王健理何君葵潘月瓊唐喬喬宋紅林

作者單位：530021南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科二病區(qū)；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

臨床研究

NF-κB、COX-2、LKB1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及臨床意義

王健理1何君葵2潘月瓊2唐喬喬2宋紅林1

作者單位：530021南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科二病區(qū)；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

目的探討核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）、環(huán)氧化酶2（COX-2）、肝激酶基因B1（LKB1）在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)及臨床意義。方法采用免疫組化SP法檢測60例正常子宮內(nèi)膜、31例非典型增生子宮內(nèi)膜和60例子宮內(nèi)膜癌組織中NF-κB、COX-2、LKB1蛋白的表達(dá)，并分析其與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果NF-κB、COX-2、LKB1在子宮內(nèi)膜癌組織、非典型增生子宮內(nèi)膜組織和正常子宮內(nèi)膜組織中的陽性表達(dá)率分別為63.3%、70.0%、35.0%，41.9%、64.5%、61.3%和35.0%、51.7%、93.3%，NF-κB、LKB1在3組間的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而COX-2的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。子宮內(nèi)膜癌中NF-κB、COX-2、LKB1蛋白的陽性表達(dá)與病理類型、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P＞0.05）。LKB1蛋白表達(dá)與肌層浸潤深度和組織學(xué)分級相關(guān)（P＜0.05），NF-κB蛋白表達(dá)與組織學(xué)分級亦相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論NF-κB在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)、LKB1低表達(dá)，其表達(dá)可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

子宮腫瘤；子宮內(nèi)膜癌；NF-κB；COX-2；LKB1；免疫組織化學(xué)法；蛋白表達(dá)；臨床意義

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，以絕經(jīng)后婦女多見。高分化子宮內(nèi)膜癌5年生存率超過90%，而低分化者僅為69%［1］，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不完全清楚。核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）是重要的轉(zhuǎn)錄因子，它通過調(diào)節(jié)生長誘導(dǎo)因子ErbB2、細(xì)胞周期蛋白D1以及抗凋亡基因如BCL-2、BCLXL、XIAP的基因編碼，參與細(xì)胞增殖和凋亡［2］。環(huán)氧化酶2（COX-2）是體內(nèi)重要的環(huán)氧化酶，能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成，抑制細(xì)胞凋亡和免疫耐受，從而促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移［3］。肝激酶基因B1（LKB1）能通過激活和磷酸化AMP活化蛋白激酶（AMPK）調(diào)節(jié)細(xì)胞極性、增殖、凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)程及能量代謝，是一種腫瘤生長抑制基因［4］。本研究探討了NF-κB、COX-2、LKB1在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)及其與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1一般資料

選取2008年9月至2011年9月本院經(jīng)手術(shù)病理確診為子宮內(nèi)膜癌的60例患者，年齡25～65歲，中位年齡58歲；臨床分期Ⅰ期35例、Ⅱ期8例、Ⅲ期17例。病理分級按WHO（2003）標(biāo)準(zhǔn)G1期25例、G2期12例、G3期23例。同時收集同期因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)且術(shù)后病理證實(shí)無子宮內(nèi)膜病變的60例組織標(biāo)本，年齡32～65歲，中位年齡52歲。選取手術(shù)病理確診為子宮內(nèi)膜非典型增生的31例組織標(biāo)本，年齡45～68歲，中位年齡54歲。子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前均未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療。所有研究對象術(shù)前3個月內(nèi)均未接受非甾體類抗炎藥、激素治療。標(biāo)本的選取均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)及患者本人知情同意。

1.2主要試劑

兔抗人NF-κB多克隆抗體、兔抗人COX-2多克隆抗體、兔抗人LKB1多克隆抗體和兔/鼠通用型SP試劑盒均購自上海拜力生物科技有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

分別取子宮內(nèi)膜癌組織、正常子宮內(nèi)膜組織和非典型增生子宮內(nèi)膜組織，置于4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化，之后按SP試劑盒說明書操作，DAB顯色，一抗工作濃度按說明書配備。空白對照：PBS液代替一抗；同時行陽性對照。采用免疫組化SP法檢測NF-κB、COX-2、LKB1蛋白的表達(dá)情況。

1.4結(jié)果判斷

免疫組化陽性染色為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)明顯的棕褐色或棕黃色顆粒。NF-κB、LKB1蛋白的陽性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞核出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒。COX-2蛋白的陽性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)及核膜出現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒。采用半定量積分法判斷結(jié)果。高倍鏡觀察：染色強(qiáng)度基本不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。陽性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度得分相乘，0～1分為陰性（-），2分及以上為陽性（+）。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理，率的比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用關(guān)聯(lián)性χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。H0MA-IR呈非正態(tài)分布，經(jīng)自然對數(shù)轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布后進(jìn)行統(tǒng)計。

2　結(jié)果

2.1NF-κB、COX-2、LKB1在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)

光鏡下可見NF-κB、LKB1免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物沿細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分布，呈棕黃色顆粒狀，在細(xì)胞核內(nèi)也有著色。而COX-2免疫陽性反應(yīng)細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)及核膜出現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒，細(xì)胞核內(nèi)未見明顯著色，見圖1。NF-κB和LKB1在正常子宮內(nèi)膜組織、非典型增生子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜癌組織中的陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而COX-2在組間表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1　NF-κB、COX-2、LKB1在不同子宮內(nèi)膜組織中的陽性表達(dá)［n（%）］

圖1　NF-κB、COX-2、LKB1在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)

2.2子宮內(nèi)膜癌組織中NF-κB、COX-2、LKB1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

子宮內(nèi)膜癌組織中NF-κB、COX-2、LKB1蛋白表達(dá)與病理類型、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)（P＞0.05）。NF-κB、COX-2蛋白表達(dá)與肌層浸潤深度無關(guān)（P＞0.05），而LKB1蛋白表達(dá)與肌層浸潤深度相關(guān)（P＜0.05）。COX-2蛋白表達(dá)與組織學(xué)分級無關(guān)（P＞0.05），而NF-κB、LKB1蛋白表達(dá)與組織學(xué)分級相關(guān)（P＜0.05）。見表2。

3　討論

NF-κB是目前已知的重要核轉(zhuǎn)錄因子之一，大量研究表明NF-κB可促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。NF-κB靶向基因激活后可導(dǎo)致NF-κB信號增加而抑制細(xì)胞凋亡、增殖［5］。COX-2能在細(xì)胞膜中將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素H2（PGH2），進(jìn)而再轉(zhuǎn)化為前列腺素E2（PGE2）。PGE2能通過自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡。連接PGE2和腫瘤的主要信號傳導(dǎo)通路有Ras-ErK、GSK3β-β-catenin、PI3K-AKT、BCL2、SRC-EGFR及NF-κB通路［6］。在子宮內(nèi)膜癌中，已有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB和COX-2被雌激素受體激活后，NF-κB與COX-2相互作用并共同調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄［7］。這種相互作用是直接的，因?yàn)镃OX-2基因啟動子包含了NF-κB的連接位點(diǎn)［8］。Faloppa等［9］研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜癌中，COX-2和NF-κB的表達(dá)降低。因此，NF-κB和COX-2信號通路可能在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

本研究用免疫組化法檢測不同子宮內(nèi)膜組織中NF-κB的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌組織中NF-κB的表達(dá)顯著高于非癌變組（P＜0.05）。NF-κB在非典型增生內(nèi)膜組織中的表達(dá)高于正常子宮內(nèi)膜組織，提示NF-κB的活化可能是子宮內(nèi)膜癌的早期事件。NF-κB在子宮內(nèi)膜癌中的陽性表達(dá)與組織分化程度相關(guān)，腫瘤分化程度越低，NF-κB的表達(dá)越高（P＜0.05），但與子宮內(nèi)膜癌FIGO分期、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織病理類型的相關(guān)性不顯著。推測NF-κB可能參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生，但與腫瘤的進(jìn)展及其預(yù)后關(guān)系不大。

表2　子宮內(nèi)膜癌組織中NF-κB、COX-2、LKB1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］

（續(xù)表）

已有研究發(fā)現(xiàn)COX-2在多種腫瘤中存在高表達(dá)，能促進(jìn)腫瘤血管生成，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。許多體內(nèi)外試驗(yàn)證實(shí)在胃癌、腸癌、腦癌、肺癌及胰腺癌等多種腫瘤中使用COX-2抑制劑能抗腫瘤血管生成從而起到抗腫瘤增殖作用［10］。在子宮內(nèi)膜癌中亦觀察到COX-2的差異表達(dá)，但相關(guān)報道結(jié)果不一，尚未有統(tǒng)一結(jié)論。最近有研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌中COX-2過表達(dá)與腫瘤侵襲性相關(guān)。Liao等［11］報道，COX-2在非典型增生的子宮內(nèi)膜中表達(dá)增加，間接說明COX-2在子宮內(nèi)膜非典型增生進(jìn)展到子宮內(nèi)膜癌這一過程中起不可忽視的作用。但也有不同的觀點(diǎn)，如Cao等［12］研究發(fā)現(xiàn)COX-2表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的組織學(xué)分化程度呈正相關(guān)，而在子宮內(nèi)膜增生組織中，COX-2低表達(dá)，甚至不表達(dá)，認(rèn)為COX-2高表達(dá)并不是子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的早期事件。本研究結(jié)果顯示，COX-2在正常子宮內(nèi)膜、非典型增生子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)率逐漸升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在子宮內(nèi)膜癌組織中，COX-2的表達(dá)與FIGO分期、組織學(xué)分級、肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織病理類型等均無相關(guān)性（P＞0.05），提示COX-2可能與子宮內(nèi)膜癌預(yù)后無明顯關(guān)系。由于COX-2在炎癥及腫瘤等病理情況下能被炎癥因子、生長因子等誘導(dǎo)，而子宮內(nèi)膜的周期性變化類似炎癥的過程，這可能是導(dǎo)致以上結(jié)果的原因之一。因此，COX-2與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性有待進(jìn)一步證實(shí)。雖然各學(xué)者對于NF-κB、COX-2在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移過程中的作用有不同結(jié)論，但均認(rèn)為NF-κB、COX-2在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)與在非癌內(nèi)膜中有差異表達(dá)。

近年來，有關(guān)LKB1參與腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究較多。LKB1是AMP的一個上游激酶，可通過激活A(yù)MPK，從而抑制mTOR復(fù)合體，最終抑制腫瘤細(xì)胞的生長與侵襲。Contreras等［13］研究發(fā)現(xiàn)，LKB1基因缺失的雌性小鼠中，有超過50%的小鼠發(fā)生子宮內(nèi)膜癌，說明LKB1能抑制子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。本研究中，LKB1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)明顯低于正常子宮內(nèi)膜和非典型增生子宮內(nèi)膜組織（P＜0.05）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，LKB1的表達(dá)與組織分化程度和肌層浸潤有相關(guān)性（P＜0.05），提示LKB1與子宮內(nèi)膜癌侵襲有關(guān)。但本研究未發(fā)現(xiàn)LKB1表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織病理類型有相關(guān)性，因此LKB1是否參與子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移有待進(jìn)一步證實(shí)。

雖然目前關(guān)于NF-κB、COX-2、LKB1在子宮內(nèi)膜癌中的研究較多，但均以單因素分析為主。本研究同時分析子宮內(nèi)膜癌組織中NF-κB、COX-2、LKB1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，提示同時檢測這三種蛋白的表達(dá)可能更有助于探討子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制。然而本實(shí)驗(yàn)僅分析了三種蛋白的差異表達(dá)，對其內(nèi)在聯(lián)系及相互作用仍需進(jìn)一步研究和證實(shí)。

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［2016-07-21收稿］［2016-10-18修回］［編輯江德吉］

NF-κB，COX-2 and LKB1 expression in endometrial cancer tissues and clinical significance

Wang Jianli1，He Junkui2，Pan Yueqiong2，Tang qiaoqiao2，Song Honglin1（1Department of Gynecology Oncology，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；2Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）
Corresponding author:Song Honglin.E-mail:381783170@qq.com

Objective To analyze NF-κB，COX-2 and LKB1 expression in endometrial cancer tissues and normal controls，and assess clinical significance.Methods Immunohistochemistry was used to analyze expression of NF-κB，COX-2 and LKB1 in 60 endometrial cancer tissues，60 normal endometrial tissues from uterine myomas and 31 cases of atypical hyperplasia of endometrium.Possible relationships were explored between NF-κB，COX-2 and LKB1 expression and clinicopathological variables.Results The rate of NF-κB positivity was 63.3%for endometrial cancer tissue，41.9%for normal endometrial tissue，and 35.0%for atypical hyperplasia tissue. The corresponding results for COX-2 positivity were 70.0%，64.5%and 51.7%.The corresponding results for LKB1 positivity were 35.0%，61.3%and 93.3%.Expression of NF-κB and LKB1 varied significantly across the three types of tissue（P＜0.05），but expression of COX-2 did not（P＞0.05）.Expression of none of the three proteins correlated with pathology type，clinical stage or lymph node metastasis；however，LKB1 expression correlated positively with myometrial invasion and histology grade（P＜0.05），while NF-κB expression correlated with histology grade（P＜0.05）.Conclusion NF-κB is over-expressed and LKB1 under-expressed in endometrial cancer tissue.These proteins may be involved in the development and progression of endometrial cancer.

Uterine neoplasms；Endometrial cancer；NF-κB；COX-2；LKB1；Immunohistochemistry；Proten expression；Clinical significance

R737.33

A

1674-5671（2016）05-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2016.05.03

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2011GXNSFA018253）

宋紅林。E-mail：381783170@qq.com