楊卓

（1.遼寧省大連市動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 大連 116037；2.遼寧省大連市畜牧總站，遼寧 大連 116037）

LAMP研究中的常見問題分析及解決方法

楊卓1，2

（1.遼寧省大連市動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 大連 116037；2.遼寧省大連市畜牧總站，遼寧 大連 116037）

本文通過《小反芻獸疫病毒RT-LAMP快速檢測和鑒別方法的建立》研究中的相關(guān)擴(kuò)增曲線和試驗(yàn)結(jié)論，對LAMP研究中出現(xiàn)的幾種問題進(jìn)行了初步探討，并提出解決方案。文章從氣溶膠污染、非特異性擴(kuò)增、擴(kuò)增效率不高和擴(kuò)增曲線常見問題分析等方面，分析其產(chǎn)生原因并總結(jié)了相關(guān)解決辦法，從而為今后的LAMP技術(shù)研究和推廣做出貢獻(xiàn)。

LAMP技術(shù)；氣溶膠污染；非特異性擴(kuò)增；擴(kuò)增效率不高；擴(kuò)增曲線

環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（l oop-m edi ated i sotherm al am pl i fi cati on of DN A，LAM P）是由N otom i等于2000年發(fā)明的一種恒溫、快速、高特異性和操作簡便的分子生物學(xué)檢測技術(shù)。其反應(yīng)原理是：根據(jù)序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)的一對外引物、一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物特異性識別靶序列上的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，60～65℃范圍60 m i n內(nèi)，大量合成目標(biāo)DN A，同時(shí)伴隨有副產(chǎn)物白色的焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生[1]。LAM P技術(shù)以其自身的優(yōu)勢，在國際上已成為了分子生物學(xué)檢測技術(shù)的研究熱點(diǎn)，也被應(yīng)用于多種疾病的檢測，例如小反芻獸疫病毒[2]、日本腦炎病毒[3]、口蹄疫病毒[4]、H 5N 1禽流感病毒[5]和結(jié)核分枝桿菌[6]等。

對于LAM P反應(yīng)的結(jié)果判定，目前有四種方式：眼觀白色沉淀檢測法（簡稱“目測法”）、熒光指示劑法、傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測和濁度儀的實(shí)時(shí)濁度法。前兩種方法僅通過肉眼判定，誤差較大，不適用于科學(xué)研究；第三種方法無法判定反應(yīng)中是否出現(xiàn)污染、二聚體擴(kuò)增等假陽性情況，從而得不到準(zhǔn)確、高效的反應(yīng)體系；而利用濁度儀，采用實(shí)時(shí)濁度法，能夠使整個(gè)反應(yīng)都在密閉條件下進(jìn)行，從而最大程度地避免污染，并且能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的白色焦磷酸鎂沉淀，并繪制成擴(kuò)增曲線。通過對曲線形態(tài)的分析，能夠客觀準(zhǔn)確的排除假陽性結(jié)果；通過沉淀產(chǎn)生的起始時(shí)間判斷反應(yīng)的進(jìn)行程度；通過濁度值的高低和反應(yīng)開始時(shí)間的快慢來優(yōu)化、最后確定最佳反應(yīng)體系[7]。因此，實(shí)時(shí)濁度法成為了LAM P研究中，確定和分析反應(yīng)結(jié)果的主流方法。筆者以在LAM P研究中幾種常見問題為例，對其產(chǎn)生的原因進(jìn)行分析并提出相應(yīng)的解決方法，從而促進(jìn)LAM P法的推廣和更深層次的研究。

1 試驗(yàn)儀器

濁度儀，型號為La-320C，La-500。

2 試驗(yàn)試劑

核酸提取試劑盒，購自Invi trogen公司；LAM P法RN A擴(kuò)增試劑盒（RN A Am pl i fi cati on Ki t），購自日本榮研化學(xué)株式會社；LAM P反應(yīng)管（Reacti on Tube），購自日本榮研化學(xué)株式會社。

3 擴(kuò)增曲線來源

《小反芻獸疫病毒RT-LAM P快速檢測和鑒別方法的建立》研究中的相關(guān)擴(kuò)增曲線。

4 試驗(yàn)中的常見問題

4.1氣溶膠污染根據(jù)LAM P反應(yīng)可知，其反應(yīng)過程可對靶序列的4～6個(gè)區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物可達(dá)到PCR反應(yīng)的102～103倍，反應(yīng)過程中極易產(chǎn)生氣溶膠污染，是LAM P研究中應(yīng)首要避免的因素之一。其解決方法：①嚴(yán)格核酸提取和擴(kuò)增進(jìn)行分區(qū)；②反應(yīng)全程禁止開啟反應(yīng)管。

4.2非特異性擴(kuò)增由于LAM P反應(yīng)對靶序列的擴(kuò)增區(qū)域較多，因此與PCR技術(shù)相比較容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的現(xiàn)象。除了技術(shù)本身的特點(diǎn)以外，導(dǎo)致LAM P反應(yīng)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的因素還有很多，例如M g2+的濃度、引物特異性欠佳、反應(yīng)溫度等。解決此類問題的方法：①在設(shè)計(jì)引物時(shí)要尋找高保守特有序列；②引物設(shè)計(jì)完成后應(yīng)利用O l i go等分子生物學(xué)分析軟件對其進(jìn)行二聚體情況分析；③在試驗(yàn)研究中最好采用特定的LAM P研究試劑盒，或者進(jìn)行M g2+濃度的篩選試驗(yàn)，以確定反應(yīng)的最佳環(huán)境；④需要進(jìn)行最佳反應(yīng)溫度篩選試驗(yàn)。通過以上方法，尋找出最佳反應(yīng)體系，從而最大限度地避免非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生。

4.3擴(kuò)增效率不高筆者試驗(yàn)中積累得出以下經(jīng)驗(yàn)：通常LAM P反應(yīng)在開始后10～20 m i n便可出現(xiàn)濁度的變化，即擴(kuò)增反應(yīng)開始；若在反應(yīng)25 m i n后才出現(xiàn)擴(kuò)增，則該體系不是最佳的反應(yīng)體系，應(yīng)及時(shí)查找原因進(jìn)行優(yōu)化。在優(yōu)化體系過程中應(yīng)首先排除體系污染、非特異性擴(kuò)增、引物質(zhì)量欠佳等情況。若仍不能解決，應(yīng)考慮引物比例是否得當(dāng)。通常引物的常用比例為FIP（BIP）：LF（LB）:F3（B3）=8:4:1，但對于不同靶序列，該比例組合未必最佳，因此需重新探索引物比例。

4.4擴(kuò)增曲線中的常見問題分析

圖1 正常擴(kuò)增曲線Fig.1Normal amplification curve

4.4.1正常擴(kuò)增曲線圖片來自La-320C型濁度儀。在利用濁度儀進(jìn)行的LAM P研究中，可同時(shí)繪制出反應(yīng)的擴(kuò)增曲線和速率曲線，擴(kuò)增曲線代表焦磷酸鎂的沉淀量，以濁度值表示，用于判定反應(yīng)結(jié)果；速率曲線代表反應(yīng)效率，在分析檢測結(jié)果時(shí)起到輔助作用。正常的擴(kuò)增曲線和速率曲線如圖1和圖2。由圖1可見，反應(yīng)初期迅速產(chǎn)生大量焦磷酸鎂沉淀，反應(yīng)體系濁度迅速上升，隨后沉淀產(chǎn)生速度變慢，曲線變化趨于緩和；同時(shí)圖2與圖1相互印證，即初期反應(yīng)速率較高，到達(dá)峰值之后速率逐漸下降至末期趨于反應(yīng)平衡狀態(tài)。

圖2 正常速率曲線Fig.2Normal judgment curve

圖3 擴(kuò)增曲線Fig.3Amplification curve

圖4 速率曲線Fig.4Judgment curve

4.4.2異常擴(kuò)增曲線

4.4.2.1核酸濃度過高圖片來自La-500型濁度儀。如圖3擴(kuò)增曲線所示，CH 6反應(yīng)孔（稱之為“樣本A”）的濁度值呈直線上升；圖4速率曲線在反應(yīng)初期迅速上升并迅速下降至負(fù)值，且無反應(yīng)平衡期。此種情況為樣本核酸濃度過高，解決方法為：將樣本進(jìn)行梯度稀釋后再次進(jìn)行擴(kuò)增。

4.4.2.2引物擴(kuò)增速率過快圖片來自La-320C型濁度儀。如圖5擴(kuò)增曲線所示，CH 1（稱之為“樣本B”）和CH 4（稱之為“樣本C”）反應(yīng)孔反應(yīng)開始后，濁度值僅有微小上升，便迅速下降且降至基準(zhǔn)線以下。從圖6速率曲線所示，反應(yīng)開始后不久便達(dá)到反應(yīng)平衡狀態(tài)。結(jié)合兩種圖像分析，出現(xiàn)此種情況的原因?yàn)椋后w系的反應(yīng)速率過快。濁度儀默認(rèn)的濁度監(jiān)測開始時(shí)間為反應(yīng)進(jìn)行10 m i n后，若反應(yīng)速率過快，濁度儀開始進(jìn)行監(jiān)測前反應(yīng)體系便已經(jīng)生成大量沉淀并累積在試管底部，從而使?jié)岫葍x繪制的反應(yīng)曲線不準(zhǔn)確，由此出現(xiàn)圖5所示情況。解決方法：①將濁度儀O pti ons選項(xiàng)中Ignore（Bef.）Ti選項(xiàng)設(shè)定的濁度監(jiān)測起始時(shí)間縮短；②對將樣本進(jìn)行梯度稀釋。

4.4.3進(jìn)行相關(guān)調(diào)整后的反應(yīng)曲線根據(jù)提供的相關(guān)解決方案：①將A樣本進(jìn)行10倍稀釋；②將B和C樣本進(jìn)行10倍稀釋的同時(shí)，調(diào)整濁度儀O pti ons選項(xiàng)中Ignore（Bef.）Ti，使?jié)岫缺O(jiān)測時(shí)間變更為5 m i n。再次進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，得出以下曲線，圖7為擴(kuò)增曲線，圖8為速率曲線。

圖5 擴(kuò)增曲線Fig.5Amplification curve

圖6 速率曲線Fig.6Judgment curve

通過試驗(yàn)證實(shí)，以上解決方案均為有效方案，再次對樣本進(jìn)行擴(kuò)增后取得了理想的擴(kuò)增效果。

5 小結(jié)

LAM P技術(shù)由于具有恒溫、操作簡單、對儀器設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn)，已被許多行業(yè)應(yīng)用到多種類型的實(shí)驗(yàn)室及臨床檢測中。但由于其擴(kuò)增產(chǎn)物量巨大、擴(kuò)增位點(diǎn)較多，也產(chǎn)生了反應(yīng)體系易污染和非特異性擴(kuò)增等問題。文章對氣溶膠污染、非特異性擴(kuò)增、擴(kuò)增效率不高和擴(kuò)增曲線常見問題的探討和解決，有利于LAM P技術(shù)更廣泛的推廣和應(yīng)用，從而發(fā)揮其更大的價(jià)值。

圖7 擴(kuò)增曲線Fig.7Amplification curve

圖8 速率曲線Fig.8Judgment curve

[1]LI Xue-l i an,LIU W ei,W AN G J i e,et al.Rapi d detecti on ofTri chi nel l a spi ral i sl arvae i n m uscl es by l oop-m edi ated i sotherm alam pl i ficati on[J].IntJParasi tol,2012,42(13-14): 1119-1126.

[2]楊卓，于漢勛，李巍.小反芻獸疫病毒RT-LAM P檢測方法的研究[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2015，7：8-14.

[3]Tori ni w aH,Kom i yaT,Rapi d detecti on and quanti fi cati on ofJ apaneseencephal i ti svirus by real-ti m e reverse transcri pti on l oopm edi ated i sotherm alam pl i fi cati on[J].M i crobi ol Im m unol,2006,50:379-387.

[4]李健，陳沁，熊祎，等.口蹄疫病毒RT-LAM P檢測方法的建立[J].病毒學(xué)報(bào)，2009，25（2）：137-142.

[5]馬啟明，馬學(xué)軍，高寒春，等.逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（RT-LAM P）在H 5N 1禽流感病毒基因檢測中的應(yīng)用[J].病毒學(xué)報(bào)，2008，24（3）：178-184.

[6]黃帆，李琳，林世平，等.DN A環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)速檢測結(jié)核分枝桿菌的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2008，24（8）：835-838.

[7]楊卓，于漢勛，李巍.小反芻獸疫病毒RT-LAM P快速檢測與鑒別方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2015，45（9）：930-936.

Some problems and relevant solutions on LAMP research

Yang Zhuo1,2
(1.DaLi an Center forAni m al Di sease Preventi on and Control,Li aoni ngDal i an116037; 2.DaLi an Ani m al H usbandry Stati on,Li aoni ngDal i an116037)

Thi s arti cl e w as based on the records of Establ i shm ent of RT-LAM P for the detecti on and di fferenti ati on ofpeste des peti ts rum i nants vi rus.Som e probl em s i n the research ofLAM P w ere di scussed,and the sol uti ons w ere put forw ard.A few si tuati ons,such as aerosolpol l uti on, nonspeci fi c am pl i fi cati on,l ow effi ci ency ofam pl i fi cati on,and som e probl em s i n am pl i fi cati on curve had been di scussed deepl y.And thi s arti cl e sum m ari zed the rel evant sol uti ons for the si tuati ons above.Thi s arti cl e had som e contri bute to the research and prom oti on of LAM P technol ogy.

LAM P technol ogy;Aerosol pol l uti on;N onspeci fi c am pl i fi cati on;Low effi ci ency of ampl i fi cati on;Am pl i fi cati on curve

S852.65

B

1672-9692(2016)07-0053-05

2016-06-11

楊卓（1982-），女，大學(xué)本科，學(xué)士，獸醫(yī)師，研究方向：動物疫病診斷及防控。