朱海霞，馬永強(qiáng)，程 亮，郭青云

(青海省農(nóng)林科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

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極細(xì)鏈格孢菌HZ-1對(duì)闊葉雜草的致病性及對(duì)作物的安全性評(píng)價(jià)

朱海霞，馬永強(qiáng)，程 亮，郭青云*

(青海省農(nóng)林科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子鑒定的方法，對(duì)生防潛力菌株HZ-1進(jìn)行分類學(xué)鑒定，通過菌株發(fā)酵液致病性測(cè)定，評(píng)價(jià)該菌株對(duì)5種闊葉雜草的除草活性，采用盆栽生測(cè)法評(píng)價(jià)其對(duì)青海省主栽作物的安全性。結(jié)果表明，HZ-1為極細(xì)鏈格孢菌(Alternariatenuissima)，菌株發(fā)酵液對(duì)豬秧秧(Galiumaparine)、刺兒菜[Cephalanoplossetosum(Willd.) Kitam]、藜(Chenopodiumalbum)、冬葵(Malvacrispa)、酸模葉蓼(PolygonumlapathifoliumL.)表現(xiàn)出不同程度的致病作用，尤其對(duì)豬秧秧、藜致病效果最為突出。安全性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，該菌株除對(duì)春油菜有輕微影響外，對(duì)春小麥、蠶豆、豌豆和青稞4種作物相對(duì)安全。綜上，HZ-1可作為防除豬殃殃、藜等闊葉雜草生物除草劑的候選菌株。

極細(xì)鏈格孢菌；闊葉雜草；致病性；作物安全性

農(nóng)田雜草直接為害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，是嚴(yán)重制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素之一[1]。青海省農(nóng)田雜草達(dá)182種，分屬35個(gè)科，其中，引發(fā)為害的有91種，嚴(yán)重為害的有44種。田間發(fā)生頻率較高的雜草有17種，包括以野燕麥為主的禾本科雜草和以藜、冬葵、大刺兒菜、豬秧秧為典型代表的闊葉雜草。農(nóng)田雜草泛濫已成為制約青海農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的嚴(yán)重障礙[2-3]。

利用微生物資源防除雜草是目前生物除草研究的熱點(diǎn)，該方法具有對(duì)作物影響小、環(huán)境負(fù)效應(yīng)少、安全性高等優(yōu)點(diǎn)[4-6]，符合可持續(xù)農(nóng)業(yè)的要求，已受到世界各國(guó)的高度重視。青藏高原具備獨(dú)特的氣候環(huán)境，孕育著獨(dú)特的微生物群落，很多極具發(fā)展前景的微生物資源尚待發(fā)掘。自2009年起，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)青海常見的農(nóng)田雜草病原真菌資源進(jìn)行調(diào)查、分離，從百余株雜草病原菌中篩選出了一些對(duì)雜草具有不同致病效果的生防菌。本研究以其中的一種潛力菌——極細(xì)鏈格孢(Alternariatenuissima)HZ-1菌株作為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)及分子鑒定，研究其除草活性與生防安全性，為具有生防潛力的微生源除草劑開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株分離與純化

參照方中達(dá)[7]有關(guān)病原真菌的分離方法，按組織分離法對(duì)采集的雜草病樣進(jìn)行分離純化，斜面培養(yǎng)后4 ℃冰箱保存。

1.2 菌株形態(tài)鑒定

將菌株HZ-1置于PDA平板培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，定期觀察菌落生長(zhǎng)速度、菌落形態(tài)及色澤變化，光學(xué)顯微鏡下觀察其菌絲、孢子形態(tài)。結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行初步鑒定。

1.3 菌株分子鑒定

參照王彥芹等[8]方法提取菌株DNA。選用擴(kuò)增基因組DNA的ITS區(qū)的通用引物，分別為：ITS4，5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；ITS5，5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：4 μL dNTP mixture，ITS4和ITS5各1.0 μL，6.0 μL的10×Taq reaction buffer，1.0 μLTaqDNA polymerase，模板DNA為2 μL，35.0 μL無菌去離子水。PCR循環(huán)設(shè)置如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，51 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共設(shè)35個(gè)循環(huán)。收集PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用chromas.exe軟件進(jìn)行序列修正，從NCBI Blast檢索與目標(biāo)序列同源性高的DNA序列，與本試驗(yàn)所測(cè)序列分別進(jìn)行菌株種內(nèi)比對(duì)。利用MEGA 5.0軟件近鄰歸群法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 生防菌株HZ-1對(duì)闊葉雜草的致病性

將青海省農(nóng)林科學(xué)院試驗(yàn)田間生長(zhǎng)至4～5葉期，葉色正常的藜、冬葵、酸模葉蓼，4～6輪生葉期的豬秧秧移栽于花盆(Φ=15 cm)中，于溫室內(nèi)培養(yǎng)；將生防真菌在PDB培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)120 h后，制成107個(gè)·mL-1的發(fā)酵液，噴霧接種到移栽的健康雜草植株上，每盆接種量為30 mL。以接種PDB培養(yǎng)液的植株作為空白對(duì)照。每處理重復(fù)3次。接種后的雜草植株置于溫室，用JBX-3.5離心式工業(yè)加濕器保持相對(duì)濕度為60%，室溫條件下，12 h光暗交替培養(yǎng)。7 d后調(diào)查雜草發(fā)病程度，稱鮮質(zhì)量，計(jì)算發(fā)病率、鮮重防效、病情指數(shù)，所有數(shù)據(jù)采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

1.5 生防菌株HZ-1對(duì)作物的安全性

將青海省5種主栽作物：春小麥(青春587)、春油菜(青雜5號(hào))、蠶豆(青海9號(hào))、豌豆(草原224)、青稞(北青8號(hào))分別種植于Φ=15 cm花盆中，室內(nèi)培養(yǎng)備用。HZ-1發(fā)酵液稀釋后按上述方法接種于到3～4葉期的作物植株上，設(shè)3次重復(fù)，接種7 d后觀察供試作物的發(fā)病情況，記載發(fā)病程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HZ-1的形態(tài)鑒定

如圖1所示，HZ-1于PDA平板上菌落疏松，圓形。初期為白色；后期，菌落邊緣逐漸變?yōu)楹谏?，直至整個(gè)平板?；鶅?nèi)菌絲及氣生菌絲發(fā)達(dá)，基內(nèi)菌絲初期呈黑色，顯微觀察顯示菌絲有隔，氣生菌絲呈放射狀。分生孢子易萌發(fā)，有隔。

2.2 菌株HZ-1分子鑒定

本研究自菌株的基因組DNA中擴(kuò)增到545 bp的ITS片段，與鏈格孢菌屬的ITS高度相似，其中，與Alternariasp.的同源性最高。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征分析表明，菌株HZ-1與Alternariatenuissima為同一個(gè)屬(圖2)。

Ⅰ, 菌落形態(tài)；Ⅱ, 菌絲形態(tài)；Ⅲ, 孢子圖1 菌株HZ-1形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of strain HZ-1

2.3 生防菌株HZ-1對(duì)闊葉雜草的致病性

噴施菌株HZ-1發(fā)酵液后，5種雜草表現(xiàn)出不同程度的受害癥狀。豬秧秧表現(xiàn)為葉片卷曲，莖葉發(fā)黑，藜和酸模頂部葉片出現(xiàn)萎蔫，冬葵葉片褪綠變黃，刺兒菜出現(xiàn)大面積病斑。結(jié)合發(fā)病率、鮮重防效和病情指數(shù)綜合分析(表1)，HZ-1發(fā)酵液對(duì)豬秧秧與藜的致病效果突出，與其他闊葉雜草相比差異顯著(P<0.05)，HZ-1可作為防除豬秧秧、藜的候選菌株繼續(xù)研究。

表1 菌株發(fā)酵液對(duì)不同雜草的致病力

Table 1 Virulence of the fermentation broth of HZ-1 to different weeds

雜草發(fā)病率/%鮮重防效/%病情指數(shù)豬秧秧81.2a62.9b80.3a刺兒菜70.0bc40.1c48.6c藜85.2a72.5a84.6a酸模75.3b48.4c68.2b冬葵68.3bc59.9bc51.9c

注：同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 生防菌株HZ-1對(duì)作物的安全性

HZ-1菌株發(fā)酵液接種春小麥(青春587)、豌豆(草原224)、蠶豆(青海9號(hào))、青稞(北青8號(hào)) 后均表現(xiàn)為不致病，作物長(zhǎng)勢(shì)和株高與對(duì)照植株相比均未受影響；對(duì)春油菜(青雜5號(hào)) 有輕微的致病性，接種后3 d，5%葉片出現(xiàn)萎蔫，有零星斑點(diǎn)，后期癥狀不擴(kuò)展。

3 討論和結(jié)論

近年來，ITS序列分析已成為真菌種和種下類群鑒定及親緣關(guān)系研究的常用方法[9-10]。本研究采用rDNA ITS序列比較分析，發(fā)現(xiàn)菌株HZ-1的ITS與鏈格孢菌屬的ITS高度相似，其中與Alternariasp.的同源性達(dá)到98%。結(jié)合菌落形態(tài)和孢子形態(tài)觀察，將潛力菌株HZ-1鑒定為極細(xì)鏈格孢菌(Alternariatenuissima)。

圖2 基于ITS rDNA序列BLAST結(jié)果構(gòu)建的菌株HZ-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of HZ-1 based on ITS rDNA sequences after BLAST

相比化學(xué)除草劑，微生物除草劑具有選擇性強(qiáng)、對(duì)人畜安全、對(duì)生態(tài)環(huán)境影響小等諸多優(yōu)點(diǎn)。對(duì)微生物除草劑的評(píng)價(jià)在理論上主要依據(jù)2條標(biāo)準(zhǔn)，即有效性和專一性[11-13]。雜草生防菌應(yīng)具備既對(duì)靶標(biāo)雜草具有強(qiáng)致病性又對(duì)作物相對(duì)安全兩大特點(diǎn)。本試驗(yàn)選用潛力菌HZ-1噴施于闊葉雜草藜、豬秧秧、刺兒菜、酸模和冬葵后，可導(dǎo)致其葉片發(fā)黃枯萎甚至整株枯死，說明該菌株的致病性是非?；缘?，HZ-1可作為防除闊葉雜草的候選菌株進(jìn)行后續(xù)研究。在安全性方面，除對(duì)春油菜有輕微影響外，其余表現(xiàn)為相對(duì)安全。因此，極細(xì)鏈格孢菌HZ-1對(duì)雜草致病性的廣譜性，和對(duì)春小麥、豌豆、蠶豆和青稞的安全性，顯示了其開發(fā)為微生物源除草劑的巨大潛力。但要將HZ-1開發(fā)成生物除草劑，還需對(duì)菌株HZ-1除草效果的穩(wěn)定性、持效性及其侵染闊葉雜草的作用機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。此外，根據(jù)HZ-1菌株的致病特點(diǎn)，有望從該致病菌的毒素中研發(fā)出新型微生物除草劑。

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(責(zé)任編輯 高 峻)

Pathogenicity of Alternaria tenuissima HZ-1 to broadleaf weeds and its safety on crops

ZHU Hai-xia， MA Yong-qiang, CHENG Liang， GUO Qing-yun*

(QinghaiAcademyofAgricultureandForestryScience，ScientificObservingandExperimentalStationofCropPestinXining，MinistryofAgriculture，KeyLaboratoryofAgriculturalIntegratedPestManagementinQinghaiProvince，Xining810016，China)

Strain HZ-1 was identified through morphology observation and sequence analysis. The herbicidal activity of HZ-1 against 5 broadleaf weeds was evaluated by the pathogenicity of fermentation broth， and its safety to major crops in Qinghai was tested by pot bioassay. It was shown that strain HZ-1 was identified asAlternariatenuissima. The fermentation broth of strain HZ-1 exhibited varied pathogenicity toGaliumaparine，Cephalanoplossetosum(Willd.) Kitam，Chenopodiumalbum，Malvacrispa，Polygonumlapathifolium， and within these 4 species， the pathogenicity toGaliumaparineandChenopodiumalbumwas more severe. Strain HZ-1 was safe to major crops except spring rape. In general， strain HZ-1 was candidate of microbial herbicide against broadleaf weeds such asGaliumaparineandChenopodiumalbum.

Alternariatenuissima; broadleaf weeds; pathogenicity; crop safety

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.06.21

2015-09-20

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃(2012BAD19B02)；中國(guó)科學(xué)院“西部之光”人才培養(yǎng)引進(jìn)計(jì)劃

朱海霞(1985—)，女，青海西寧人，碩士，副研究員，主要從事雜草生物防治研究。E-mail：zhuhaixia0101@163.com

*通信作者，郭青云，E-mail：guoqingyunqh@163.com

S 451

A

1004-1524(2016)06-1037-04

朱海霞，馬永強(qiáng)，程亮，等.極細(xì)鏈格孢菌HZ-1對(duì)闊葉雜草的致病性及對(duì)作物的安全性評(píng)價(jià)[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(6)： 1037-1040.