劉金立，劉淑閣，熊倩，韓麗，李偉，王萬恒，張昭軍，，4，李全貞

（1.溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院與生命科學學院，浙江 溫州 325035；2.中國科學院北京基因組研究所 中科院基因組科學與信息重點實驗室，北京 100101；3.山西國信凱爾生物技術有限公司，山西 太原 030006；4.中國科學院大學，北京 100049）

·論 著·

急性單核細胞白血病特異性miRNA分子標志物的鑒定

劉金立1，劉淑閣2，熊倩2，韓麗3，李偉1，王萬恒3，張昭軍1，2，4，李全貞1

（1.溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院與生命科學學院，浙江 溫州 325035；2.中國科學院北京基因組研究所 中科院基因組科學與信息重點實驗室，北京 100101；3.山西國信凱爾生物技術有限公司，山西 太原 030006；4.中國科學院大學，北京 100049）

目的：鑒定急性單核細胞白血病中特異高表達的microRNA（miRNA）。方法：通過分析急性單核細胞白血病細胞系（THP-1）與慢性粒細胞白血病細胞系（K562）的miRNA-seq數(shù)據(jù)，篩選一批在THP-1細胞系中顯著高表達的miRNA，通過實時熒光定量PCR技術對這些miRNA在THP-1和K562細胞系中進行驗證，獲得在THP-1細胞系中特異高表達的miRNA，再通過實時熒光定量PCR技術在急性單核細胞白血病患者骨髓樣品中進行驗證，鑒定有望應用于該類疾病臨床診斷的分子標志物。結果：最終篩選得到了3個在急性單核細胞白血病中特異高表達的miRNA分子標志物：let-7d-5p、miR-222-3p、miR-221-3p。結論：通過結合組學數(shù)據(jù)，利用實時熒光定量PCR技術在細胞系及臨床樣本中的驗證，最終鑒定了3個在急性單核細胞白血病中特異高表達的miRNA分子標志物。

急性單核細胞白血??；miRNA；實時熒光定量PCR；miRNA-Seq

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一種或多種造血干細胞及祖細胞發(fā)生克隆性惡變，從而造成正常造血功能紊亂的高度惡性疾病[1-2]。急性單核細胞白血?。∕5）屬AML形態(tài)學分型中的一種，除具有其他類型急性白血病常見的臨床癥狀外，其主要特征為皮膚及黏膜病變，腎功能衰竭也較其他白血病多見，起病急驟，病死率較高。目前，急性單核細胞白血病的臨床診斷方法主要以臨床癥狀為前提，形態(tài)學檢測為基礎，同時結合免疫學及細胞遺傳學指標。形態(tài)學和免疫學的方法檢測，需有豐富臨床經(jīng)驗的檢測人員，且由于主觀性偏差的存在易造成誤診；另外，單一的檢測方法也會使診斷效率和準確率大大降低[3]。近年來，分子診斷技術在急慢性白血病的臨床診斷中正發(fā)揮著重要作用。

microRNA（miRNA）是一類內源性、高度保守的非蛋白編碼的小分子RNA，主要通過抑制蛋白編碼基因的翻譯或降解mRNA來發(fā)揮調控作用[4]。研 究[5-7]表明：miRNA可廣泛參與發(fā)育周期、細胞增殖 和分化、細胞凋亡、新陳代謝、神經(jīng)調控、腫瘤發(fā)生 等各種生理和病理的調控過程。已有諸多研究[8-10]結果證實：miRNA的表達及功能異常調控可導致白血病的發(fā)生。目前絕大多數(shù)研究都是針對所有FAB分型的AML進行分析，由于AML各個分型在形態(tài)學及細胞遺傳學等方面不盡相同，使得現(xiàn)階段鑒定的miRNA在臨床分子診斷應用中受到極大限制，因此，鑒定特定類型的AML中特異性表達的miRNA分子標記物具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料 急性單核細胞白血病細胞系（THP-1）和 慢性粒細胞白血病細胞系（K562）購于ATCC，TRIzol? Reagent購于Life Technologies公司，sRNA sample prep kit購于Illumina公司，E.coli Poly（A）Polymerase和ATP購于New England Biolabs公司，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購于Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息技術篩選在M5型AML細胞系中特異表達的miRNA：利用項目組已有的THP-1與K562細胞系miRNA-Seq數(shù)據(jù)[11-12]，根據(jù)miRNA在2種細胞系中表達量的差異倍數(shù)進行初步篩選。

1.2.2 miRNA在細胞系中的篩選驗證：THP-1和K562 的細胞培養(yǎng)參照廠商操作指南，細胞內miRNA表達檢 測的主要步驟如下：以TRIzol? Reagent提取總RNA， 利用E.coli Poly（A） Polymerase和ATP對RNA進行加尾反應，通過RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄獲得cDNA。采用Maxima? SYBR Green/ROX qPCR Master Mix進行實時定量PCR 擴增。擴增體系為18 μL：cDNA 1 μL，SYBR Green 9 μL，上下游引物共6 μL，ddH2O 2 μL。擴增條件為：第一步50 ℃，2 min；第二步95 ℃，10 min；第三步95 ℃ 15 s，62 ℃，40 s，40個循環(huán)。內參對照標準U6及各miRNA正向及反向引物見表1。miRNA表達水平分析時，將其在K562細胞系中的表達水平標準化為1。

表1 引物序列

1.2.3 miRNA在M5型AML臨床病例骨髓樣品中的篩選驗證：患者行骨髓穿刺采集2 mL樣本后保存在乙二胺四乙酸抗凝管中，加入2 mL Trizol試劑吹打混勻后保存在-80 ℃以提取總RNA。所有病例均按照第3版《血液病診斷及療效標準》AML的診斷標準進行診斷。RNA的提取和miRNA的檢測參照1.2.2。以健康捐獻者的骨髓樣本為對照，在進行miRNA表達水平分析時，將其在對照中的表達水平標準化為1。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)使用前均需要進行方差齊性檢驗，然后進行student’s t-test分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 生物信息技術篩選在M5型AML細胞系中特異表達的miRNA 通過比較THP-1和K562細胞系的miRNA-seq測序數(shù)據(jù)，將miRNA在K562細胞系中的表達量標準化為1得到差異倍數(shù)，根據(jù)差異倍數(shù)＞5.0的標準篩選出16個miRNA作為本實驗進行研究的miRNA，見表2。這16個miRNA分別為：has-let-7b-5p、hsalet-7d-5p、hsa-miR-103b、hsa-miR-107、hsa-miR-128-3p、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-221-3p、hsamiR-222-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-29a-3p、hsamiR-29c-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-877-5p。

2.2 miRNA在細胞系中的篩選驗證 檢測到其中的8個miRNA在THP-1細胞中的表達量顯著高于k562細胞（P＜0.05）。這些miRNA是：hsa-let-7d-5p、hsamiR-103b、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-181a-5p、hsamiR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-23a-3p、hsamiR-320a，見圖1。

2.3 miRNA在M5型AML臨床病例骨髓樣品中的篩選驗證 8個miRNA在大多數(shù)患者樣品中均存在高表達現(xiàn)象，見圖2和表3。hsa-let-7d-5p在12個患者樣品中均較正常對照樣本至少高表達2倍，且其中10個（占83.33%）miRNAs的表達水平與對照樣本比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2A；hsa-miR-222-3p和hsa-miR-221-3p則在11個患者樣品中高表達至少2倍，且其中的10個miRNAs表達水平與對照樣本差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2B和2C。

圖1 16個miRNA在THP-1和k562細胞中的相對表達量

3 討論

自1993年首次發(fā)現(xiàn)miRNA以來[13]，研究者一直致力于探尋miRNA的重大意義。研究表明miRNA所在基因座的缺失、擴增、突變、表觀遺傳修飾沉默等均可引起miRNA的異常表達從而進一步導致腫瘤的發(fā)生[14]。人類大約有50%的已注釋miRNA位于與癌癥相關的基因組區(qū)域中，這表明miRNA與多種腫瘤密切相關[15]，miRNA也可調節(jié)造血干細胞的異常分化，從而促進白血病的發(fā)生[15-19]。Calin等[20]報道m(xù)iRNA-15a與miRNA-16-1的表達水平與慢性淋巴細胞白血?。╟hronic lymphoblastic leukemia，CLL）中Bal2呈負相關，兩者被認為是Bal2的反義作用因子。Mi等[3]在2007年篩選出27個在AML和急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）中具有差異表達的miRNA，6個在ALL中上調，21個在AML中上調，其中miR-128-a與miR-128-b在ALL中的表達明顯升高，而let-7b與miR-223在ALL中明顯降低，4個miRNA中的任意2條組合都可以區(qū)分ALL與AML，診斷精確率＞95%。本實驗通過高通量測序技術對K562、THP-1細胞系miRNA轉錄組進行了深入研究，不同miRNA在不同細胞系的差異表達可為急慢性白血病候選分子診斷物的鑒定提供新的重要信息資源[11]。利用高通量技術探尋AML miRNA表達譜的研究雖已有報道[3，21-26]，但對于AML不同亞型的miRNA轉錄組學方面還缺乏較為系統(tǒng)、深入的研究，尤其是針對某一特定類型AML的miRNA的研究。本實驗目的在于針對AML亞型中的急性單核細胞白血?。∕5）進行研究，希望能夠鑒定出一組可用于M5臨床診斷的miRNA分子診斷標志物。

圖2 8個miRNA分別在12例M5樣本中的相對表達量分析

本實驗最終篩選出3個在M5中特異高表達的miRNAs：hsa-miR-222-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-221-3p，可考慮作為M5的分子標志物。miR-222與miR-221高度同源，其基因位于X染色體區(qū)域，二者成簇分布，具有相同的種子序列，在人與小鼠等脊椎動物中高度保守。miR-221的作用靶點位于Kit mRNA的3’UTR區(qū)域，miR-221的表達升高，可在轉錄水平引起mRNA的翻譯抑制，Kit蛋白表達降低，從而抑制紅細胞的增殖分化；另外，miR-221可使內皮生物學發(fā)生改變，調控血管生成相關調控因子的表達。miR-222與腫瘤轉移及細胞增殖相關，上調miR-222的表達，可促進體外細胞增殖，同時還能促進裸鼠荷瘤模型中腫瘤的生長[27-30]；下調miR-222的表達，則可抑制體外腫瘤細胞增殖[31]；miR-221抑制劑經(jīng)膽固醇修飾后，也可抑制體內腫瘤的生長[32]。 以上研究表明，miR-222與miR-221有可能成為侵襲性腫瘤的一個重要治療靶點。let-7d屬let-7家族中成員之一，目前報道較多的是let-7與肺癌的關系，let-7在肺癌組織及細胞系中的表達均較低，同時與患者術后生存期的長短有關[33]。另有研究發(fā)現(xiàn)，let-7d在頭頸部鱗癌細胞中表達降低，并且與低生存率有一定關系[34]；let-7d在卵巢癌中缺失同時伴隨HMGA2表達升高也可預示預后不佳[35]，這些研究表明let-7d可能與疾病的預后相關。多項研究表明，let-7屬抑癌基因，但并非所有研究支持這一論點。Bruecker等[36]發(fā)現(xiàn)let-7a分別在卵巢上皮癌和肺癌中表達上調；Lawrie等[37]發(fā)現(xiàn)濾泡性淋巴瘤向彌漫性大B細胞瘤轉化與let-7b與let-7i的表達上調有關。本研究中l(wèi)et-7d在AML-M5型中表達上調，與其他研究報道的AML中miRNAlet-7d表達下調不一致，原因可能是本實驗采用骨髓標本，且是針對其中某一特定類型進行研究，因此尚需進一步深入探討。

表2 從高通量測序數(shù)據(jù)中篩選出的16個miRNA

表3 miRNA在M5型臨床病例骨髓樣品中的驗證篩選標準

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（本文編輯：吳彬）

Characterization of specific miRNAs in acute monocytic leukemia

LIU Jinli1, LIU Shuge2, XIONG Qian2,

HAN Li3, LI Wei1, WANG Wanheng3, ZHANG Zhaojun1,2,4, LI Quanzhen1. 1.School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035； 2.CAS Key Laboratory of Genome Sciences and Information, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100101； 3.Guoxinkaier Biotechnology of Shanxi, Taiyuan, 030006； 4.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100049

Objective: To characterize the molecular markers of microRNA (miRNA) with specifically high expression in acute monocytic leukemia. Methods: A batch of miRNAs was firstly screened out for their significantly higher expression in THP-1 (acute monocytic leukemia cell line) by analyzing high-throughput miRNA transcriptome sequencing data of THP-1 and K562 (chronic myeloid leukemia cell line). These miRNAs were further tested in the THP-1 and K562 cell line by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to obtain the specifically high expressed miRNAs in THP-1 cell line. Finally, these screened miNRAs were verified in bone marrow samples of acute monocytic leukemia patients by qRT-PCR. The finally verified miRNAs could serve the candidates for clinical diagnosis of this disease in the future. Results: Three miRNAs that are specifically highly expressed in acute monocytic leukemia including let-7d-5p, miR-221-3p and miR-222-3p were characteried. Conclusion: By integrating the bioinformatics analysis and verification in cell lines and patient bone marrow samples, we finally characterized 3 miRNAs as potential molecular diagnostic markers in acute monocytic leukemia.

acute monocytic leukemia； microRNA； quantitative real-time PCR； miRNA-Seq

R557

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.10.001

2016-02-26

國家重大科學儀器設備開發(fā)專項（2011YQ03013404）；國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）（2015AA020108）。

劉金立（1988-），女，山東德州人，碩士生。

共同通信作 者：李全貞，教授，Email：Quan.Li@UTSouthwestern.edu；張昭軍，教授，Email：Zhangzhaojun@big.ac.cn。