李劍靜 植枝林 李軍 潘艷

（1，廣西岑溪市動物疫病預防控制中心 543200；2，廣西獸醫(yī)研究所 530001；3，廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室 530001）

豬源彭氏變形桿菌分離鑒定及藥敏試驗

李劍靜1植枝林1李軍2，3潘艷2，3

（1，廣西岑溪市動物疫病預防控制中心 543200；2，廣西獸醫(yī)研究所 530001；3，廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室 530001）

以患子宮炎的后備母豬的膿性分泌物為樣本，進行病原菌分離，通過培養(yǎng)特性試驗、生化試驗、16S rRNA同源性比對和小鼠致病性試驗，鑒定其中的一株優(yōu)勢菌為具有一定致病力的彭氏變形桿菌。24種常用抗菌藥物體外藥敏試驗結果顯示，該菌對頭孢曲松、頭孢噻呋、氧氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考敏感，對阿莫西林、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、阿米卡星、卡那霉素、林可霉素、大觀霉素、替米考星等藥物耐藥。

豬子宮炎；彭氏變形桿菌；分離鑒定；藥敏試驗

彭氏變形桿菌（Proteus penneri）屬于腸桿菌科變形桿菌屬的革蘭陰性桿菌，是1種條件致病菌，可引起嚴重的疾病，在人醫(yī)臨床上最常見的是引起患者敗血癥、尿路感染及呼吸道感染[1]。據(jù)報道，在人醫(yī)臨床上彭氏變形桿菌的分離率，尿液標本為50%，傷口及軟組織滲出液標本為25%，血液標本為15%[2-4]。彭氏變形桿菌在畜牧業(yè)上的報道相對較少，已有的報道顯示，該菌可感染對蝦和蛇[5-6]，并且在魚類食品加工過程中容易造成污染，人們食用后可引起感染[7-8]，該菌在食品衛(wèi)生檢測中具有重要意義。然而，查閱現(xiàn)有的文獻顯示，彭氏變形桿菌在家畜上引起的疾病鮮有報道。

2016年3月廣西某中小規(guī)模場后備母豬散發(fā)子宮內膜炎，為查明病因，無菌取其膿性分泌物進行病原菌分離鑒定，經過生長特性、生化特性和16S rRNA同源性比對，鑒定其中1株優(yōu)勢菌為彭氏變形桿菌，同時對該分離菌進行了體外藥敏試驗，現(xiàn)將試驗及結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

廣西某中小規(guī)模豬場患子宮炎的母豬，無菌取其膿性分泌物。

1.2 試劑

伊紅美藍培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、MHA培養(yǎng)基購自北京陸橋技術有限公司，兔血培養(yǎng)基購自鄭州安圖綠科生物工程有限公司。革蘭氏染液、微量生化反應管和抗菌藥物敏感試驗紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。Bacteria Genomic DNA Kit、 Es Taq DNA Polymerase、 dNTP、 DNA 分子量標準100bp Ladder、快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京康為世紀生物技術有限公司。

1.3 細菌分離培養(yǎng)和生長形態(tài)觀察

用接種環(huán)無菌取膿性分泌物分別劃線接種于兔血平板、麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h后觀察分離菌在培養(yǎng)基上的生長特性。挑取優(yōu)勢菌進行純培養(yǎng)之后進行革蘭氏染色、鏡檢。

1.4 生化試驗

依據(jù)鏡檢結果，將優(yōu)勢菌純培養(yǎng)物接種于微量生化反應管，按說明書要求的條件培養(yǎng)，并在規(guī)定的時間內觀察結果，參照 《伯杰細菌鑒定手冊》[9]進行結果判定。

1.5 細菌16S rRNA鑒定

細菌16S rRNA擴增采用通用引物1492R和27F[10]，由上海英駿生物技術有限公司合成。經鏡檢的分離菌，取其純培養(yǎng)物，使用細菌DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA，以此作為模板進行PCR擴增，反應體系為：10x Es Taq PCR Buffer 5 ul， dNTP Mix（2.5mM each）4ul， 上下游引物各2ul，模板 DNA 為 6ul， Es Taq DNA Polymerase（5U/ul）0.25ul，RNase-Free Water補足50ul。 反應程序參照陳澤祥[10]進行。PCR擴增產物經電泳后進行目的片段回收純化，送上海英駿生物技術有限公司測序。

1.6 小鼠毒力試驗

用滅菌生理鹽水將受試菌懸液濃度調至1個麥氏比濁管（3×108CFU/ml）。 取健康昆明小鼠 10 只（20.5±1）g 隨機分為試驗組和對照組，每組5只，試驗組小鼠按0.2ml/10g腹腔注射菌液，對照組小鼠按同樣劑量腹腔注射滅菌生理鹽水。正常喂養(yǎng)，連續(xù)7d觀察小鼠的活動、發(fā)病和死亡情況，剖檢死亡小鼠。觀察病變，并取內臟器官進行接種菌回收、鑒定。

1.7 藥敏試驗

藥敏試驗采用NCCLS(2009)[11]推薦的Kirby-Bauer法的方法。用滅菌生理鹽水將受試菌濃度調至1個麥氏比濁管（3×108CFU/ml），取0.2ml均勻涂布于MHA平板，稍靜置待平板吸收菌液后貼標準藥敏紙片，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)20h，用直尺量取各藥敏紙片的抑菌圈，結果判定參照NCCLS(2009)頒布的標準進行。

2 結果

2.1 細菌分離和形態(tài)學觀察

從其中1份樣品分離到1株優(yōu)勢菌，該菌在血平板和伊紅美藍培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為表面光滑、邊緣整齊、扁平、透明、膜狀的小菌落。鏡檢結果為革蘭氏陰性小桿菌。

2.2 生化試驗結果

受試菌不能分解鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶，能分解尿素酶、苯丙氨酸脫氨酶，吲哚陽性，產生H2S，能發(fā)酵葡萄糖和麥芽糖少產氣，不能水解七葉苷。受試菌的生化特性與 《伯杰細菌鑒定手冊》中的彭氏變形桿菌生化特性相符。

2.3 16S rRNA同源性比對結果

將測序獲得分離菌的16S rRNA序列在NCBI網站進行同源性比對，與數(shù)據(jù)庫記載的彭氏變形桿菌（GenBank登錄號:JF775423.1）的16S rRNA序列同源性達98%。

2.4 小鼠致病力試驗

試驗組小白鼠腹腔接種細菌懸液后12h，表現(xiàn)為精神沉郁、呼吸困難，食欲飲欲減退，在24h內出現(xiàn)死亡，連續(xù)飼養(yǎng)7d內，共死亡3只，無菌取死亡小白鼠的心血、肝臟等組織接種于血平板和伊紅美藍平板，分離到與接種菌一樣的細菌。對照組小白鼠表現(xiàn)正常，無死亡。

依據(jù)分離菌的生長形態(tài)、生化特性、16S rRNA同源性比對和小鼠致病力試驗結果，鑒定該分離菌為具有一定致病力的彭氏變形桿菌。

2.5 藥敏結果

體外藥敏試驗結果顯示，受試菌對頭孢曲松、頭孢噻呋、氧氟沙星、恩諾沙星、氟苯尼考敏感，對阿莫西林、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、阿米卡星、卡那霉素、林可霉素、大觀霉素、替米考星等藥物耐藥（附表）。

附表 分離菌的體外藥敏試驗結果

3 討論

（1）母豬子宮炎發(fā)病率高，表現(xiàn)為生殖道流出膿性分泌物、產后無乳或少乳、發(fā)情不及時、屢配不孕、產仔數(shù)低等。引起母豬子宮炎的因素多種多樣，自然因素、人為因素、管理因素、飼料因素和疾病因素均可導致母豬患子宮炎，其中多種疾病可引起豬子宮炎，細菌性感染主要是大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、棒狀桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌等，病毒性感染有細小病毒、偽狂犬病毒、乙型腦炎病毒、藍耳病病毒和圓環(huán)病毒等，呈單一感染和混合感染，以多種病原混合感染為主，本次樣品除了分離出彭氏變性桿菌，還有葡萄球菌和鏈球菌。母豬子宮炎給豬場造成較為嚴重的經濟損失，需引起養(yǎng)豬人的重視，做好防治工作。

（2）彭氏變形桿菌是一種條件致病菌，當動物機體抵抗力下降時可造成感染，通過尿液糞便排放可照成飼養(yǎng)環(huán)境和水體污染，因此加強飼養(yǎng)動物營養(yǎng)水平、提高免疫力，切實做好飼養(yǎng)環(huán)境消毒等管理工作可減少該條件致病菌引起的感染。此外，該菌在食品加工過程中也容易污染食品，如果這些污染的食品在食用前未進行充分加熱，可能會引起食用者感染，應引起關注。

（3）藥敏試驗結果顯示，受試的24種抗菌藥物，彭氏變形桿菌的敏感率為20.8%（5/24）， 中介率8.3%（2/24），耐藥率70.9%（17/24），表明分離到的彭氏變形桿菌已產生較強的耐藥性。細菌耐藥性日益嚴重，與不科學的使用抗菌藥物密不可分，如不必要的預防用藥、沒有依據(jù)的用藥和過量使用藥物。而進行細菌分離和體外藥敏試驗，可為臨床治療用藥提供科學參考，避免了憑經驗亂用抗菌藥物，減少藥物成本，同時能減緩細菌耐藥性的產生。

[1]Malgorzata Siwińskaa,Evgeniya A.Levinac,D,et al.Classification of a Proteus penneri clinical isolate with a unique O-antigen structure to a new Proteus serogroup[J].Carbohydrate Research災olume,2015,407:131-136.

[2]Cantón R,Sánchez-Moreno MP,Morosini Reilly MI.Pro teus penneri[J].Enferm Infecc Microbiol Clin,2006,24(l1):8-13.

[3]Castro ST,Rodríguez CR,Perazzi BE,et al.Comparison of different methods in order to identify Proteus spp.Rev Argent Microbiol,2006,38:119-124.

[4]Krajden S,Fuksa M,Petrea C,et al.Expanded clinical spectrum of infections caused by Proteus penneri[J].J Clin Microbiol.1987,25:578-579.

[5]Cao H,He S,Lu L,et al.Chen B Identification of a Proteus penneri isolate as the causal agent of red body disease of the cultured white shrimp Penaeus vannamei and its control with Bdellovibrio bacteriovorus[J].Antonie災an Leeuwenhoek.2014,105(2):423-430.

[6]趙成堅.蛇源細菌的分離與鑒定[M].廣西大學碩士，2013.

[7]鄭瑞生,陳涼涼,肖熙.熟制鮑魚殘留細菌的分離及16S rDNA鑒定[J].食品科學技術學報，2013,31（4）:32-36.

[8]郭全友,何木,李保國,等.大黃魚腐敗細菌鑒定及PLFAs初級模型的建立[J].現(xiàn)代食品科技，2015,31（12）:227-234.

[9]布坎南R E，吉本斯N E.伯杰細菌鑒定手冊[M].8版.北京：科學出版社，1984:667-675.

[10]陳澤祥,潘艷,禤雄標,等.鴨疫里氏桿菌廣西分離株16S rRNA基因序列的測定和系統(tǒng)進化分析[J].廣西農業(yè)科學，2007,38(2):205-208.

[11]National Committee for Clinical Laboratoray Standards.Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals approved standard[M].2nd.Wayne,Pa.NCCLS,2009:47-55.

廣西自然科學基金項目（2014GXNSFAA118119），廣西科學研究與技術開發(fā)計劃（桂科重14121003-3-1）。

李劍靜（1977-），女，廣西岑溪市人，本科，獸醫(yī)師，研究方向：動物疫病防控。

潘艷（1978-），女，廣西南寧市人，博士，副研究員，研究方向：家畜傳染病與分子生物學。