王煒辰，嚴(yán)國鴻，李　煌，徐　偉，褚克丹

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部，福建福州350004； 2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

HPLC法測定蛇傷膠囊中鹽酸小檗堿含量

王煒辰1，嚴(yán)國鴻1，李煌2，徐偉2，褚克丹2

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部，福建福州350004； 2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

目的：建立蛇傷膠囊中鹽酸小檗堿含量的測定方法。方法：色譜柱為Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液-乙腈（75∶25）；柱溫：35℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：346 nm；進(jìn)樣量：10 μL。結(jié)果：鹽酸小檗堿含量在0.101 μg～1.008 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系（r=0.999 9），平均回收率為97.36%，RSD=1.23%（n=6）。結(jié)論：該方法簡便快速，重復(fù)性好，可為蛇傷膠囊的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

高效液相色譜；蛇傷膠囊；鹽酸小檗堿

蛇傷膠囊是福建省人民醫(yī)院蛇傷?？频奶厣苿哂袨a火解毒、涼血消腫等功效，臨床上用于治療毒蛇咬傷、毒蜂蜇傷等，療效良好，廣受患者好評。該院內(nèi)制劑原標(biāo)準(zhǔn)中無含量測定項(xiàng)，本實(shí)驗(yàn)擬采用HPLC法測定膠囊中主要藥味黃連中鹽酸小檗堿的含量，為更好地控制制劑質(zhì)量提供依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)儀器

Ultimate-3000型高效液相色譜儀（美國戴安公司），包括LPG-3400SD四元梯度泵、WPS-3000SL自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC-3000RS柱溫箱；Chromeleon 6.80色譜工作站。賽多利斯CPA255D電子分析天平（0.01 mg，Sartorius）；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TU-1201型紫外分光光度計(jì)（北京市通用儀器設(shè)備公司）；JZC-3TSC電子天平（福州科迪電子技術(shù)有限公司）。

1.2試藥與試劑

鹽酸小檗堿對照品（批號110713-200208，中國食品藥品檢定研究院），乙腈、甲醇（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），磷酸二氫鈉、鹽酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），實(shí)驗(yàn)用水為自制去離子水。3批蛇傷膠囊（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院制劑室自制，批號130606，140317，140825）。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液-乙腈（75∶25）（pH 4.0）；柱溫：35℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：346 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備精密稱取鹽酸小檗堿對照品5.04 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備取蛇傷膠囊，傾出內(nèi)容物，混勻，取粉末7 g精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷；再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，得濾液1。濾渣重復(fù)以上操作再次提取，將所得濾液2與濾液1合并，搖勻，濃縮至50 mL，精密量取2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對照溶液的制備按蛇傷膠囊處方量取除黃連外的其他藥材，照制劑制備工藝制成缺黃連的陰性對照品，再按“2.2.2”供試品項(xiàng)下方法制得陰性對照溶液。

2.3系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μl，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，陰性對照在鹽酸小檗堿保留時(shí)間處無干擾峰出現(xiàn)，結(jié)果見圖1。

2.4線性關(guān)系考察

精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL、10 mL置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，各精密吸取10 μL注入液相色譜儀進(jìn)行測定，以對照品進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=59.538 0X-1.028 1（r=0.999 9），結(jié)果見表1、圖1。可見，鹽酸小檗堿在0.101 μg～1.008 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

表1　鹽酸小檗堿對照品線性考察試驗(yàn)結(jié)果

2.5方法學(xué)考察

2.5.1精密度試驗(yàn)精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測得鹽酸小檗堿峰面積的RSD為0.452%，表明儀器精密度良好。

2.5.2重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品（批號140825）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積RSD為1.05%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

圖1　系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)色譜圖

2.5.3穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一份供試品溶液10 μL，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣測定，結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積的RSD為1.59%，表明供試品溶液中的鹽酸小檗堿在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4加樣回收率試驗(yàn)精密稱取同一批號樣品（140825）共6份，加入相應(yīng)量的鹽酸小檗堿對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備并測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。6次加樣回收率測定結(jié)果均在95%～105%之間，平均回收率為97.36%，RSD為1.23%，表明本方法準(zhǔn)確可靠。

2.6樣品測定

取蛇傷膠囊3批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算樣品中鹽酸小檗堿含量，結(jié)果見表3。

表2　加樣回收率試驗(yàn)

表3　3批蛇傷膠囊樣品含量測定結(jié)果

3　討論與總結(jié)

黃連是蛇傷膠囊中的重要藥味，其主要成分鹽酸小檗堿含量測定的方法很多，采用HPLC法測定具有簡便易行、靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。本次實(shí)驗(yàn)依據(jù)2010版《中國藥典》中含小檗堿成分的原料藥及中成藥并參考相關(guān)文獻(xiàn)來考察含量測定條件。

3.1供試品制備條件篩選

提取溶劑的選擇。在供試品制備的過程中考察了不同溶媒的提取效果，分別選用60%乙醇、60%甲醇、甲醇［1］、鹽酸-甲醇（1∶100）［2］、乙腈-0.1% H3PO4溶液［3］超聲30 min后注入液相色譜儀進(jìn)行比較。結(jié)果表明同樣是50 mL溶媒，鹽酸-甲醇（1∶100）溶液提取率最高。

提取方法的考察。使用鹽酸-甲醇（1∶100）作為溶媒，考察超聲、加熱回流［4］、索氏提取30 min，結(jié)果顯示超聲提取率高，而且重復(fù)性強(qiáng)，3次測得的含量RSD為0.55%，操作方便快捷，所以選擇超聲作為提取方法。

提取時(shí)間的考察。使用鹽酸-甲醇（1∶100）作為溶媒，分別對4個(gè)同批次樣品超聲15 min、30 min、45 min、60 min，結(jié)果顯示15 min提取不夠完全，30 min、45 min提取的含量基本相同，60 min提取的含量略低。為了節(jié)省時(shí)間，快速檢測，選擇提取時(shí)間為30 min。

提取次數(shù)的考察。使用鹽酸-甲醇（1∶100）作為溶媒，超聲提取30 min，分別提取1、2、3次，發(fā)現(xiàn)提取2次基本能將小檗堿提取完全。所以用鹽酸-甲醇（1∶100）50mL作為溶媒，超聲提取2次，每次30min。

3.2系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)條件篩選

吸收波長的選擇。使用紫外分光光度計(jì)于200 nm～700 nm全波長掃描鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品及蛇傷膠囊陰性樣品，結(jié)果顯示鹽酸小檗堿在230 nm、265 nm、346 nm波長處均存在吸收峰，其中230 nm、265 nm處專屬性較差，雜質(zhì)有吸收，346 nm處響應(yīng)值高且無雜峰干擾，故選定346 nm為檢測波長。

流動(dòng)相的選擇。查找文獻(xiàn)，選擇乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液［4］、乙腈-0.05 mol/L NaH2PO4［2，5］、乙腈-0.05 mol/L KH2PO4［6-8］4種類型溶劑作為流動(dòng)相，必要時(shí)加入離子對試劑十二烷基硫酸鈉或掃尾劑三乙胺［9］，通過調(diào)節(jié)有機(jī)相與水相的比例來比較他們之間的分離效果。結(jié)果顯示三乙胺和十二烷基硫酸鈉加入后影響柱效，數(shù)據(jù)重復(fù)性不高，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后不易洗脫，故不予采用；乙腈-水系統(tǒng)拖尾較嚴(yán)重；乙腈-0.1%磷酸溶液系統(tǒng)稍好，但是小檗堿峰的對稱性仍超過1.05；乙腈-0.05 mol/L NaH2PO4溶液系統(tǒng)與乙腈-0.05 mol/L KH2PO4溶液相比，前者在分離度、峰形等諸多因素方面略優(yōu)于后者，可能是因?yàn)殡x子半徑不同從而影響了色譜行為。故選乙腈-0.05 mol/L NaH2PO4溶液為流動(dòng)相，配比為25∶75，磷酸調(diào)節(jié)pH為4.0，鹽酸小檗堿出峰時(shí)間合適，對稱性良好。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的方法簡便快速，穩(wěn)定性好，可為蛇傷膠囊的質(zhì)量控制提供參考。

［1］郤慶.HPLC法測定安心顆粒中鹽酸小檗堿的含量［J］.中國藥師，2014，17（3）：512-514.

［2］葉秀金.HPLC測定清肺抑火丸中鹽酸小檗堿的含量［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011（3）：90-92.

［3］張采瓊.HPLC法測定清熱寧腎膠囊中鹽酸小檗堿的含量［J］.成都大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014（2）：118-120.

［4］繆珊，栗艷，李捷，等.HPLC法測定參蛇軟膏中鹽酸小檗堿的含量［J］.中國藥師，2014，17（9）：1 576-1 578.

［5］陳威，趙東鳳，史紅娟，等.HPLC法測定梔子金花分散片中鹽酸小檗堿的含量［J］.承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014（1）：17-19.

［6］彭艷梅.HPLC法測定金英膠囊中鹽酸小檗堿的含量［J］.湖南中醫(yī)雜志，2014（2）：129-130.

［7］馮瑛，夏正燕，潘建明.HPLC法測定黃連降糖片中鹽酸小檗堿的含量［J］.中藥新藥與臨床藥理，2009（1）：70-71.

［8］張春玲.HPLC法測定金赤苓膠囊中鹽酸小檗堿含量［J］.中國社區(qū)醫(yī)師（醫(yī)學(xué)專業(yè)），2011（12）：8-9.

［9］李彩虹，彭罡，周克元.RP-HPLC定量三乙胺法測定中藥黃連中鹽酸小檗堿的含量［J］.東南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012（1）：8-11.

（編輯：梁葆朱）

Determination of berberine hydrochloride in Sheshang capsules by HPLC

Wang Weichen1，Yan Guohong1，Li Huang2，Xu Wei2，Chu Kedan2
（1.Pharmaceutical Department，People′s Hospital Affiliated to Fujian University of TCM，F(xiàn)uzhou Fujian 350004；2.School of Pharmacy，F(xiàn)ujian University of TCM，F(xiàn)uzhou Fujian 350122）

Objective：To establish a method for determination of berberine hydrochloride in Sheshang capsules.Method：The analysis was performed on a Diamonsil-C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）with a mobile phase of 0.05 mol/L sodium dihydrogen phosphate-acetonitrile（75∶25）at a detection wavelength of 346 nm and a flow rate of 1.0 mL/min.The column temperature was set at 35 degrees.The injection volume was 10 μL.Results：The content of berberine hydrochloride showed a good linear relationship in the range of 0.101 μg～1.008 μg（r=0.999 9）.The average recovery rate was 97.36%，RSD=1.23%（n=6）.Conclusion：The content determination method is simple，sensitive，accurate and reproducible，which provides the experimental basis for quality improvement of Sheshang capsules.

HPLC；Sheshang capsules；berberine hydrochloride

R286

A

1671-0258（2016）05-0026-03

王煒辰，E-mail：weichen@163.com