蔡 亮，張 紅，高立冬，劉建高, 覃 迪，何方玲，劉佳惠，鄒義洲，李俊華

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漢坦病毒Hunan03株S基因克隆、表達(dá)及核蛋白免疫原性分析

蔡 亮1,2，張 紅1，高立冬1，劉建高1, 覃 迪1，何方玲1，劉佳惠1，鄒義洲2，李俊華1

目的 構(gòu)建漢坦病毒Hunan03株核蛋白基因原核重組表達(dá)載體，在大腸桿菌中進(jìn)行核蛋白表達(dá)，研究核蛋白的免疫性及免疫反應(yīng)性。方法 設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增漢坦病毒Hunan03株S基因完整開(kāi)放閱讀框(ORF)的引物，RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物克隆到pGM-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞TOP10，應(yīng)用藍(lán)白斑篩選、酶切、PCR鑒定，定向克隆到pGEX-6p-2原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化Ecoli.BL21 StarTM(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE、Western blot對(duì)重組蛋白進(jìn)行鑒定。應(yīng)用Glutathione Sepharose 4B純化柱純化重組蛋白，免疫新西蘭兔，建立間接ELISA法對(duì)核蛋白的免疫原性與免疫反應(yīng)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果 PCR擴(kuò)增S基因ORF區(qū)域產(chǎn)物大小約1 306 bp，重組載體pGEX-6p-2-S經(jīng)雙酶切、PCR、測(cè)序鑒定提示構(gòu)建成功；在37 ℃，IPTG濃度為0.8 mmol/L誘導(dǎo)5 h的條件下，表達(dá)出最高量的相對(duì)分子量約74 kDa的GST-NP融合蛋白。建立的間接ELISA法檢測(cè)GST-NP融合蛋白免疫后的新西蘭兔血清，IgM抗體滴度達(dá)1∶8 000，IgG抗體滴度達(dá)1∶16 000。結(jié)論 成功構(gòu)建了高效表達(dá)的漢坦病毒S基因重組表達(dá)載體，獲得了純度較高具有較好的免疫原性與免疫反應(yīng)性的核蛋白，為后續(xù)漢坦病毒單克隆抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。

漢坦病毒；S基因；原核表達(dá)；核蛋白免疫原性

漢坦病毒(Hantavirus, HV) 為分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，人和嚙齒類(lèi)動(dòng)物均可被感染，其L、M、S基因分別編碼依賴RNA的RNA聚合酶、包膜糖蛋白(G1、G2)及核衣殼蛋白(NP)[1]。NP又稱核蛋白，由S基因編碼，是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，免疫原性極強(qiáng)，刺激機(jī)體可引起強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的抗體滴度高、維持時(shí)間長(zhǎng)，在抗病毒免疫中起重要作用，不同株、型的病毒NP氨基酸序列保守，常用作為HV感染后的診斷蛋白[2,3]。在前期研究中我們從黑線姬鼠肺組織中分離到了漢坦病毒Hunan03株(GenBank No. JN712306)[4]，對(duì)S基因分子特征及核蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析[5,8]，在此基礎(chǔ)上我們將S基因的ORF區(qū)域克隆到pGEX-6p-2原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)核蛋白的免疫原性與免疫反應(yīng)性進(jìn)行了初步研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株與試劑 質(zhì)粒pGEX-6P-2(GE Healthcare, USA)，Glutathione Sepharose 4B蛋白純化柱(GE Healthcare, USA)，抗GST McAb(Cell Signaling Technology Inc，USA)，Ecoli.BL21 StarTM(DE3)、JM109(TIANGEN,北京)，Trizol、One-step RT-PCR System with Platinum○RTaq High Fidelity、Platinum○RPCR Super Mix、TOPO○R TA Cloning○R Kit(Invitrogen,USA)、T4 DNA連接酶、EcoRⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、1 000 bp DNA Marker、低分子量蛋白Marker(Fermentas,Canada)，膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒(Axygen,USA)。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)前期研究上傳至GenBank的漢坦病毒Hunan03株(GenBank No. JN712306)S基因編碼區(qū)序列及質(zhì)粒pGEX-6P-2多克隆位點(diǎn)，應(yīng)用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增S基因編碼區(qū)全長(zhǎng)的特異性引物，為了便于克隆與表達(dá)，在引物兩端引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基。上游引物pGEX-6P-2-F：5′-TAGAATTCTGATGGCAACTATGGAGG- 3′(5′端下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))；下游引物pGEX-6P-2-R : 5′-CGCTCGAGTTATAGTTTTAAAGGCTC- 3′(5′端下劃線部分為XholⅠ酶切位點(diǎn))，委托Invitrogen公司合成。

1.3 RNA提取、cDNA合成及PCR產(chǎn)物純化回收 Trizol 法提取HV鼠肺組織Hunan03株陽(yáng)性標(biāo)本總RNA，在引物pGEX-6P-2-F、pGEX-6P-2-R作用下，應(yīng)用One-step RT-PCR System with Platinum○RTaq High Fidelity試劑盒對(duì)S基因ORF區(qū)域進(jìn)行一步法逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用Axygen膠回收試劑盒對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。

1.4 TA克隆與鑒定 PCR產(chǎn)物純化回收后，參照TOPO○RTA Cloning Kit說(shuō)明書(shū)按照PCR產(chǎn)物與T載體1∶5的比例于22 ℃進(jìn)行連接反應(yīng)，取10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ecoli. TOP10，挑選陽(yáng)性克隆抽提質(zhì)粒，應(yīng)用Platinum○RPCR Super Mix試劑盒進(jìn)行 PCR鑒定，應(yīng)用EcoRⅠ、XhoⅠ于37 ℃進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.5 重組質(zhì)粒pGEX-6P-2/S的構(gòu)建與鑒定 鑒定后的TA克隆陽(yáng)性質(zhì)粒與pGEX-6P-2空質(zhì)粒在37 ℃條件下同時(shí)進(jìn)行EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切、電泳、目的片段回收純化。在1∶3比例下應(yīng)用T4 DNA連接酶于22 ℃連接反應(yīng)10 min，取連接產(chǎn)物10 μL轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞TOP10，涂布100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑選單克隆菌落，抽提質(zhì)粒，取1 μL進(jìn)行PCR鑒定。應(yīng)用EcoRⅠ、XholⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)pGEX-6P-2/S重組質(zhì)粒送Invitrogen公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.6 S基因的表達(dá) 將pGEX-6P-2/S重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工程菌Ecoli.BL21 StarTM(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑單克隆菌落于含100 ug/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中(2 mL)培養(yǎng)至OD值為0.6左右，加入不同濃度IPTG(0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L、1.2 mmol/L)，37 ℃水浴誘導(dǎo)培養(yǎng)3～8 h，離心收集菌體。

1.7 包涵體的溶解與復(fù)性 收集的菌體經(jīng)冰浴超聲裂解，應(yīng)用洗液Ⅰ(60 mmol/L EDTA，4% Triton X-100，1.5 mol/L NaCl，pH7.0)，洗液Ⅱ(0.1 mol/L Tris-Cl，20 mmol/L EDTA，2 mol/L Urea，pH7.0)洗滌，收集上清和包涵體，12%SDS-PAGE電泳。包涵體應(yīng)用溶解液(8 mol/L Urea，20 mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L EDTA，6 mmol/L DTT，pH8.0)溶解過(guò)夜后裝入含GST融合蛋白復(fù)性液(20 mmol/L Tris-Cl pH8.0，1 mmol/L EDTA pH8.0，0.9 mmol/L GSH，0.1 mmol/L GSSG)的透析袋中復(fù)性24 h。

1.8 GST-NP重組蛋白純化、Western blot 將10 mL Glutathione Sepharose 4B 加入GST蛋白純化柱，PBS洗滌至柱平衡，以0.1 mL/ min流速加入10 mL 的復(fù)性蛋白，使蛋白充分吸附，PBS 洗滌層析柱至重新平衡，超純水洗脫目的蛋白，具體操作參考GST蛋白純化柱說(shuō)明進(jìn)行。洗脫的GST-NP融合蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE 電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以抗GST McAb為一抗、HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體為二抗, ECL顯影，Western blot鑒定。

1.9 GST-NP重組蛋白濃度測(cè)定 在核酸蛋白分析儀上，采用A280紫外分光光度法，應(yīng)用BSA蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定純化后GST-NP濃度。

1.10 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)制備抗GST-NP重組蛋白特異性抗體 以鑒定的重組蛋白GST-NP為免疫原免疫新西蘭兔(雄性，6只，2.5～3.0 kg/只)，初次免疫用純化蛋白200 μg與等體積弗氏完全佐劑注射器攪拌混勻，皮內(nèi)多點(diǎn)注射，15 d后每隔10 d用純化蛋白100 μg與等體積弗氏不完全佐劑混勻，加強(qiáng)免疫3次；同時(shí)用純化蛋白的洗滌液和GST蛋白各免疫2只新西蘭兔作對(duì)照；每次免疫前于耳緣靜脈采血，末次免疫10 d后心臟采血，離心分離血清，保存于-20 ℃。

1.11 免疫血清抗GST-NP重組蛋白抗體滴度測(cè)定 用0.05 mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋純化的GST-NP重組蛋白至1 mg/L，按每孔100 μL包被酶標(biāo)板過(guò)夜，間接ELISA法檢測(cè)PBS系列稀釋的末次兔免疫血清，二抗為羊抗兔IgG-HRP和IgM-HRP 100 μL(1∶1 000稀釋)，TMB顯色，酶標(biāo)儀測(cè)定A450值，以對(duì)照組兔血清作陰性對(duì)照，待測(cè)樣本A450值/陰性對(duì)照A450值≥2.1(P/N值≥2.1)為陽(yáng)性，陽(yáng)性最高抗體稀釋度為血清效價(jià)。

2 結(jié) 果

2.1 S基因的PCR擴(kuò)增及TA克隆鑒定 Trizol提取后的RNA經(jīng)pGEX-6P-2-F、pGEX-6P-2-R引物進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增S基因，1.0%瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增條帶約1 306 bp，與預(yù)期大小一致，提示擴(kuò)增的DNA為目的片段。以抽提后的TA克隆質(zhì)粒為模板，用pGEX-6P-2-F、pGEX-6P-2-R引物對(duì)S基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)一約1 306 bp的目的條帶(圖1)，以構(gòu)建好的pUCm-T/S經(jīng)EcoR I、XhoI雙酶切鑒定，酶切后的產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)一約1 306 bp的目的條帶，與預(yù)期值一致。

2.2 pGEX-6P-2/S的構(gòu)建與鑒定 以抽提后的質(zhì)粒pGEX-6P-2/S為模板，以pGEX-6P-2-F、pGEX-6P-2-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可見(jiàn)一約1 306 bp的目的條帶(圖1)，與預(yù)期值一致。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XholⅠ對(duì)重組質(zhì)粒pGEX-6P-2/S進(jìn)行雙酶切，得到與目的基因(1 306 bp)及載體(4 985 bp)相同大小的2個(gè)片段(圖1)。挑取含插入片段pGEX-6P-2/S的陽(yáng)性克隆，用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒測(cè)序，結(jié)果表明S基因片段已經(jīng)成功的插入pGEX-6P-2載體，且插入方向正確。

2.3 測(cè)序結(jié)果分析 核蛋白基因編碼區(qū)以起始密碼ATG開(kāi)始，以終止密碼子TAA結(jié)尾，ORF長(zhǎng)1 290個(gè)核苷酸殘基，包括堿基A423個(gè)(32.79%)，堿基C244個(gè)(18.91%)，堿基G325個(gè)(25.19%)，堿基T298個(gè)(23.10%)，GC含量為44.11%，AT含量為55.89%，單鏈分子量約為391.41 kDa，編碼429個(gè)氨基酸(20種)，平均分子量為48.13 kDa，含量最高的氨基酸為L(zhǎng)eu(亮氨酸)，占總蛋白含量的9.79%(42/429)，含量最低的為Cys(半胱氨酸)和Trp(色氨酸)，僅各占1.17%(5/429)。

2.4 pGEX-6P-2/S的表達(dá)與鑒定 含重組質(zhì)粒pGEX-6P-2/S的E.coliStarTMBL21(DE3)菌株應(yīng)用不同濃度IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，SDS-PAGE凝膠電泳圖上均顯示特異性條帶，蛋白分子量與理論值一致，約為74 kDa。菌株在IPTG終濃度0.8 mmol/L、37 ℃條件下誘導(dǎo)5 h條件下，表達(dá)量最大(圖2)。菌體經(jīng)超聲波破菌，包涵體經(jīng)8 mol/L尿素溶解后過(guò)GST親和層析柱，SDS-PAGE凝膠電泳顯示單一的目的蛋白條帶，分子量與預(yù)期大小一致，約74 kDa，融合蛋白主要存在于不溶性的包涵體中。

2.5 NP蛋白的純化與Western blot鑒定 A280紫外分光光度法測(cè)得蛋白濃度為1.80 mg/mL。蛋白復(fù)性后經(jīng)GST蛋白純化柱純化，SDS-PAGE凝膠電泳顯示蛋白分子量約74 kDa(圖3)；以抗GST McAb為一抗、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗的Western blot在相應(yīng)位置出現(xiàn)特異性條帶。

2.6 重組蛋白免疫原性 重組蛋白免疫新西蘭兔4次后，間接ELISA法檢測(cè)血清中特異性IgG和IgM抗體顯著升高，其效價(jià)分別達(dá)到1∶16 000和1∶8 000以上，血清陽(yáng)性反應(yīng)率為6/6。同時(shí)陰性對(duì)照組兔免疫4次后，血清中未檢出抗GST-NP特異性抗體。

M:1 kb DNA ladder；1:PCR陰性對(duì)照；2:RT-PCR；3:重組質(zhì)粒pGEX-6P-2/S為模板的PCR產(chǎn)物；4:空質(zhì)粒pGEX-6P-2；5:重組質(zhì)粒pGEX-6P-2/S；6:重組質(zhì)粒pGEX-6P-2/S經(jīng)EcoR I、Xho I雙酶切；7:重組質(zhì)粒pUCm-T/S經(jīng)EcoR I、Xho I雙酶切M: 1kb DNA ladder；1:PCR negative control；2:RT-PCR；3:PCR products of recombinant plasmid pGEX-6P-2/S；4:Plasmid of pGEX-6P-2；5: Recombinant plasmid of pGEX-6P-2/S；6: Recombinant plasmid of pGEX-6P-2/S digested by EcoR I and Xho I；7: Recombinant plasmid pUCm-T/S digested by EcoR I and Xho I圖1 S基因原核重組質(zhì)粒pGEX-6P-2/S構(gòu)建(8 cm length gel,1×TAE,7V/cm,45 min)Fig.1 Construction of the prokaryotic expression recombinant plasmid of pGEX-6P-2/S

M：蛋白Marker;1-6: 0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L、1.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)pGEX-6P-2/S；7：空質(zhì)粒pGEX-6P-2；8：空菌E.coli BL21 StarTM(DE3)；9：pGEX-6P-2/S未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)M：Protein Marker,1-6: 0.2 mmol/L,0.4 mmol/L,0.6 mmol/L,0.8 mmol/L,1.0 mmol/L,1.2 mmol/L IPTG induced pGEX-6P-2/S,7：Plasmid of pGEX-6P-2,8：E.coli BL21 StarTM(DE3),9：pGEX-6P-2/S induced without IPTG圖2 重組質(zhì)粒pGEX-6P-2/S在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)(12%SDS-PAGE)Fig.2 Recombinant plasmid pGEX-6P-2/S expressed in Ecoli. BL21 StarTM(DE3)

M：蛋白Marker；1：pGEX-6P-2/S未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；2：pGEX-6P-2/S經(jīng)1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)；3：過(guò)GST蛋白純化柱前；4：過(guò)GST蛋白純化柱后；5：第一次洗脫液，6：第二次洗脫液M：Protein Marker，1：pGEX-6P-2/S induced without IPTG，2：pGEX-6P-2/S induced with 1.0 mmol/L IPTG，3:Induced products of pGEX-6P-2/S before purification，4：Induced products of pGEX-6P-2/S after purification，5：The first eluant，6：The second eluant圖3 Hunan03株漢坦病毒核蛋白純化效果分析(12%SDS-PAGE)Fig.3 The purification of hantavirus nucleoprotein of Hunan03(12%SDS-PAGE)

1：pGEX-6P-2/S經(jīng)0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物；2：純化后的pGEX-6P-2/S重組蛋白；3：pGEX-6P-2/S無(wú)IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)物1：The expression product of recombinant plasmid of pGEX-6P-2/S with 0.8 mmol/L IPTG，2：Purified recombinant pGEX-6P-2/S nucleoprotein，3：The expression product of recombinant plasmid of pGEX-6P-2/S without IPTG圖4 Hunan03株漢坦病毒核蛋白免疫印跡分析Fig.4 Immunoblot analysis of hantavirus recombinant nucleoprotein of Hunan03

表1 ELISA法檢測(cè)新西蘭兔免疫血清中GST-NP特異性抗體滴度及陽(yáng)性反應(yīng)率
Tab.1 Specificity antibody titer in New Zealand rabbit serum detected by ELISA and the positive rate analysis

分組Groups新西蘭兔(只)No.ofNewZealandrabbitIgM抗體滴度TiterofIgMIgG抗體滴度TiterofIgG陽(yáng)性率(%)Positiverate(%)免疫組Immunegroup6≥1∶8000≥1∶160006/6(100%)緩沖液對(duì)照組Buffersolutioncontrol2--0/2(0)GST對(duì)照組GSTcontrol2--0/2(0)

注：結(jié)果以待測(cè)標(biāo)本平均A450值/陰性對(duì)照A450值≥2.1為陽(yáng)性,以出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度作為該血清的滴度。

Note:If the ratio of the absorbance value of the sample to the negative control at 450nm was ≥2.1,the sample was considered as positive, and the highest serum dilution was the serum’s titer.

3 討 論

不同株、型的漢坦病毒核蛋白氨基酸序列相對(duì)保守，均攜帶有T細(xì)胞和B細(xì)胞抗原決定簇，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，可直接與體外轉(zhuǎn)錄病毒的RNA及被感染細(xì)胞的細(xì)胞器結(jié)合，起著調(diào)節(jié)病毒復(fù)制的作用[6]。以前漢坦病毒感染后的血清學(xué)診斷所用抗原常為病毒感染的組織細(xì)胞，其敏感性、特異性和可操作性不是十分理想，免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明重組的完整核蛋白或截短的核蛋白均具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，可替代天然抗原用于漢坦病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷[7]。

前期研究表明Hunan03株來(lái)源于野生黑線姬鼠，屬漢坦病毒HTN型，S基因編碼的核蛋白由428～433個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量為49～51 kDa，基因片段抗原位點(diǎn)呈非構(gòu)象依賴性。在感染細(xì)胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)時(shí)由于肽鏈的合成速度過(guò)快且缺乏足夠的時(shí)間和空間進(jìn)行折疊和盤(pán)曲，可形成顆粒狀包涵體[8]。本研究通過(guò)對(duì)漢坦病毒S基因的ORF區(qū)域進(jìn)行克隆、測(cè)序和表達(dá)，獲得了一分子量約74 kDa的GST-NP融合蛋白，SDS-PAGE試驗(yàn)表明融合蛋白以包涵體形式存在于菌體中，由于包涵體組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用低濃度的表面活性劑十二烷基磺酸鈉和低濃度的變性劑尿素等在低能量的超聲波中除去了大部分雜質(zhì)，采用含Triton X-100、EDTA的洗滌液洗滌包涵體，大部分雜蛋白得到了洗脫，用含8 mol/L尿素的溶解液對(duì)包涵體進(jìn)行了較好的溶解。pGEX-6P-2載體自身攜帶有分子量為26 kDa的在解毒過(guò)程中起重要作用的谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)，具有增加外源基因的表達(dá)、提高表達(dá)蛋白的可溶性和易純化的特點(diǎn)，我們應(yīng)用GST瓊脂糖凝膠純化柱一步分離到了純度較高的目的蛋白。

包涵體蛋白的復(fù)性是一個(gè)費(fèi)時(shí)且效率較低的過(guò)程，經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致重組蛋白的損失，是基因工程研究領(lǐng)域的瓶頸。本研究經(jīng)條件摸索后發(fā)現(xiàn)：采用緩慢透析法、氧化型和還原型谷胱甘肽相結(jié)合的方法對(duì)漢坦病毒核蛋白復(fù)性非常有效。即在4 ℃條件下，用8 mol/L Urea溶液作為起始透析液，然后逐漸降低透析液的尿素濃度，由于尿素濃度下降連續(xù)緩慢，減少了復(fù)性過(guò)程中蛋白沉淀，提高復(fù)性蛋白回收率。研究中還發(fā)現(xiàn)核蛋白含有較多的二硫鍵，我們通過(guò)在復(fù)性緩沖液中加入2 mol/L還原型谷胱甘肽GSH和0.2 mol/L氧化型谷胱甘肽 GSSG，能有效促進(jìn)二硫鍵的形成，有利于漢坦病毒核蛋白恢復(fù)其天然的空間結(jié)構(gòu)，從完全伸展的變性狀態(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，最大程度地恢復(fù)了變性后重組蛋白的生物活性。

將GST-NP重組蛋白包被酶標(biāo)板，以羊抗兔IgG-HRP和IgM-HRP為二抗，建立的間接ELISA法檢測(cè)免疫45 d之后的兔血清，IgG和IgM抗體其效價(jià)分別達(dá)到1∶16 000和1∶ 8 000以上，血清陽(yáng)性反應(yīng)率為100%。說(shuō)明重組蛋白GST-NP具有較好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，為后續(xù)漢坦病毒單克隆抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and expression of hantavirus nucleoprotein gene of Hunan03 and its immunogenicity

CAI Liang1,2, ZHANG Hong1, GAO Li-dong1, LIU Jian-gao1,QIN Di1,HE Fang-ling1, LIU Jia-hui1, ZOU Yi-zhou2, LI Jun-hua1

(1.HunanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,theKeyLaboratoryofMicrobialMolecularBiologyofHunanProvince,Changsha410005,China;2.SchoolofBasicMedicalScience,CentralSouthUniversity,Changsha410013,China)

We cloned the hantavirus nucleoprotein gene and expressed it inE.colifor laboratory diagnosis. The whole open reading frame(ORF)of hantavirus Hunan03 strain S gene was amplified by RT-PCR after designing specific primers, and the PCR products was cloned into the pGM-T vector and transformed into competent cell of TOP10 and identified by the assay of blue-white spot screening, PCR and enzyme digestion. Then, we directed cloned the S gene into the prokaryotic expression vector of pGEX-6p-2 and the recombinant plasmid of pGEX-6p-2/S was transformed into the competent cell ofE.coliBL21 StarTM(DE3) and induced by IPTG. We identified the expression product by SDS-PAGE and Western-blot. Results showed that the PCR product of S gene was about 1 306 bp. The recombinant plasmid of pGEX-6p-2/S was constructed successfully after being identified by PCR and double enzyme digestion. Under the condition of 37 ℃ and 0.8 mmol/L IPTG induction, the pGEX-6p-2/S has expressed a 74 kDa fusion GST-NP protein. The successful expression of the recombinant prokaryotic plasmid pGEX-6p-2/S will benefit to the laboratory diagnosis of hantavirus infection.

hantavirus; nucleoprotein gene; prokaryotic expression; Nucleoprotein immunogeicity

李俊華，Email: hncdc＿ljh@163.com

鄒義洲，Email:289034452@qq.com

1. 湖南省疾病預(yù)防控制中心，湖南省微生物分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410005；

2. 中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.006

373

A

1002-2694(2016)08-0711-06

2016-03-29；

2016-05-19

湖南省科技廳科研基金(No.2013TT2016)資助

Supported by the Project of the Scientific & Technological of Hunan province (No.2013TT2016).Corresponding authors: Li Jun-hua, Email: hncdc_ljh@163.com；Zou Yi-zhou, Email: 289034452@qq.com