謝家泰 曾志榮

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bFGF和MRP-1在胃癌中的表達(dá)及意義

謝家泰1曾志榮2

目的 研究胃癌(GC)組織中堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和多重耐藥蛋白1(MRP-1)的表達(dá)規(guī)律及其相互關(guān)系。方法 用免疫組織化學(xué)染色(SP法)檢測慢性淺表性胃炎(CSG)25例、胃黏膜腸上皮化生(IM)45例、異型增生(Dys)50例和GC 65例組織標(biāo)本中bFGF、MRP-1陽性表達(dá)情況。RT-PCR技術(shù)檢測MRP-1mRNA的表達(dá)情況。均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，兩樣本率的比較用χ2檢驗(yàn)，兩因素的相關(guān)分析用直線相關(guān)分析。結(jié)果 在CSG→IM→Dys→GC的過程中，bFGF，MRP-1的表達(dá)呈逐步遞增趨勢，bFGF，MRP-1的陽性表達(dá)率GC組與Dys組、IM組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MRP-1與MRP-1mRNA表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)(r=0.598,P<0.05)。結(jié)論 胃癌形成過程中，bFGF，MRP-1，MRP-1mRNA表達(dá)逐漸上調(diào)。

胃癌 免疫組織化學(xué)染色 堿性成纖維細(xì)胞生長因子 多耐藥相關(guān)蛋白1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，死亡率位居第二位[1，2],其發(fā)病機(jī)理仍未完全闡明，中晚期患者治療效果欠理想。胃癌的生長分化受很多因素調(diào)控，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中起重要作用。化療是胃癌治療的主要方法之一，能夠減緩胃癌患者腫瘤細(xì)胞的繁殖，降低術(shù)后局部復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率，但胃癌細(xì)胞對化療的敏感程度不一，化療耐藥是治療失敗的重要原因。多重耐藥蛋白(MRP)介導(dǎo)的多重耐藥是非常重要的耐藥機(jī)制，其中MRP-1最為重要。本研究用免疫組化染色、RT-PCR技術(shù)分析慢性淺表性胃炎(CSG)、腸上皮化生(IM)、異型增生(Dys)和胃癌(GC)中MRP-1，MRP-1 mRNA和bFGF的表達(dá)，以探討MRP-1，bFGF與胃癌生長轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1.材料與方法

1.1 材料 收集2010年7月～2015年12月存檔石蠟標(biāo)本90例、術(shù)后新鮮標(biāo)本95例，共185例，其中CSG 25例，IM 45例，Dys 50例，GC 65例為手術(shù)切除胃癌標(biāo)本，按WHO腫瘤國際組織學(xué)新分類標(biāo)準(zhǔn)，GC組低分化23例，高中分化42例；CSG組為對照組。鼠抗人MRP-1 mAb，兔抗人bFGF rAb，免疫組織化學(xué)UltraSensitiveTMS-P試劑盒(Kit-9720)購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；引物、TRIZOLTM試劑購自TaKaRa大連公司；RT-PCR試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法 石蠟包埋病理標(biāo)本切片厚度4～5μm,采用免疫組織化學(xué)(SP法)方法按說明書步驟染色,以PBS替代一抗作為陰性對照,陽性對照為邁新公司提供的陽性對照片；取出新鮮標(biāo)本后,立即置于裝有液氮的保溫杯中保存,提取各組織總RNA，按說明書進(jìn)行RT-PCR檢測。

光學(xué)顯微鏡下每張組織切片攝取10個(gè)高倍視野,輸入DEIAS-2000P病理圖文分析系統(tǒng)，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞,后計(jì)算其陽性表達(dá)率。細(xì)胞無陽性染色為陰性，有陽性染色為陽性。取10μl RT-PCR反應(yīng)終產(chǎn)物，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠分析系統(tǒng)觀察、分析電泳結(jié)果；檢測目的基因和GAPDH的積分吸光度(A)值，計(jì)算二者的比值，得出各自mRNA的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對本文的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，兩樣本率的比較用χ2檢驗(yàn)，兩因素相關(guān)分析用直線相關(guān)分析(Pearson相關(guān)系數(shù))，取α=0.05，P<0.05為差異具有顯著性。

2.結(jié)果

2.1 慢性淺表性胃炎、腸上皮化生、非典型增生和胃癌中bFGF，MRP-1的表達(dá) bFGF陽性染色見于胞漿(圖1)，bFGF表達(dá)陽性在CSG2例、IM5例、Dys16例和GC33例，GC組與Dys組、IM組比較差異顯著(χ2值分別為13.001，4.802，P<0.05)。MRP-1陽性染色見于胞漿為棕黃色(圖2),MRP-l表達(dá)陽性在CSG 1例、IM5例、Dys17例和GC43例，GC組與Dys組、IM組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為5.113,16.305，P<0.05)。

圖1 bFGF的表達(dá):A：CSG(x200):B:IM(x400):C:Dys(x400)):D:GC(x400)

圖2 MRP-1的表達(dá):A：CSG(x200):B:IM(x200):C:Dys(x400)):D:GC(x400)

2.2 不同胃黏膜組織MRP-1 mRNA量的變化 RT-PCR顯示第1～3組的MRP-1 mRNA量顯著高于第4～8組(P<0.01)，從第4組到8組MRP-1mRNA量逐漸減少(圖3)，而高分化組明顯高于中低分化組(t=3.151，3.556，P<0.01)。各組內(nèi)MRP-1αmRNA相對表達(dá)量見表1、圖3。

注：M—Marker，1—低分化GC組，2—中分化GC組，3—高分化GC組，4—高度Dys組，5—輕度Dys組，6—高度IM，7—輕度IM組，8—CSG組。圖3 不同胃黏膜組織MRP-1mRNA變化

組別MRP?1mRNA1組060±0032組067±0033組095±0064組013±0025組012±0036組013±0027組008±0028組008±001

2.3 胃癌組織中bFGF與MRP-1表達(dá)的關(guān)系 見表2。

表2 bFGF與MRP-1在胃癌中陽性表達(dá)的相關(guān)性

注：χ2=2.698，P>0.05，Pearson相關(guān)分析r=0.756P<0.01。

2.4 bFGF、MRP-1表達(dá)與胃癌臨床病理關(guān)系 見表3。

表3 臨床病理參數(shù)與胃癌bFGF、MRP-1蛋白表達(dá)的關(guān)系

注：表中的P值為各組內(nèi)的比較值。

3.討論

3.1 癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有賴于新生血管的生成。bFGF是一種強(qiáng)有力的血管生成正性調(diào)控因子，與腫瘤的血管生成、浸潤轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后關(guān)系密切。它對腫瘤的作用機(jī)理是作為腫瘤自泌生長因子，促進(jìn)生成腫瘤形成所必需的血管。相關(guān)研究顯示[3，4]，有些腫瘤細(xì)胞通過自分泌或旁分泌bFGF而加速腫瘤血管生成和促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生。但是新生血管基底膜不完整，細(xì)胞發(fā)育不成熟，常形成裂隙，為腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件，同時(shí)新生血管為腫瘤細(xì)胞提供了營養(yǎng)，癌細(xì)胞生長加速，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移。

本研究中發(fā)現(xiàn)bFGF在CSG中表達(dá)率為4%,IM中表達(dá)率為11.1%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，bFGF在Dys中陽性率為32.0%，與CSG間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);bFGF表達(dá)在CSG與Dys，Dys與GC(陽性率為50.8%)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這表明bFGF高表達(dá)與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本研究顯示bFGF與腫瘤的分期、分化程度及轉(zhuǎn)移相關(guān),但與患者的年齡、性別及腫瘤大小無關(guān)，這表明bFGF不僅參與了胃癌發(fā)生，而且可能與癌細(xì)胞的浸潤能力增強(qiáng)、癌細(xì)胞進(jìn)入血管或淋巴管并形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示bFGF對胃癌患者的生物學(xué)行為產(chǎn)生一定影響，可作為預(yù)測胃癌發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移的新腫瘤標(biāo)志物。

3.2 化療是目前腫瘤治療的主要方法之一，但是由于耐藥現(xiàn)象的普遍存在，成為腫瘤化療的主要障礙，極大地阻礙了化療的效果。相關(guān)研究提示惡性腫瘤耐藥的產(chǎn)生，不僅需要腫瘤細(xì)胞克服自身產(chǎn)生的耐藥機(jī)制，也需要改變機(jī)體的抗腫瘤免疫效應(yīng)[5]，兩者相輔相成，尤其是繼發(fā)性耐藥，藥物化療作后腫瘤細(xì)胞與免疫系統(tǒng)如何相互作用，以致耐藥性產(chǎn)生，是當(dāng)前腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[6～8]。

MRP-1基因是腫瘤多耐藥途徑的最為重要的基因，可將化療藥物泵出胞外以致多耐藥產(chǎn)生，其耐藥機(jī)制可能是隨著化療次數(shù)的增加和療程的延長腫瘤細(xì)胞內(nèi)MRP-1基因過表達(dá)或腫瘤細(xì)胞本身存在MRP-1基因過表達(dá)，把化療藥物泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生[9，10]。也可能是改變了細(xì)胞漿及細(xì)胞器的pH值，減少藥物到達(dá)其作用部位的濃度，并逆濃度梯度把胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外而導(dǎo)致耐藥。本研究顯示胃癌中MRP-1蛋白和MRP-1m RNA含量較CSG，IM，Dys明顯增高(P<0.05)，提示胃癌細(xì)胞經(jīng)化療選擇后MRP-1表達(dá)上調(diào)或通過自身改變而產(chǎn)生了耐藥。本研究也顯示，MRP-1和MRP-1 mRNA在胃高分化腺癌中的表達(dá)高于胃中低分化腺癌，表明高分化腺癌比低分化腺癌更易產(chǎn)生耐藥性，與臨床胃中低分化腺癌藥物化療效果較好而高分化腺癌化療效果較差相符合。本研究顯示MRP-1的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)，但與腫瘤的臨床分期有關(guān)，說明胃癌耐藥現(xiàn)象與患者年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)，耐藥現(xiàn)象在早期較中晚期少見。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腫瘤組織中MRP-1表達(dá)率明顯增加,故MRP-1的檢測有助于化療藥物的選擇。臨床上制訂化療方案前，可先測定MRP-1的表達(dá)與否，避開MRP-1耐藥譜中的藥物，或采取一定措施來減少甚至逆轉(zhuǎn)MRP-1的表達(dá)。

3.3 胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移與多因素、多基因相關(guān)，除傳統(tǒng)耐藥機(jī)制外,多耐藥尚與腫瘤血管生成有關(guān)。有研究表明MRP-1能促進(jìn)bFGF分泌,腫瘤血管生成常與腫瘤大小不相吻合,腫瘤細(xì)胞常處于相對缺氧及營養(yǎng)缺乏狀態(tài)，缺氧不但使腫瘤細(xì)胞基因的不穩(wěn)定性增加,誘導(dǎo)基因擴(kuò)增，使多種蛋白表達(dá)改變，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥；而且誘導(dǎo)bFGF表達(dá),增加血管形成,亦促使腫瘤產(chǎn)生針對化療藥物的保護(hù)蛋白,從而增加抵抗化療的能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：bFGF與MRP-1共表達(dá)相關(guān),提示血管生成因子可能參與胃癌多藥耐藥的形成。

總之，我們的結(jié)果表明：bFGF與MRP-1之間具有一定的相關(guān)性，可能共同參與腫瘤多藥耐藥的形成。抑制血管生成和逆轉(zhuǎn)多耐藥蛋白表達(dá)相結(jié)合有可能成為治療對化療藥物耐藥的難治性腫瘤的有效途徑，值得進(jìn)一步深入研究。

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Expression and significance of bFGF and MRP-1 in gastric cancer

(XIE Jiatai1, ZENG Zhirong2.

1. Department of gastroenterology, Sanming first hospital affiliated to Fujian medical university, Sanming 365000; 2. Department of gastroenterology,the first affiliated hospital of Sun Yat-sen university, Guangzhou 510700, China.)

Objectives To study the expression of basic fibroblast growth factor (bFGF) and multidrug resistance protein 1 (MRP-1) in gastric cancer (GC) tissue and their relationship.Methods immunohistochemical staining (SP method) detecting the patients on chronic superficial gastritis(CSG) 25 cases，Intestinal metaplasia(IM) 45 cases，50 cases of dysplasia (dys) and positive expression of 65 cases GC tissue specimens in bFGF and MRP-1.RT-PCR technology to detect the expression of MRP-1mRNA.The mean compared with t-test，the sample was compared withχ2-test，linear correlation analysis with correlation analysis of two factors.Results In the process of CSG，IM，Dys，GC，bFGF，MRP-1 expression was gradually increasing，bFGF，MRP-1 positive expression rate of GC group to Dys，IM group，the difference was statistically significant (P<0.05).MRP-1 expression intensity was positively correlated with MRP-1mRNA (r=0.598，P<0.05).Conclusions bFGF，MRP-1，MRP-1mRNA expression was gradually increased during the formation of gastric cancer.

gastric cancer, immunohistochemistry, bFGF, MRP-1, RT-PCR

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬三明第一醫(yī)院 消化內(nèi)科 365000 2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 消化科 510700

10.3969/j.issn.1672-4860.2016.05.004

2016-7-17