杜娟，路義鑫，陳景濤

（1.東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司，黑龍江 哈爾濱 150069）

雞屎藤抗雞傳染性支氣管炎病毒的體外活性初步研究

杜娟1，2，路義鑫1，陳景濤2

（1.東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司，黑龍江 哈爾濱 150069）

現代研究表明雞屎藤具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等作用，對金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、肺炎雙球菌有抑制作用。本文選用雞胚成纖維細胞，采用傳染性支氣管病毒進行侵染，對半數細胞感染量進行測定。實驗結果表明雞屎藤提取液對體外傳染性支氣管病毒具有一定的抑制作用。

雞屎藤，雞傳染性支氣管炎，雞胚成纖維細胞

雞屎藤，又稱雞矢藤，為茜草科雞屎藤屬草本植物，廣泛分布于我國的陜西、甘肅、山東、江蘇、安徽、湖南、湖北、廣東、貴州等地區(qū)。雞屎藤中含有多種糖苷、黃酮、生物堿及揮發(fā)油成分，具有鎮(zhèn)痛消炎，抗氧化等功效，其新鮮枝葉被用于熬湯、禽畜飼料添補劑及其他食品加工中。目前，關于雞屎藤抗炎抗病毒等藥理活性已有報道，但未見雞屎藤對肉雞傳染性支氣管炎病毒的體外活性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品雞屎藤，于2015年9月采自中國科學院廣州華南植物園。1kg藥材加10倍量水煎1h，減壓抽濾。藥渣加5倍量水再煎1h抽濾，合并兩次濾液減壓濃縮至500mL，加95%乙醇至終濃度75%，4℃靜置過夜。離心取上清，調pH值至7.2～7.4，120℃高壓滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆?。利巴韋林，購于國藥集團榮生制藥有限公司，批號20150216。

1.1.2 雞胚9d SPF雞胚，購于中國農科院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.1.3 標準毒株傳染性支氣管炎病毒（IBV）標準株Mass41由中國農科院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈，本實驗室自行傳代保存。

1.2 方法

1.2.1 傳染性支氣管炎病毒的增殖尿囊腔法接種病毒：取出活雞胚，傳染性支氣管炎病毒IBV M41標準株按1:10稀釋后種毒，每個雞胚接種0.2mL病毒液。孵育48h后將雞胚置于4℃過夜處死。次日，取處死的雞胚，于超凈工作臺內用碘酒和75%乙醇消毒，用無菌注射器吸取尿囊液并離心10 min、3000rpm，取上清合并后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雞胚成纖維細胞（CEF）的制備取9d SPF雛雞于超凈工作臺中用碘酒和75%乙醇消毒，打開氣室后將雞胚取出置于無菌培養(yǎng)皿中，分離頭部，四肢和內臟，剪成1mm3左右小塊，用PBS溶液洗3遍后加5～6倍量0.25%胰酶37℃消化15min，加入細胞生長液終止消化并離心5min，1000rpm。棄上清，沉淀部分用PBS洗3次并吹打均勻，細胞計數并調整細胞密度至2×106個/mL，100μL/孔的細胞量滴入96孔板內，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)備用。

1.2.3 IBV半數細胞感染量測定（TCID50）取IBV尿囊液，10倍等度稀釋，加入長滿單層CEF的96孔板，測得IBV對CEF的半數細胞感染量（TCID50）為10-5，因此，使用時將IBV尿囊液稀釋100倍至終濃度103TCID50。

1.2.4 雞屎藤提取液對雞胚成纖維細胞最大安全濃度的測定用細胞維持液分別將雞屎藤提取液和利巴韋林稀釋為16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.50mg/mL及2.56、1.28、0.64、0.32、0.16、0.08mg/mL。取單層CEF的96孔板棄培養(yǎng)液后分別加入各濃度的雞屎藤提取液及利巴韋林，每濃度重復6孔，每孔100μL。置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每24h記錄并用MTT法測各孔490nm波長的OD值。

1.2.5 雞屎藤提取液體外抗IBV試驗根據以上實驗測出雞屎藤提取液和利巴韋林的最大安全濃度分別為4.0mg/mL及0.16mg/mL。取長至單層的CEF細胞進行如下分組：A組：預防組，CEF接種IBV前24h分別加入用細胞維持液稀釋為4.0、2.0、1.0、0.50、0.25、0.125mg/mL的雞屎藤提取液，每濃度做6個重復，每孔加100μL。置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后每孔加入100μL 103TCID50的病毒液。B組：治療組，取CEF細胞加入IBV后培養(yǎng)6h，分別加入雞屎藤提取液4.0、2.0、1.0、0.50、0.25、0.125mg/mL，每個濃度做6個重復，每孔加100μL。C組：雞屎藤提取液與利巴韋林同時加入組，在CEF細胞中同時加入利巴韋林及細胞維持液稀釋為4.0、2.0、1.0、0.50、0.25、0.125mg/mL的雞屎藤提取液，每個濃度做6個重復，每孔加100μL。以上均設空白對照組（僅細胞維持液）、陰性對照組（細胞維持液和103TCID50病毒液）、陽性對照組（利巴韋林和103TCID50病毒液）、無細胞調零孔（僅加細胞維持液）。所有分組均放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。24h后記錄并用MTT法測490nm波長下OD值。

2 結果

2.1 雞屎藤提取液對細胞的安全濃度

表1 不同濃度雞屎藤提取液和利巴韋林對CEF細胞的OD值影響（=±s，n=6）

表1 不同濃度雞屎藤提取液和利巴韋林對CEF細胞的OD值影響（=±s，n=6）

注：與空白對照組比較，**p＜0.01，*p＜0.05。

由表1可知：雞屎藤提取液濃度為4.0mg/mL的OD值與空白對照組的OD值無顯著性差異，初步確定4.0mg/mL為雞屎藤提取液最大安全濃度。利巴韋林濃度為0.16mg/mL是與空白對照組無顯著性差異，故利巴韋林的最大安全濃度為0.16mg/mL。

2.2 雞屎藤提取液體外抗IBV試驗#P＜0.05。

表2 雞屎藤提取液體外抗IBV實驗各組細胞OD值（=±s，n=6）

表2 雞屎藤提取液體外抗IBV實驗各組細胞OD值（=±s，n=6）

注：與空白對照組相比～～p＜0.01，～p＜0.05；與陰性對照組相比**p＜0.01，*p＜0.05；與陽性對照組相比##p＜0.01，

由表2可知：在預防組，治療組和同時作用組實驗中，雞屎藤提取液濃度為0.4、0.2、0.1、0.5、0.25、0.125時的OD值均明顯高于IBV感染細胞的OD值（p＜0.05），高濃度（4.0 mg/mL）時，抗IBV活性與陽性藥利巴韋林活性相當，因此雞屎藤提取液有明顯的抗IBV感染作用；同時，先給雞屎藤提取液后再感染IBV以及兩種同時給藥時的OD值要高于IBV感染后再給藥的OD值，據此可初步推測雞屎藤提取液對雞傳染性支氣管炎病毒IBV的預防作用更占主導。

3 結論與討論

雞屎藤作為我國傳統(tǒng)中草藥，有鎮(zhèn)痛、解毒、消炎等藥效作用，臨床療效顯著，安全且毒副作用較少。在我國南方部分地區(qū)有將雞屎藤用于禽畜飼料添加劑的傳統(tǒng)，而本實驗的結果初步驗證了雞屎藤提取液對雞傳染性支氣管炎病毒的拮抗預防作用，為雞屎藤作為禽畜飼料補充劑的開發(fā)利用提供實驗依據。

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10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．05.013