張海春陳 莉胡蓉菲任新平朱 婷

不同時長超聲照射（TCCS）結(jié)合MBS、rt-PA聯(lián)合溶栓的效果評估

張海春1陳 莉2胡蓉菲1任新平3朱 婷1

目的：探討不同時長超聲照射（TCCS）聯(lián)合微泡（MBS）和重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA）對體內(nèi)溶栓的效果。方法：建立大鼠自體血栓動脈栓塞模型：將血栓經(jīng)頸外逆行置入頸總動脈內(nèi)，臨時阻斷結(jié)扎，形成動脈血栓模型。超聲照射時間設(shè)定為兩個時間點(diǎn)：15min時間點(diǎn)及30min時間點(diǎn)。動物隨機(jī)分為5組：①對照組；②rt-PA組；③TCCS + MBS組；④rt-PA +TCCS+ MBS組；⑤1/2 rt-PA +TCCS+ MBS組。通過二維超聲和彩色多普勒超聲評估各組頸動脈血管再通率。結(jié)果：TCCS治療加入MBS及rt-PA對于血管溶栓的再通率有顯著提高。在溶栓15min時間點(diǎn)：僅rt-PA+TCCS+MBS組與對照組溶栓再通率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；在溶栓30min時間點(diǎn)觀察：對照組與rt-PA組、rt-PA+TCCS+MBS、1/2rt-PA+MBS+TCCS組之間溶栓再通率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；rt-PA+TCCS+MBS與rt-PA組和單純TCCS+MBS組比較，均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。結(jié)論：在治療缺血性腦卒中方面，TCCS + MBS聯(lián)合rt-PA是一種有效的方法，具有協(xié)同作用，時長30min明顯優(yōu)于15min溶栓效果。

超聲輔助溶栓；對比劑

據(jù)不完全統(tǒng)計，我國每年新發(fā)腦卒中患者約400萬，世界衛(wèi)生組織調(diào)查顯示腦血管事件是引起死亡的第二大常見原因，多年來其發(fā)病率、死亡率、致殘率在疾病譜中一直處于前三位。改善腦卒中預(yù)后刻不容緩。

1965年Anshuetz等首次報道了超聲具有增強(qiáng)溶栓作用的潛能。多個實驗及臨床研究表明高頻率（1～2 MHz）且低強(qiáng)度（＜700mW/cm2）的超聲可安全有效地促進(jìn)rt-PA的溶栓效果，并改善預(yù)后，部分實驗顯示可使用較小劑量的rt-PA達(dá)到同樣的溶栓效果，加用微泡（microbubble， MB）能夠進(jìn)一步加強(qiáng)該作用。

目前用于此目的的技術(shù)包括經(jīng)顱多普勒超聲（TCD）、經(jīng)顱彩色多普勒（TCCD）、高強(qiáng)度聚焦超聲（HIFU）和低頻超聲。

有研究表明，TCCS和微泡結(jié)合（MBS，SonoVue）與rt-PA這三種形式的組合，且TCD超聲（TCCS）經(jīng)成人顱骨顳骨照射3～4h內(nèi)形成的血栓，提供了最佳的溶栓效果。

方 法

1．實驗對象

動物實驗標(biāo)本取30只成年雄性大鼠，體重530～620 g。

根據(jù)不同的條件，大鼠隨機(jī)分為5組：①對照組；②rt-PA組；③TCCS + MBS組；④rt-PA +TCCS+ MBS組；⑤1 / 2 rt PA +TCCS+ MBS組。

2．建立大鼠頸動脈血栓模型

從大鼠尾靜脈抽出0．5ml自體靜脈血，放入試管中，在37℃水浴中孵育3h，然后切片形成的血栓為0．6mm×0．08cm小塊。

大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛，0．36 ml／100g，四肢平躺放在平整的平臺上。取左頸部血管解剖，將頸外動脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎，使用外科微型動脈夾夾閉頸總動脈近心端和頸內(nèi)動脈，在頸外動脈分叉處預(yù)留一道扎線，在距離分叉約4～5mm處使用顯微剪刀剪一小切口（見圖1），見血液溢出后使用生理鹽水紗布擦去溢出的血液，后用有齒鑷由切口進(jìn)入頸總動脈輕輕刮擦幾下，將大鼠自體3～4h栓齡的體外血栓（由大鼠尾靜脈采血制備）經(jīng)頸外動脈置入頸總動脈內(nèi)，然后將預(yù)留的縫線扎起來，使用動脈夾夾閉5min后放開，使得頸動脈通路變?yōu)閺念i總動脈流向頸內(nèi)動脈。

頸動脈血栓模型中的血栓經(jīng)超聲顯示低回聲，此時左頸總動脈血管搏動在下降，無明顯血流信號，在管腔內(nèi)近看紅色和藍(lán)色相間的返流血流信號，見圖2。

3．溶栓治療

五治療組觀察：①對照組；②rt-PA組；③TCCS + MBS組；④rt-PA +TCCS+ MBS組；⑤1 / 2 rt PA +TCCS+ MBS組。

取一塊成人顳骨，采用TCD S5-1探頭系統(tǒng)模式（中心頻率為1MHz，機(jī)械指數(shù)=0．9，最大輸出能量為99%和最小深度），由成人顳骨放置于探頭和栓塞動脈中間。

微泡（SonoVue）和rt-PA（重組組織型纖溶酶原激活劑）進(jìn)行制備。

用1ml注射器以恒定的速度注射，然后用0．9%鹽水靜脈點(diǎn)滴。rt-PA注射分為2個階段：第一個10%的劑量給藥為靜脈推注，第二個是剩下的90%是在一個恒定的速度靜脈注射，隨后用0．9%生理鹽水靜脈點(diǎn)滴。

在15min和30min的栓塞率，用超聲探頭檢查（取最小深度）、彩色多普勒及脈沖多普勒（PW）來觀察血流再通。對側(cè)相應(yīng)血管作對照。血流動力學(xué)參數(shù)包括收縮期峰值流速（PSV）、舒張末期流速（EDV）時期，阻力指數(shù)（RI）。當(dāng)血管狹窄，狹窄的片段測定血流動力學(xué)參數(shù)，在狹窄的近端和遠(yuǎn)端，對比PSV進(jìn)行計算。算出再通率（RR，%）。所有操作和分析工作由2名經(jīng)驗豐富的超聲人員進(jìn)行了一項雙盲的方式。

4．統(tǒng)計分析

使用SPSS17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，各組SD大鼠狹窄段動脈溶栓再通率兩兩比較，采用卡方檢驗，比較出卡方值及P值。P≥0．05被認(rèn)為有顯著性差異。

結(jié) 果

對大鼠頸總動脈進(jìn)行檢測，建立大鼠頸總動脈的灰度和彩色血流成像模型，建立大鼠頸總動脈的動態(tài)和綜合分析模型，成功完成阻塞性頸動脈血栓形成模型。

表1　各實驗組在不同時間點(diǎn)測得的頸動脈血流再通率（%）

表2　各組大鼠狹窄段頸動脈溶栓再通率兩兩比較的卡方值及P值

觀察15min和30min溶栓再通率。

表1中，rt-PA+TCCS+MBS組在照射長30min時，較其他任何一組溶栓率都高，達(dá)到100%。

表2中，在溶栓15min時間點(diǎn)，各處理組僅rt-PA+TCCS+MBS組與對照組溶栓再通率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8．571，P=0．003）；單純rt-PA組和TCCS+MBS組分別與rt-PA+TCCS+MBS組溶栓再通率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5．333，P=0．021）。

在溶栓30min時間點(diǎn)觀察：對照組與rt-PA組、rt-PA+TCCS+MBS、1/2rt-PA+MBS+TCCS組之間溶栓再通率比較，均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；rt-PA+TCCS+MBS與rt-PA組和單純TCCS+MBS組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。1/2rt-PA+MBS+TCCS與rt-PA+TCCS+MBS組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

討 論

超聲溶栓技術(shù)是通過超聲激勵生物體血液內(nèi)自有的微氣泡，或者經(jīng)靜脈注射的超聲對比劑微泡，使其產(chǎn)生空化效應(yīng)和聲孔效應(yīng)，即微泡空化諧振甚至產(chǎn)生內(nèi)爆所釋放的沖擊波、微射流等機(jī)械能量，造成血栓表面或內(nèi)部形成無數(shù)的微小孔隙和裂隙，促進(jìn)溶栓藥物對血栓的滲透，增加溶栓藥物的結(jié)合作用位點(diǎn)，從而加速體內(nèi)溶栓過程［1-3］。超聲對比劑微泡作為一種有效的空化核，其具有如下優(yōu)勢：可以顯著降低超聲空化的聲壓閾值、增強(qiáng)空化強(qiáng)度，起到加速超聲溶栓過程的作用［4］。

自20世紀(jì)70年代以來，使用低劑量超聲治療腦血管病的嘗試取得了良好的效果，并對超聲在腦血管病中的應(yīng)用進(jìn)行不斷更新。實驗研究中頻超聲、低頻超聲、HIFU（高強(qiáng)度聚焦超聲）和TCD（經(jīng)顱多普勒）單獨(dú)或與超聲微泡對比劑或溶栓藥物聯(lián)合應(yīng)用有良好 的溶栓作用，能顯著改善神經(jīng)系統(tǒng)癥狀［5-6］。

圖1　顯示了外科顯微鏡下建立大鼠頸總動脈栓塞模型的過程中使用動脈夾夾閉頸動脈及頸外動脈切開小口。其中a動脈夾夾閉頸總動脈近心端，b動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，→所指為頸外動脈的小切口。

圖2　成功建立大鼠頸動脈血栓模型的左側(cè)頸動脈二維灰階及彩色血流圖像。A．為超聲二維圖像顯示血管內(nèi)充滿低弱回聲區(qū)。B．為彩色血流圖，內(nèi)未見明顯血流信號通過，近心端見紅藍(lán)相間的“撞墻樣”反流血流信號。

此次研究中，表1顯示單純rt-PA組或者單純TCCS+MBS組的溶栓率都較低，只有 rt-PA+TCCS+MBS組在時長30min溶栓率達(dá)到100%，其結(jié)果表明治療頸動脈內(nèi)3～4h內(nèi)的血栓是安全有效的，而且還表明TCCS + MBS和rt-PA之間有一個額外的或協(xié)同的作用。

靜脈溶栓治療有嚴(yán)重依賴時間依賴性，患者越早接受治療，預(yù)后越好。到現(xiàn)在為止，如果在3h內(nèi)的閉塞，有效治療腦卒中的研究成果是重組組織型纖溶酶原激活劑靜脈溶栓治療，這是唯一有效的［7］。最近，美國和歐洲急性缺血性腦卒中診治指南指出，通過靜脈注射tPA的有效時間窗口已經(jīng)從3h擴(kuò)展到癥狀發(fā)作4．5h后［8-9］。

我們觀察15min及30min時間點(diǎn)的血管再通率。在15min時，不同療效組間治療的再通率都較低。但是在30min的治療效果顯著增加，對照組與rt-PA組、rt-PA+TCCS+MBS、1/2rt-PA+MBS+TCCS組之間溶栓再通率比較，均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；rt-PA+TCCS+MBS與rt-PA組和單純TCCS+MBS組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。在30min時間點(diǎn)的溶栓效果明顯優(yōu)于15min的溶栓效果。我們認(rèn)為，這個時間點(diǎn)的治療作用可能歸因于治療藥物的累積作用，即TCCS、MBS和rt-PA對血栓的綜合溶栓效果。血管完全閉塞在治療的早期階段，不允許治療藥物與血栓充分接觸，使有限的血栓溶解。隨著治療的進(jìn)行，累計機(jī)械壓縮、空化效應(yīng)和加速松TCCS“爆破”血栓MBS顯著增加3的治療藥物的作用位點(diǎn)，這必將產(chǎn)生溶栓的正反饋，從而導(dǎo)致更有效的再通［10-12］。

在本研究中，我們采用自體血栓，從外頸動脈逆行到頸總動脈，然后結(jié)扎頸外動脈，并且暫時阻斷頸總動脈和頸內(nèi)動脈，安置血栓于頸動脈內(nèi)。結(jié)果表明，完全阻塞性頸動脈血栓形成模型簡單可靠。

本研究的也存在局限性。我們只探討了時長30min明顯優(yōu)于15min溶栓效果，但是究竟多少時長才能有最佳的效果，這有待于我們將來在不同動物模型中增加樣本量或者增加劑量，來獲得更多的有價值的信息。

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Evaluation of the Effect of Different TCCS Durations Combined with MBS and rt-PA on Thrombolysis

ZHANG Hai-chun1, CHEN Li2, HU Rong-fei1, REN Xin-ping3, ZhU Ting1

Purpose: To evaluate the effect of different TCCS durations combined with MBS and rt-PA on thrombolysis. Methods: A rat thrombosis model was built up by putting a thrombus into the common carotid artery. The rats were randomly divided into 5 groups: (1) Control group； (2) rt-PA group； (3) TCCS + MBS group； (4) rt-PA + TCCS + MBS group； (5) 1/2 rt-PA + TCCS + MBS group. Each group was performed 30 minutes TCCS；and the data was recorded at the 15th minute and the 30th minute. The carotid artery revascularization rate of each group was evaluated by ultrasonography and TCCS. Results: The revascularization rate was increased obviously by TCCS + MB and rt-PA. At the 15th minute of TCCS, the difference of the revascularization rates of rt-PA + TCCS + MBS group and control group was with statistical significant. At the 30th minute of TCCS, the differences of the revascularization rates of control group and rt-PA group, rt-PA+TCCS+MBS group, 1/2 rt-PA+MBS+TCCS groupwere with statistical significant (P＜0.05). Conclusion: TCCS+MBS combined with rt-PA is an effective solution in treating ischemic stroke. The thrombolysis effect of 30 minutes TCCS is obviously better than that of 15 minutes TCCS.

Ultrasound assisted thrombolysis；Contrast medium

R743.3

A

1006-5741（2016）-05-0398-05

中國醫(yī)學(xué)計算機(jī)成像雜志，2016，22∶398-402

∶1 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院寶山分院超聲科

2 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院靜安分院超聲科

3 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院超聲科

通信地址∶上海市寶山區(qū)長江西路1999號，上海200431

∶胡蓉菲（電子郵箱∶6489221@qq.com）

Chin Comput Med Imag，2016，22∶398-402

1 Department of Ultrasound. Huashan Hospital Baoshan Branch, affiliated to Fudan University

2 Department of Ultrasound. Huashan Hospital Jingan Branch, Affiliated to Fudan University

3 Department of Ultrasound, Ruijin Hospital, Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine

Address: No. 1999 West Changjiang Rd,Shanghai 200431,P.R.C

Address Correspondence to HU Rong-fei(E-mail: 6489221@qq.com)

2016.08.11；修回時間：2016.08.17)