai Information Center for Life Sciences, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200031, China; 3. Hefei Normal College, Hefei 230601, China)

The quantity of soybean seeds imported were continually increased in recent years. Rapid detection of seed-borne pathogens is essential to efficiently prevent pest invading and spreading.Beanpotmosaicvirus(BPMV),Tobaccoringspotvirus(TRSV) andTomatoringspotvirus(ToRSV) are the quarantine pest which could be carried by the soybean seeds. We developed the multiplex RT-PCR approach for simultaneous detection of BPMV, TRSV, ToRSV and one endogenous gene Bd 30K in the single PCR tube from soybean seeds. The results indicated that good specificity and sensitivity for simultaneous detection were obtained. The limit detection of RNA with BPMV, TRSV and ToRSV were 0.45 ng/μL, 0.009 3 ng/μL and 0.004 ng/μL, respectively. The limit detection of RNA with three viruses mixture was 0.58 ng/μL.

Beanpodmottlevirus;Tobaccoringspotvirus;Tomatoringspotvirus; multiplex RT-PCR; simultaneous detection

2015-11-06

2015-12-24

上海市科技興農(nóng)重點攻關(guān)項目[滬農(nóng)科攻字(2012)第2-8號]；上海出入境檢驗檢疫局科研項目(HK005-2014)

S 435.651,S 432.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.05.019

* 通信作者 E-mail：yuc@shciq.gov.cn