羅 丹，尹小平，王安東,3，田延河,梁 臻,巴 特,張江國(guó)

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中哈邊境口岸臀突客蚤檢出立克次氏體核酸

羅 丹1，尹小平2，王安東2,3，田延河2,梁 臻2,巴 特2,張江國(guó)2

目的 了解中哈邊境地區(qū)臀突客蚤(Xenopsyllaminax)中立克次氏體攜帶情況。方法 收集阿拉山口口岸臀突客蚤樣本，PCR擴(kuò)增立克次體17 kDa基因片段，PCR產(chǎn)物測(cè)序并BLAST比對(duì)，利用Mega 6.0構(gòu)建分子遺傳進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果 42.86%(3/7)的臀突客蚤攜帶立克次體，17 kDa基因遺傳進(jìn)化樹(shù)顯示與CandidatusRickettsiasenegalensis和Rickettsiabellii同源性最高。結(jié)論 中哈邊境口岸地區(qū)臀突客蚤攜帶立克次體核酸。

立克次體；臀突客蚤；PCR；中哈邊境；序列分析

立克次氏體(Rickettsia)為革蘭氏陰性菌，是專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生物，主要寄生于節(jié)肢動(dòng)物，可通過(guò)蚤、虱、蜱、螨傳播。立克次體病是一類(lèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的人獸共患自然疫源性疾病，從病人分離出病原體以及從基因檢測(cè)證據(jù)表明我國(guó)至少存在10種立克次體病[1]。蚤類(lèi)是鼠疫、鼠源性斑疹傷寒等多種自然疫源性疾病的重要醫(yī)學(xué)媒介，對(duì)人、畜的健康造成嚴(yán)重危害[2-3]。作為中世紀(jì)時(shí)傳播黑死病(腺鼠疫)的主要媒介，蚤是造成當(dāng)時(shí)歐洲1/4人口死亡的重要因素。臀突客蚤(X.minax)是準(zhǔn)噶爾盆地西半部大沙鼠(Rhombomysopimus)體表的優(yōu)勢(shì)蚤種，寄生于多種嚙齒類(lèi)及野生動(dòng)物體表，并可叮人吸血。國(guó)外分布于哈薩克斯坦巴爾喀什湖中南部等區(qū)域，可自然感染鼠疫[4]。我國(guó)不僅從大沙鼠及體表上而且從游離的臀突客蚤中檢測(cè)到鼠疫桿菌，但臀突客蚤是否攜帶立克次氏體病原至今國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)任何報(bào)道。本研究選取中哈邊境地區(qū)優(yōu)勢(shì)蚤種臀突客蚤，檢測(cè)立克次體攜帶情況，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 2015年在阿拉山口口岸城區(qū)、郊區(qū)、野外荒漠區(qū)設(shè)置14個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)，利用吸蚤器和粘蚤紙采集游離蚤，動(dòng)物體表采集法收集寄生于野鼠等動(dòng)物體表寄生蚤。

1.2 DNA提取 經(jīng)體式顯微鏡鑒定后，按照DNA提取說(shuō)明書(shū)(DNeasy Blood & Tissue kit (QIAGEN))提取蚤體DNA(20只/組)。將提取的DNA置于-20 ℃保存，備用。

1.3 蚤線(xiàn)粒體基因擴(kuò)增與序列分析 使用 LCO1490、HCO2198和F-Leu、R-Lys分別擴(kuò)增蚤體線(xiàn)粒體COI和COII基因[5](見(jiàn)表1)。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序序列登錄NCBI進(jìn)行Blast同源性比對(duì)。使用Mega 6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析阿拉山口口岸臀突客蚤線(xiàn)粒體COI和COII基因特征。

1.4 立克次體檢測(cè)與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 參照Clare A報(bào)道[6]，巢式PCR擴(kuò)增立克次體17-kDa基因(見(jiàn)表1)。選取PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送北京鼎國(guó)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行Blast同源性比對(duì)。利用Mega 6.0構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)，分析阿拉山口地區(qū)臀突客蚤感染立克次體的17-kDa基因特征。

表1 PCR擴(kuò)增引物和反應(yīng)條件
Tab.1 The primers and reaction condition of PCR

引物名稱(chēng)引物序列(5'-3')片段大小/bp預(yù)變性/℃,s變性/℃,s退火/℃,s延伸/℃,s循環(huán)數(shù)總延伸/℃,sLCO1490GGTCAACAAATCATA-AAGATATTGG68594,6094,4045,4072,603572,420HCO2198TAAACTTCAGGGTGAC-CAAAAAATCAF-LeuTCTAATATGGCAGATTAGT-GC72795,18094,3042,3072,153772,300R-LysGAGACCAGTACTT-GCTTTCAGTCATC17KD5GCTTTACAAAATTCTA-AAAACCATATA55095,30095,6058,6072,603572,30017KD3TGTCTATCAATTCACAACT-TGCCGTT17KD1GCTCTTGCAACTTCTATGTT43495,30095,3061,3072,303572,30017KD2CATTGTTCGTCAGGTTGGCG

2 結(jié) 果

2.1 樣本采集結(jié)果 采集樣本431只，在鏡下觀察初步鑒定為：臀突客蚤(見(jiàn)圖1)，長(zhǎng)吻角頭蚤，禿病蚤指名亞種、貓櫛首蚤指名亞種、印鼠客蚤、寬背纖蚤和修長(zhǎng)櫛眼蚤指名亞種。其中臀突客蚤140只，長(zhǎng)吻角頭蚤61只，禿病蚤指名亞種21只，貓櫛首蚤指名亞種75只，印鼠客蚤43只，寬背纖蚤55只，修長(zhǎng)櫛眼蚤指名亞種36只。

注：A雌 B雄圖1 臀突客蚤Fig.1 X. minax(A:♀;B:♂)

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 PCR擴(kuò)增蚤線(xiàn)粒體COI和COII基因片段經(jīng)電泳分析，分別在685 bp和727 bp處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期片段大小一致，見(jiàn)圖2。

圖A:蚤線(xiàn)粒體COI基因PCR擴(kuò)增結(jié)果;圖B: 蚤線(xiàn)粒體COII基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig A:The PCR product of COI gene from Siphonaptera;Fig B:The PCR product of COI gene from Siphonaptera圖2 PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 The PCR product of COI and COII from Siphonaptera

PCR擴(kuò)增斑點(diǎn)熱群立克次體17kD基因片段經(jīng)電泳分析，在434 bp處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期片段大小一致，見(jiàn)圖3。在7組臀突客蚤樣本中，有3組檢測(cè)到斑點(diǎn)熱群立克次體核酸，陽(yáng)性率為：42.86%(3/7)。

圖3 斑點(diǎn)熱群立克次體17 kD基因巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 The nest-PCR product of 17kD gene from SFGR

2.3 臀突客蚤線(xiàn)粒體基因序列分析：COI基因BLAST分析數(shù)據(jù)顯示，ALSK056與ALSK067與西班牙X.cunicularis(KF479238) 具有89%(575/648)的同源性；與美國(guó)Xenopsyllaskrjabini(KM890983)具有96%(421/440)的同源性；與美國(guó)X.conformisconformis(KM890983)具有92%(404/440)的同源性；與美國(guó)Xenopsyllaconformismycerini(KM890903)具有91%(415/458)的同源性。分子遺傳進(jìn)化樹(shù)顯示：阿拉山口口岸臀突客蚤與其它客蚤屬聚為一支，見(jiàn)圖4。COII基因BLAST分析顯示：ALSK056與與ALSK067與X.conformisconformis(KM890859)具有93%(630/678)的同源性；與西班牙X.conformismycerini(KM890770)具有92%(609/660)的同源性；與X.gratiosa(EU088169)具有89%(634/705)的同源性；與X.ramesis(KM890772)具有(585/649)的同源性。COII基因分子遺傳進(jìn)化樹(shù)顯示：阿拉山口口岸臀突客蚤可與其它客蚤屬可匯聚為一支，見(jiàn)圖5。

圖4 臀突客蚤線(xiàn)粒體COI基因系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of X. minax mitochondrial cytochrome coxidase subunit I(COI)genes

圖5 臀突客蚤線(xiàn)粒體COII基因系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of X. minax mitochondrial cytochrome c oxidase subunit II(COII)genes

2.4 斑點(diǎn)熱群立克次體17kD基因序列分析 BLAST分析顯示：ALSK055與美國(guó)CandidatusRickettsiasenegalensis(KU167052)具有較高的同源性，同源性為：99%(374/377)，與美國(guó)RickettsiafelisURRWXCal2(CP000053)具有較高的同源性，同源性為：97%(386/395)； ALSK056和ALSK057與RickettsiabelliiOSU 85-389具有99%(403/405)的同源性。分子遺傳進(jìn)化樹(shù)顯示：ALSK055與CandidatusRickettsiasenegalensis和RickettsiafelisURRWXCal2聚為一支，ALSK056和ALSK067與RickettsiabelliiOSU 85-389，Rickettsia bellii isolate H3(KJ534308，巴西)聚為一支，見(jiàn)圖6。

圖6 立克次體17kDa基因系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of Rickettsia 17kDa genes

3 討 論

邊境口岸地區(qū)快速識(shí)別蚤類(lèi)標(biāo)本，對(duì)防控蚤傳疫病具有重要意義。由于蚤類(lèi)個(gè)體非常微小，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定需要鑒定人員具備豐富的經(jīng)驗(yàn)，容易造成誤判，影響鑒定結(jié)果。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)逐步被應(yīng)用到種類(lèi)鑒定中。DNA條形碼技術(shù)是通過(guò)一段幾百堿基的標(biāo)準(zhǔn)化DNA分子序列進(jìn)行物種識(shí)別鑒定的技術(shù)，近年來(lái)，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于“隱存種”的發(fā)現(xiàn)，殘缺標(biāo)本的鑒定，宿主動(dòng)物的識(shí)別等。本研究通過(guò)使用線(xiàn)粒體COI和COII兩對(duì)基因?qū)ν瓮豢驮檫M(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，由于GenBank中沒(méi)有臀突客蚤的記錄，所以與之匹配的同源性最高的均為客蚤屬其他種。本研究首次在國(guó)際上報(bào)道了臀突客蚤的線(xiàn)粒體COI和COII基因序列。

隨著分子生物學(xué)在細(xì)菌分類(lèi)學(xué)中的應(yīng)用，16S rRNA、17kDa、OmpA、Ompb等基因是常見(jiàn)的分類(lèi)鑒定基因[7]。本研究使用立克次體17kDa基因?qū)Π⒗娇诳诎兜貐^(qū)蚤類(lèi)攜帶立克次體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示與CandidatusRickettsiasenegalensis和Rickettsiabellii同源性最高。SFGR是立克次體目中最復(fù)雜的一群立克次體，形態(tài)學(xué)差異不明顯，用表型的方法進(jìn)行種類(lèi)鑒定是極其困難的, Fournier等提出了立克次體新種的鑒定分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，基于16S rRNA和4個(gè)蛋白編碼基因gltA、ompA、ompB、geneD可以將立克次體分類(lèi)鑒定到屬、群、種的水平[8]。由于本研究尚未涉及對(duì)其他基因序列的分析，因此，仍不能準(zhǔn)確的識(shí)別臀突客蚤所攜帶的立克次體，但經(jīng)本研究可以證明：中哈邊境阿拉山口口岸臀突客蚤攜帶立克次體核酸，可為后期立克次體的研究奠定基礎(chǔ)。

臀突客蚤、印鼠客蚤、禿病蚤指名亞種和長(zhǎng)吻角頭蚤均為鼠疫的傳播媒介，阿拉山口口岸地區(qū)于2005年在大沙鼠中檢測(cè)到鼠疫桿菌，因此以上幾種蚤暴露于鼠疫感染的高風(fēng)險(xiǎn)中。本研究又在臀突客蚤中檢測(cè)到斑點(diǎn)熱群立克次體核酸，我們推測(cè)：臀突客蚤在阿拉山口口岸地區(qū)鼠疫和立克次體傳播中扮演主要角色。 阿拉山口口岸作為“一路一帶”向西推進(jìn)的橋頭堡，增加了蚤和鼠等媒介生物隨交通工具和貨物輸入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)。為此，口岸相關(guān)部門(mén)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)出入境交通工具、貨物中媒介生物的檢測(cè)和消毒，嚴(yán)防外來(lái)生物和“外來(lái)病”的入侵。

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Yin Xiao-ping, Email:yxpciq@163.com

Rickettsia isolated fromXenopsyllaminaxat China-Kazakh border

LUO Dan1, YIN Xiao-ping2，WANG An-dong2,3, TIAN Yan-he2,LIANG Zhen2, BA Te2, ZHANG Jiang-guo2

(1CollegeofMedicine，ShiheziUniversity,Shihezi832000,China;2AlashankouEntry-ExitInspectionandQuarantineAuthorityAlashankou833418,China;3CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi832000,China)

In order to investigate the infection state ofRickettsiafromX.minaxat China-Kazakh border,theX.minaxwere collected,and 17 kDa genes ofRickettsiawere tested by PCR,and the sequence was analyed by BLAST and phylogenetic allysied by Mage 6.0. Showed that the positive rate of 17 kDa gene ofRickettsiawas 42.86% (3/7) at Alashankou Port. The phylogenetic tree ofRickettsia17 kDa gene showed that the unculturedRickettsiasp. was the highest homology withCandidatusRickettsiasenegalensisandR.bellii.In conclusion theX.minaxinfectedRickettsiaat China-Kazakh border.

Rickettsia；Xenopsyllaminax；PCR；China-Kazakh border；sequence analysis

國(guó)家自然基金(No. 81560338)和新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(No.201442137-1)聯(lián)合資助

尹小平，Email:yxpciq@163.com

1.新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院,石河子 832000；

2.新疆阿拉山口檢驗(yàn)檢疫局,阿拉山口 833418；

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.014

R376

A

1002-2694(2016)08-0755-05

2016-02-14；

2016-03-24

3.新疆石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,石河子 832000

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81560338) and Autonomous Region Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur (No. 2010J01115).