馬 旸，韓陳陳，李亦凡，汪 揚，魏 偉

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◇技術(shù)與方法◇

pIRES-EGFP-GRK2-S670A突變質(zhì)粒真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)

馬 旸，韓陳陳，李亦凡，汪 揚，魏 偉

GRK2-S670A突變體導(dǎo)入pIRES-EGFP真核表達(dá)載體，為尋找GRK2 磷酸化GPCR的位點提供研究基礎(chǔ)。利用PCR定點突變試劑盒，獲得pGEM-T-GRK2-S670A，用SalI/ApaI分別對pGEM-T-GRK2-S670A和EGFP-C3雙酶切，構(gòu)建EGFP-C3-GRK2-S670A，SalI/BamHI雙酶切EGFP-C3-GRK2-S670A和pIRES-EGFP，得到pIRES-EGFP-GRK2-

pIRES-EGFP-GRK2-S670A突變質(zhì)粒；重組質(zhì)粒；細(xì)胞轉(zhuǎn)染

G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(Gprotein-coupledreceptorkinase2，GRK2)在G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupledreceptors，GPCRs)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用[1]。GRK2結(jié)構(gòu)域中不同的磷酸化位點影響GRK2的活性和功能[2-3]。MAPK磷酸化GRK2的Ser670，抑制GRK2 活性[4]，調(diào)節(jié)GPCR的脫敏和內(nèi)化，在心力衰竭、高血壓、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[5-7]。研究[8]表明，GRK2在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的免疫細(xì)胞和滑膜細(xì)胞中高表達(dá)，芍藥苷(Paeoniflorin，Pae)可以下調(diào)GRK2的活性。因此GRK2作為心衰、高血壓、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的治療靶點，為靶向藥物的研發(fā)提供了新的方向。為了探討藥物作用GRK2的活性位點，該研究構(gòu)建了pIRES-EGFP-GRK2-S670A突變質(zhì)粒真核表達(dá)載體，并使其在HEK293細(xì)胞中成功表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 E.coliDH5α菌株為安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理所保存；pIRES-EGFP載體、pEGFP-C3載體購自上海北諾生物科技有限公司；pGEM-T-GRK2-wt質(zhì)粒為本課題組前期構(gòu)建。

1.1.2 試劑和儀器 定點突變試劑盒、PrimerStarDNA聚合酶、SalI、BamHI、DNAMarkerDL10 000(美國Takara公司)；ApaI(美國ThermoScientific公司)；T4DNA連接酶(美國Promega公司)；Lipofectamine3000Reagent(美國Invitrogen公司)；膠回收試劑盒(中國TIANGEN公司)； 質(zhì)粒小提試劑盒(美國OmegaBio-Tek公司)；小鼠抗人GRK2 抗體(美國Abcam公司)；PCR擴(kuò)增儀(美國BIO-RAD公司)；Tanon1600全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；IX-70熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；2306-2型CO2培養(yǎng)箱(美國SHELLAB公司)。

1.2 方法

1.2.2pGEM-T-GRK2-S670A質(zhì)粒的獲取 以pGEM-T-GRK2-wt為模板，利用導(dǎo)入變異點的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)后，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行末端平滑化及5′磷酸(P)化處理，再用高效連接試劑LigationSolutionI進(jìn)行自身連接(環(huán)化反應(yīng))，然后轉(zhuǎn)化、提取突變體DNA，即pGEM-T-GRK2-S670A。

1.2.3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-EGFP-GRK2-S670A的構(gòu)建EGFP-C3載體和pGEM-T-GRK2-S670A質(zhì)粒經(jīng)SalI、ApaI雙酶切，凝膠回收，在T4DNA連接酶作用下，連接EGFP-C3與GRK2-S670A，4 ℃連接過夜。經(jīng)過轉(zhuǎn)化、篩選、擴(kuò)增，質(zhì)粒提取，酶切鑒定，獲得EGFP-C3-GRK2-S670A突變質(zhì)粒。再將pIRES-EGFP載體和EGFP-C3-GRK2-S670A突變質(zhì)粒經(jīng)SalI、BamHI雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化、篩選、擴(kuò)增，質(zhì)粒提取，酶切鑒定，獲得pIRES-EGFP-GRK2-S670A突變質(zhì)粒。

1.2.4HEK293細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞培養(yǎng)于含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng) 。消化細(xì)胞后，于6孔板內(nèi)接種2×105個細(xì)胞，待細(xì)胞長至80%～90%進(jìn)行轉(zhuǎn)染 。轉(zhuǎn)染方法根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書提供的操作步驟進(jìn)行。

1.2.5 蛋白提取與Westernblot檢測 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，收集并清洗細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min，4 ℃、13 200r/min離心15min，吸取上清液加入上樣緩沖液，混勻后沸水浴中煮10min，經(jīng)過上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等操作后，用GRK2抗體，4 ℃孵育過夜，第2天經(jīng)過洗膜和二抗敷育后置于ImageQuantLAS4000熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光成像。

2 結(jié)果

2.1pGEM-T-GRK-S670A的擴(kuò)增 以pGEM-T-GRK2-wt質(zhì)粒為模板，以GRK2-670上游引物、GRK2-670下游引物PCR擴(kuò)增后，1%瓊脂糖電泳結(jié)果表明，產(chǎn)物條帶均與預(yù)期的大小一致，即線性pGEM-T-GRK-S670A目的片段(約5 000bp)，見圖1A。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠的回收產(chǎn)物(圖1B)進(jìn)行末端平滑化及5′磷酸化處理，再用高效連接試劑LigationSolutionI進(jìn)行自身連接(環(huán)化反應(yīng))，經(jīng)雙酶切初步鑒定，得到線性GRK-S670A片段(2 067bp)和線性pGEM-T片段(3 015bp)，見圖1C。

2.2pEGFP-C3-GRK2-S670A突變質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 將pGEM-T-GRK2-S670A突變質(zhì)粒和pEGFP-C3載體用SalI和ApaI行雙酶切，1%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測，切膠回收，得到線性GRK-S670A片段(2 067bp)和線性pEGFP-C3 片段(4 700bp)。將構(gòu)建的pEGFP-C3-GRK2-S670A突變質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，得到2 067bp的GRK-S670A片段和4 700bp的線性pEGFP-C3 片段，見圖2。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及酶切鑒定

M：Marker；A：pGEM-T-GRK-S670APCR擴(kuò)增產(chǎn)物；1：PCR擴(kuò)增的線性pGEM-T-GRK-S670A；B：PCR產(chǎn)物(pGEM-T-GRK-S670A)切膠回收；1：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收得到的線性pGEM-T-GRK-S670A；C：PCR產(chǎn)物(pGEM-T-GRK-S670A)雙酶切鑒定；1：SalI和ApaI雙酶切pGEM-T-GRK-S670A質(zhì)粒

圖2 pEGFP-C3-GRK2-S670A重組突變質(zhì)粒的酶切及鑒定

M:Marker;A：pGEM-T-GRK-S670A質(zhì)粒和pEGFP-C3質(zhì)粒雙酶切回收產(chǎn)物；1、2：SalI和ApaI雙酶切pGEM-T-GRK-S670A突變質(zhì)粒，切膠回收；3、4：SalI和ApaI雙酶切pEGFP-C3載體，切膠回收；B：pEGFP-C3-GRK2-S670A重組突變質(zhì)粒雙酶切鑒定；1、2、3、4：SalI和ApaI雙酶切pEGFP-C3-GRK2-S670A突變質(zhì)粒

2.3pIRES-EGFP-GRK2-S670A突變質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 將EGFP-C3-GRK2-S670A突變質(zhì)粒和pIRES-EGFP載體用SalI和BamHI進(jìn)行雙酶切后，得到線性GRK-S670A片段(2 067bp)和pIRES-EGFP片段(5 200bp)，見圖3A。將構(gòu)建的pIRES-EGFP-GRK2-S670A突變質(zhì)粒，經(jīng)SalI/BamHI雙酶切鑒定，得到線性GRK-S670A片段(2 067bp的)和線性pIRES-EGFP片段(5 200bp)，見圖3B，基因測序結(jié)果經(jīng)過序列比對正確，表明載體構(gòu)建成功。

圖3 pIRES-EGFP-GRK2-S670A重組突變質(zhì)粒的酶切及鑒定

M:Marker;A：pEGFP-C3-GRK2-S670A質(zhì)粒和pIRES-EGFP質(zhì)粒雙酶切回收產(chǎn)物；1：SalI和BamHI雙酶切pEGFP-C3-GRK2-S670A，切膠回收；2：SalI和BamHI雙酶切pIRES-EGFP，切膠回收；B：pIRES-EGFP-GRK2-S670A重組突變質(zhì)粒酶切鑒定；1、2：SalI和BamHI雙酶切pIRES-EGFP-GRK2-S670A突變質(zhì)粒

2.4 熒光顯微鏡觀察pIRES-EGFP-GRK2-S670A重組蛋白表達(dá) 在6孔板中接種人源HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pIRES-EGFP-GRK2-wt和pIRES-EGFP-GRK2-S670A重組突變質(zhì)粒，培養(yǎng)48h后，在熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光蛋白的表達(dá)，見圖4。

圖4 熒光顯微鏡下觀察重組質(zhì)粒的表達(dá) ×40

A：重組質(zhì)粒pIRES-EGFP-GRK2-wt轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48h；B：pIRES-EGFP-GRK2-S670A突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48h

2.5Westernblot法檢測pIRES-EGFP-GRK2-S670A重組蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染空載體pIRES-EGFP-ctr、pIRES-EGFP-GRK2-wt和pIRES-EGFP-GRK2-S670A到HEK293細(xì)胞48h后，Westernblot結(jié)果表明轉(zhuǎn)染GRK2-wt和GRK2-S670A的質(zhì)?？梢奅GFP-GRK2重組蛋白表達(dá)，同時由于使用GRK2的抗體進(jìn)行檢測，結(jié)果中也同時可見內(nèi)源GRK2的表達(dá)。見圖5。

圖5 Western blot法檢測GRK2的重組蛋白在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)

A：pIRES-EGFP-GRK2-wt；B：pIRES-EGFP-GRK2-S670A；C：pIRES-EGFP-ctr

3 討論

人源GRK2由689個氨基酸殘基組成，有3個重要的結(jié)構(gòu)域：N末端、催化結(jié)構(gòu)域、C末端[9]。N末端約有185個氨基酸組成的結(jié)構(gòu)域，可以結(jié)合Gα/11、Gβγ、小窩蛋白、鈣調(diào)蛋白等，含有蛋白激酶C(PKC)的磷酸化位點(Ser29)[10]及c-Src的磷酸化位點(Tyr19、86、92)[11]；催化結(jié)構(gòu)域約有270個氨基酸組成，有S-亞硝基化位點(Cys340)以及決定GRK2催化活性的重要位點(Lys220)[12]；C末端約有230個氨基酸組成，可以結(jié)合PI3K、AKT、PIP2、鈣調(diào)蛋白等，含有細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)的磷酸化位點(Ser670)及蛋白激酶A(PKA)的磷酸化位點(Ser685)。GRK2 的Cys340發(fā)生S-亞硝基化可抑制GRK2的活性[13]，ERK磷酸化GRK2的Ser670也可抑制GRK2的活性[4]，而PKA磷酸化GRK2的Ser685可促進(jìn)GRK2的活化[14]。對參與GRK2活性的主要位點進(jìn)行點突變，構(gòu)建相應(yīng)的突變質(zhì)粒并在真核細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，對于探討小分子化合物影響GRK2活性的機(jī)制有主要實驗價值。

定點突變技術(shù)是分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)工程中常用的重要技術(shù)之一，是體外特異性取代、插入或缺失DNA序列中任何一個特定堿基的技術(shù)。通過定點突變技術(shù)可以有目的地改變DNA序列中的堿基，使之符合應(yīng)用需求。常用方法有盒式取代誘導(dǎo)、常寡核苷酸引物誘變及PCR定點誘變等。PCR定點誘變因具有突變效率高、簡便快捷、成本低及可在任何位點引入突變的優(yōu)點，是DNA靶片段產(chǎn)生突變的首選方法。根據(jù)PCR定點誘變的技術(shù)原理，本課題組針對GRK2，分別設(shè)計帶有突變堿基的誘變引物，以pGEM-T-GRK-wt為模板，通過雙酶切成功獲得了GRK2-S670A突變體的cDNA片段，再將這些突變的cDNA片段分別連pIRES-EGFP中，其中重組突變質(zhì)粒pIRES-EGFP-GRK2-S670A轉(zhuǎn)染入真核細(xì)胞以表達(dá)帶有綠色熒光蛋白標(biāo)記的GRK2 突變體。本實驗將pIRES-EGFP-GRK2-wt和pIRES-EGFP-GRK2-S670A突變質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞后培養(yǎng)48h，熒光顯微鏡觀察顯示野生型與突變型在細(xì)胞定位方面并無明顯差異，兩者均為全細(xì)胞分布。Westernblot檢測顯示，重組蛋白與內(nèi)源蛋白比較，條帶位置略有升高，這是因為重組蛋白的分子量多出一個EGFP的分子量。

綜上所述，pIRES-EGFP-GRK2-S670A突變質(zhì)粒真核表達(dá)載體的成功構(gòu)建及其在HEK293細(xì)胞中成功表達(dá)，將為探討藥物作用GRK2的活性位點奠定基礎(chǔ)。

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Construction and expression of the eukaryotic expressing vector of pIRES- EGFP- GRK2- S670 A mutants recombinant plasmids

MaYang,HanChenchen,LiYifan,etal

(Institute of Clinical Pharmacology, Anhui Medical University,Key Laboratory of Anti-inflammatory and Immune Medicine, Ministry of Education, Anhui Collaborative Innovation Center of Anti-inflammatory and Immune Medicine, Hefei 230032)

TheS670AmutationofGRK2wasimportedtothepIRES-EGFPeukaryoticexpressionvector,providingresearchfoundationofGRK2phosphorylationGPCRsite(s).TaKaRamutanBESTKitwasadoptedtoobtainpGEM-T-GRK2-S670A.pGEM-T-GRK2-S670AandEGFP-C3plasmidsweredouble-digestedbySalI/ApaI,toconstructEGFP-C3-GRK2-S670Aplasmid.ThenEGFP-C3-GRK2-S670AandpIRES-EGFPweredouble-digestedbySalI/BamHI,inordertobuildacompleteeukaryoticexpressionplasmidpIRES-EGFP-GRK2-S670A.TheplasmidwastransfectedinHEK293cellsandrecombinantproteinwasdetectedwithfluorescencemicroscopeandWesternblotassays.TheresultsofdigestionandDNAsequencingoftheplasmidwerecorrect,eukaryoticexpressedvectorpIRES-EGFP-GRK2-S670Amutantrecombinantplasmidwassuccessfullyconstructed,andtherecombinantproteinwasexpressedinHEK293celllinesaftercelltransfection,whichmaybethefoundationofthefollowingresearch.

IRES-EGFP-GRK2-S670Amutantsplasmids;recombinantplasmids;celltransfection

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.034.html

2016-05-30接收

國家自然科學(xué)基金(編號：81502123、81330081)；安徽省自然科學(xué)基金(編號：1308085QH130)；安徽省高等學(xué)校省級自然科學(xué)研究項目(編號：KJ2014A119)

安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所、抗炎免疫藥物教育部重點實驗室、抗炎免疫藥物安徽省協(xié)同創(chuàng)新中心，合肥 230032

馬 旸，女，博士，講師；

魏 偉，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wwei@ahmu.edu.cn

S670A。將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察和Westernblot法檢測融合蛋白的表達(dá)。酶切鑒定顯示pIRES-EGFP-GRK2-S670A質(zhì)粒條帶大小符合，測序結(jié)果正確，成功構(gòu)建pIRES-EGFP-GRK2-S670A真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞后可見融合蛋白表達(dá)，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

R394.112；R394.34

A

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.034