蔣德菊+夏荃+羅藝

【摘要】 目的：探討川芎含藥血清誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞（ES）分化為心肌細(xì)胞的特征，建立簡便、高效的定向誘導(dǎo)ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的體系。方法：觀察川芎含藥血清作用下ES細(xì)胞活性，誘導(dǎo)第3天起可見自發(fā)性、有節(jié)律跳動的類胚體出現(xiàn)，第5天達(dá)到高峰，約有70%的擬胚體產(chǎn)生跳動。用RT-PCR法在跳動的擬胚體中檢測心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物β-MHC的表達(dá)。結(jié)果：川芎含藥血清培養(yǎng)下的細(xì)胞β-MHC的表達(dá)水平和分化率均明顯升高，與大鼠血清組和胎牛血清組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：川芎含藥血清可明顯提高體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的效率。

【關(guān)鍵詞】 川芎； 胚胎干細(xì)胞； 細(xì)胞分化； 心肌細(xì)胞

【Abstract】 Objective：To explore the features of differentiation of mouse embryonic stem cells into cardiomyocytes induced by Chuanxiong containing serum，establish a simple and efficient system of ES cells differentiation cardiomyocyte.Method：The action of ES cell activity under Chuanxiong containing serum were observed，visible spontaneous and rhythmic beating embryoid bodies occurred at 3 d，reached peak at 5 d.Myocardial cell specific genes β-MHC were detected by using RT-PCR method.Result：Compared with the rat serum and fetal bovine serum group，theβ-MHC of the cells cultured by Chuanxiong containing serum expression and differentiation rate increased significantly，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Chuanxiong containing serum significantly improved the efficiency of embryonic stem cells differentiation to cardiomyocyte in vitro.

【Key words】 Chuanxiong； Embryonic stem cells； Cell differentiation； Cardiomyocyte

First-authors address：Longgang Central Hospital of Shenzhen City，Shenzhen 518116，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.30.005

心肌細(xì)胞移植在臨床中已經(jīng)廣泛使用，移植細(xì)胞包括多種，其中最適合于移植的細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞，主要是由于其具有較強的分化能力和增殖能力。胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞是研究心肌細(xì)胞分化機制的良好平臺和模型[1-2]。隨著現(xiàn)代藥學(xué)的發(fā)展，人們更加重視中藥的應(yīng)用，中藥歷史悠久，很多中藥均具有較好的活性，可用于疾病的治療，其中保護(hù)心肌功能的中藥應(yīng)用也較為廣泛，具有保護(hù)心肌、改善機體免疫功能、促進(jìn)蛋白增長及防治細(xì)胞凋亡等特點[3-4]。與傳統(tǒng)的化學(xué)藥品相比，中藥具有安全有效、價格便宜等特點[5-6]。本實驗利用胚胎干細(xì)胞實驗?zāi)Ｐ?，對川芎含藥血清誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞進(jìn)行實驗研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 中藥川芎含藥血清的制備 選取健康未交配過的SD雄鼠30只[許可證編號：syxk（粵）2013-0085，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心]，個體質(zhì)量（200±10）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行實驗。將其隨機分為空白對照組、低劑量組及高劑量組，每組10只。給予大白鼠川芎水煎液灌胃（取一定量川芎飲片置容器中，加水沒過藥面，浸泡30 min后，煎煮3次，60 min/次，合并水煎液，過濾，濃縮至含生藥1 g/mL備用），低劑量組的劑量約為正常用量（0.8 g/kg）的5倍，為4 g/kg，2次/d，連續(xù)3 d；而高劑量組則為正常用量的30倍，為24 g/kg，

2 次/d，連續(xù)3 d，空白對照組灌生理鹽水（4 mL/kg）。人與大鼠動物等效劑量系數(shù)由《實驗動物學(xué)》可知為6.3。每次給藥10 min后，對其進(jìn)行取血，將血液靜置2 h后離心（離心條件：3000 r/min，離心10 min），離心后取上清液56 ℃加熱30 min，過濾，保存于-20 ℃。體外含藥血清按20%計算[7-10]。

1.2 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 來源與試劑 小鼠胚胎干細(xì)胞選自中科院生化細(xì)胞研究所[11-12]；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、明膠、β-巰基乙醇（β-ME）、絲裂霉素C、非必需氨基酸（NEAA）購自美國GIBCO公司，白血病抑制因子（LIF）購自法國Millipore公司。

1.2.2 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化 將凍存在液氮罐中的胚胎干細(xì)胞取出，于37 ℃水浴鍋中迅速融化，將細(xì)胞立即轉(zhuǎn)移至10 mL的ep管中，加入適量的培養(yǎng)基，采用300 rcf，10 min離心，去除上清液，加入1 mL培養(yǎng)基吹打，轉(zhuǎn)移細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至70%左右時，對細(xì)胞進(jìn)行傳代。培養(yǎng)液分四組，即：川芎血清低劑量組、川芎血清高劑量組、大鼠血清組、胎牛血清組，將收集到的川芎含藥血清和大鼠血清、胎牛血清，配制成10 mL備用，各組培養(yǎng)液終濃度為20%。（1）懸滴培養(yǎng)：ES細(xì)胞中加入20%川芎含藥血清（低劑量組和高劑量組）的分化培養(yǎng)液，將細(xì)胞密度設(shè)置為3.75×104/mL。細(xì)胞培養(yǎng)在6 cm培養(yǎng)皿中，取1.6 mL細(xì)胞置于10 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)蓋上，將內(nèi)蓋翻轉(zhuǎn)使其生長，加入5 mL PBS，孵育1 h。（2）懸浮培養(yǎng)：細(xì)胞孵育后對細(xì)胞進(jìn)行觀察，控制細(xì)胞懸滴液中細(xì)胞個數(shù)為1，第2天于倒置顯微鏡下觀察，每個懸滴內(nèi)均含有1個，吸去PBS，加入分化培養(yǎng)基，移至6 cm中培養(yǎng)，孵育2 h。（3）貼壁培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)2 d后，觀察細(xì)胞個數(shù)，大約為10個，接種至4孔板，第3天時肉眼觀察每個培養(yǎng)皿中均可見數(shù)十個EBs。分別接種至事先用明膠包被的24孔板內(nèi)，每孔中加入2 mL分化培養(yǎng)液。

1.3 實時定量PCR檢測心肌細(xì)胞特異基因β-MHC的表達(dá) 實驗細(xì)胞分四組，即川芎血清低劑量組，川芎血清高劑量組，大鼠血清組和胎牛血清組，每組6孔。提取總RNA并測定濃度，分析其完整性，進(jìn)而合成cDNA，β-MHC Forward：5-AGAGCTCATCCTTTCTGGTCAT-3，Reverse：5-ACCATCTGACATTCTACAGTCT-3；GAPDH Forward：5-ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3Reverse：5-ATGCCTGCTTCACCACCTTCT-3[4-5]。PCR體系為：12.5 μL SYBR Green Realtime PCR MasterMix，2.5 μL樣品溶液，1.0 μL引物加水至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃下加熱60 s，進(jìn)行預(yù)變性；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，如此循環(huán)40次。擴增后的產(chǎn)物主要是采用熒光檢測，用ABI 7500 Software v2.0軟件對其進(jìn)行分析，繪制曲線表，計算Ct值，對系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理后可以得出不同濃度對于細(xì)胞分化的影響。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 川芎誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化 細(xì)胞培養(yǎng)2 d后呈密集狀態(tài)，一般為圓形，細(xì)胞界限和形態(tài)不明顯（圖1）；體外細(xì)胞個頭小，但生長速度快（圖1～2）。川芎分化液培養(yǎng)3 d的胚胎干細(xì)胞會收縮配體，導(dǎo)致培養(yǎng)時間增加，收縮越明顯，則時間越長。自發(fā)節(jié)律性收縮區(qū)域較大，且細(xì)胞形態(tài)較單一（圖3～4）。于細(xì)胞培養(yǎng)的第3 d可見零星EB球發(fā)生自發(fā)性節(jié)律性跳動，5 d時約有70%的EB球出現(xiàn)節(jié)律性跳動，低、高劑量川芎血清組（圖3～4）EB球發(fā)生自發(fā)性節(jié)律性跳動的細(xì)胞數(shù)量明顯多于胎牛血清（圖1）和大鼠血清組（圖2）。

2.2 實時定量PCR檢測心肌細(xì)胞特異基因β-MHC的表達(dá) 川芎低、高劑量含藥血清組β-MHC表達(dá)量均明顯高于胎牛血清組和大鼠血清組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；川芎低劑量組β-MHC分化率明顯高于高劑量組，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

3 討論

隨著人們生活水平的進(jìn)步，大部分人均處于亞健康狀態(tài)，心血管疾病是臨床上常見的疾病。心血管疾病的臨床突破主要來自胚胎干細(xì)胞的發(fā)展，胚胎干細(xì)胞會根據(jù)誘導(dǎo)自發(fā)分化成多種細(xì)胞，如心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等[13-15]。心肌細(xì)胞對于恢復(fù)正常供血、免疫功能均有重要的意義[16-17]。一般情況下，胚胎干細(xì)胞能夠自然分化，但分化率低，因此提高分化率顯得至關(guān)重要。臨床上對于胚胎干細(xì)胞的研究較為廣泛，但是研究方向各不相同，關(guān)于中藥的研究更是鳳毛麟角，因為涉及人體、細(xì)胞、動物等各個方面，給研究工作帶來了一定的困難，但也有部分學(xué)者取得了可喜的成果[18-19]。有研究方向為將細(xì)胞采用不同密度制成懸浮液，采用不同的方法和改變環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)，分析其分化成心肌細(xì)胞的分化率。最后對具有促進(jìn)分化功能的中藥進(jìn)行相關(guān)的安全性評價，致力應(yīng)用于臨床。川芎是傘形科藁本屬植物，經(jīng)研究表明，其具有多種臨床功效，如使血管擴張、增加腦部血流量、改善供血、降低血液黏稠度及改善心肌缺血[20]。本課題組在研究川芎含藥血清的胚胎毒性時發(fā)現(xiàn)川芎含藥血清對胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞有促進(jìn)作用（P<0.05），而且尤以低劑量組為明顯，遂建立川芎誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化方法，可以提高胚胎干細(xì)胞的分化率，有利于體外獲得相關(guān)的大量心肌細(xì)胞，將其應(yīng)用于臨床研究以及藥物的研發(fā)和篩選。

參考文獻(xiàn)

[1] Paquin J，Danalache B A，Jankowski M，et al.Oxytocin inducesdifferentiation of P19 embryonic stem cells to cardiomyocytes[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（14）：9550-9555.

[2]孫敬方.實驗動物學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：150-194.

[3]劉建文.藥理實驗方法學(xué)新技術(shù)與新方法[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：258-261.

[4] Qi Y J，Zhu Q L，Zhang K B，et al.Activation of foxo1 by insulin resistance promotes cardiac dysfunction and β-Myosin heavy chain gene expression[J].Circulation Heart Failure，2015，8（1）：51-63.

[5] Wang S，Deng Z，Seneviratne C J，et al.Enterococcus faecalis promotes osteoclastogenesis and semaphorin 4D expression[J].Innate Immunity，2015，21（7）：726-735.

[6] Zhu D Y，Lou Y J.Inducible effects of icariin，icaritin and desmethylicaritin on directional differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in vitro[J].Acta Pharmacol Sin，2005，26（4）：477-485.

[7]金玉青，洪遠(yuǎn)林，李建蕊，等.川芎的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中藥與臨床，2013，4（3）：44-48.

[8]羅莎，方海琴，楊輝，等.兩種胚胎干細(xì)胞實驗?zāi)Ｐ驮u價鄰苯二甲酸（2-乙基己基）酯胚胎發(fā)育毒性的比較研究[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2016，50（7）：645-651.

[9]王宏茂，邱彬，鄧然，等.胚胎干細(xì)胞對孕鼠缺血受損心肌的修復(fù)作用[J].中國實驗動物學(xué)報，2016，24（2）：127-133.

[10]任聰，孟憲生，包永瑞，等.體外篩選川芎治療冠心病的有效成分的提取純化工藝研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，8（35）：81-83.

[11]劉丹，尹東，曾姝，等.川芎嗪對LPS致心肌細(xì)胞損傷的影響及機制研究[J].中國藥理學(xué)通報，2012，28（11）：1531-1535.

[12]彭霞，黃政德，成細(xì)華，等.加味丹參飲預(yù)處理調(diào)控自噬相關(guān)基因Beclin-1和Atg5表達(dá)抗大鼠心肌缺血再灌注損傷[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2016，36（7）：20-24.

[13]于妍，王碩仁，聶波，等.川芎嗪、纈沙坦及曲美他嗪對乳鼠肥大心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和能量代謝的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2012，10（3）：321-324.

[14]于妍，王碩仁，孫逸坤，等.川芎嗪在逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞肥大過程中對心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，32（5）：661-665.

[15]姜暉，陳霞霞，王金艷，等.川芎嗪對柯薩奇病毒B3感染小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2014，24（13）：3121-3123.

[16]周雅萍，劉強.川芎嗪對心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用[J].實用臨床醫(yī)學(xué)，2011，12（2）：5-7.

[17]許玲莉.小鼠胚胎干細(xì)胞不同分化階段UGT1a1、UGT1a6和mGST1的表達(dá)特征[J].中國組織工程研究，2016，20（28）：4130-4135.

[18]趙潤英，郝偉，孟祥軍，等.阿魏酸川芎嗪后處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，41（11）：1018-1021.

[19]趙潤英，郝偉，孟祥軍，等.阿魏酸川芎嗪對缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J].中國病理生理雜志，2013，29（12）：2139-2143.

[20]李彤，郭美媛，馬葵芬，等.小鼠胚胎干細(xì)胞衍生的肝組織微粒體Ⅱ相代謝酶表征[J].浙江大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2013，42（5）：530-537.

（收稿日期：2016-07-28） （本文編輯：李穎）