李傳鋒，王建勇，黃大鵬

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶163319）

長(zhǎng)白豬ESR、PRLR及FSH-β基因多態(tài)性及與繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析

李傳鋒，王建勇，黃大鵬

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶163319）

ESR基因、PRLR基因和FSH-β基因是調(diào)控豬繁殖性狀的候選功能基因，以這三個(gè)基因?yàn)楹蜻x基因，以100頭長(zhǎng)白豬為研究對(duì)象，利用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)檢測(cè)到的多態(tài)性突變位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。同時(shí)，運(yùn)用系統(tǒng)工程原理，建立繁殖性能指數(shù)，構(gòu)建三個(gè)基因不同的多態(tài)位點(diǎn)與繁殖性能指數(shù)的最佳組合基因型，進(jìn)而將不同的基因型分別與繁殖指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，為人工篩選豬種最佳繁殖性能提供分子標(biāo)記。三個(gè)基因的組合基因型基因效應(yīng)分析結(jié)果表明：組合基因型AACDFF的繁殖指數(shù)與組合基因型ABCDFF和BBDDFF的繁殖指數(shù)分別相差3.34和3.16，表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）。

長(zhǎng)白豬；基因多態(tài)性；繁殖性狀；組合基因型

研究表明，雌激素受體基因（ESR）、催乳素受體基因（PRLR）和促卵泡素亞基基因（FSH-β）是調(diào)控豬繁殖性狀的候選功能基因，ESR可以激活配體轉(zhuǎn)錄因子［1］，能轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，ESR廣泛存在于動(dòng)物的細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)，參與雌性動(dòng)物性腺組織的基因表達(dá)和調(diào)控［2］。催乳素與乳腺上皮細(xì)胞的催乳素受體結(jié)合，從而刺激乳腺發(fā)育，促進(jìn)乳汁的生成與分泌；PRLR基因可直接作用于卵巢的顆粒細(xì)胞，抑制顆粒細(xì)胞的芳香酶活性，減少合成雌二醇，抑制排卵［3］；FSH-β基因主要是刺激卵泡的生長(zhǎng)和發(fā)育，影響生長(zhǎng)卵泡的數(shù)量，并在促黃體素的協(xié)同作用下，激發(fā)卵泡的最后成熟，誘發(fā)排卵［4］。試驗(yàn)以長(zhǎng)白豬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，選用ESR、PRLR和FSH-β三個(gè)基因作為候選基因，采用PCR-RFLP技術(shù)，檢測(cè)分析遺傳多態(tài)性，獲得不同豬群的基因頻率和基因型頻率，并通過(guò)與繁殖性狀關(guān)聯(lián)分析，獲得這三個(gè)候選基因在長(zhǎng)白豬群中對(duì)繁殖性狀有顯著影響的最佳基因型組合，從而實(shí)現(xiàn)高繁殖性能母豬的標(biāo)記輔助選育，為豬種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

研究選用哈爾濱谷實(shí)種豬繁育有限公司長(zhǎng)白豬純種經(jīng)產(chǎn)母豬100頭的血液樣本，血液樣本取自耳靜脈。同時(shí)，現(xiàn)場(chǎng)完整記錄所選經(jīng)產(chǎn)母豬的出生活仔數(shù)、初生窩重、泌乳力、斷奶窩重（28日齡）四個(gè)繁殖性能指標(biāo)數(shù)據(jù)。

1.2 主要試劑

北京博凌科為生物科技有限公司：通用基因組DNA快速提取試劑盒；北京康為世紀(jì)生物科技有限公司：2×Es Tap Master Mix（含染料）；ACD抗凝劑：將0.96 g檸檬酸、2.64 g檸檬酸鈉、2.94 g葡萄糖，加ddH2O定容至200 mL，混勻，制備成抗凝劑，經(jīng)高壓滅菌后留存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)

1.3.1 試驗(yàn)引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Genebank中豬的ESR基因內(nèi)含子3的序列（HF947275），PRLR基因外顯子10（HF947279），F(xiàn)SH-β基因內(nèi)含子1的序列（AF352695），利用Primer5.0設(shè)計(jì)軟件，分別設(shè)計(jì)出三對(duì)引物，所用引物見(jiàn)表1，所有引物交由上海生物工程有限公司合成。其中，F(xiàn)SH-β基因座等位基因的差異是由于E等位基因在FSH-β基因的第1個(gè)內(nèi)含子中存在一個(gè)220 bp轉(zhuǎn)座子插入，發(fā)生突變，從而電泳產(chǎn)生不同圖譜［5］。

表1 各基因引物序列、片段大小Table 1Primer sequences and size of PCR production

1.3.2 ESR、PRLR、FSH-β基因PCR反應(yīng)體系

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，使用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn)的2×Es Tap Master Mix（含染料）進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系如表2：

表2 ESR、PRLR、FSH-β基因PCR反應(yīng)體系Table 2The PCR reaction system of ESR、PRLR、FSH-β

1.3.3 ESR、PRLR、FSH-β基因PCR反應(yīng)條件

根據(jù)表2中的引物，參照北京康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn)的2×Es Tap Master Mix，建立最佳PCR反應(yīng)條件，如表3：

1.3.4 ESR、PRLR、FSH-β基因PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)

分別對(duì)每個(gè)體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL（無(wú)需再用上樣緩沖液），加入1%的瓊脂糖凝膠中，120 V電壓電泳中20 min，與1 000 bp DNA Marker作為對(duì)照，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察PCR擴(kuò)增情況，并照相。PCR產(chǎn)物無(wú)雜帶，且擴(kuò)增片段大小與設(shè)計(jì)相符，可進(jìn)行下一步操作。

1.4 設(shè)計(jì)模型

根據(jù)系統(tǒng)工程原理和繁殖性能各性狀的重要性，設(shè)計(jì)繁殖性能指數(shù)，計(jì)算公式如下：

其中：A代表出生活仔數(shù)（頭）；B代表仔豬初生窩重（kg）；C代表泌乳力（kg）；D代表斷奶窩重（kg）。

表3 ESR、PRLR和FSH-β基因PCR反應(yīng)條件Table 3The PCR reaction conditions of ESR，PRLR and FSH-β

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)白豬ESR、PRLR、FSH-β基因的PCRRFLP檢測(cè)結(jié)果

在100頭長(zhǎng)白豬中，采用PCR-RFLP檢測(cè)方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖2、圖3和圖4所示，其中圖2泳道2、5為AA型，泳道1、4為AB型，泳道3為BB型，M為DL500Marker；圖3中泳道3、5為CC型，泳道1、4為CD型，泳道2為DD型；圖4中泳道2為EE型：泳道4、7、8為EF型；泳道1、3、5、6為FF型。

圖1長(zhǎng)白豬ESR基因擴(kuò)增產(chǎn)物PCR-RFLP結(jié)果Fig.1Results of PCR-RFLP test of Landrace ESR gene amplification products

圖2 長(zhǎng)白豬PRLR基因擴(kuò)增產(chǎn)物PCR-RFLP檢測(cè)結(jié)果Fig.2Results of PCR-RFLP testof Landrace PRLR gene amplification products

圖3 長(zhǎng)白豬FSH-β基因PCR-RFLP檢測(cè)結(jié)果Fig.3Results of PCR-RFLP test of Landrace FSH-β gene amplification products

2.2 長(zhǎng)白豬三個(gè)基因的基因型頻率與等位基因頻率

檢測(cè)的100頭長(zhǎng)白豬中，ESR、PRLR、FSH-β基因基因型分布（頭數(shù)）、基因型頻率和基因頻率見(jiàn)表4。

表4 長(zhǎng)白豬三個(gè)基因的基因型頻率與等位基因頻率Table 4Genotype and allele frequency of three genes ofLandrace

表4可知，被檢測(cè)的100頭長(zhǎng)白豬中，ESR基因第3內(nèi)含子、PRLR基因第10內(nèi)含子和FSH-β內(nèi)含子1的擴(kuò)增片段都存在多態(tài)性，分別表現(xiàn)出三種基因型。其中，ESR基因型頻率表現(xiàn)為AA型＞AB型＞BB型，且A等位基因的頻率0.805高于B等位基因的頻率0.195；PRLR基因型頻率表現(xiàn)為CD型＞CC型＞DD型，且D等位基因的頻率0.480比C等位基因的頻率0.52略低；FSH-β基因型頻率表現(xiàn)為FF型＞EF型＞EE型，且E等位基因的頻率0.185遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于F等位基因的頻率0.815。三個(gè)基因x2值都小于x20.05（2）=5.99，P＞0.05，即在長(zhǎng)白豬中，三種基因都處于哈迪-溫伯格平衡狀態(tài)。

2.3 長(zhǎng)白豬ESR、PRLR、FSH-β基因的各基因型與繁殖性狀的關(guān)系

用SPSS13.0單因素方差分析，計(jì)算長(zhǎng)白豬ESR、PRLR、FSH-β基因的各基因型母豬的出生活仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、初生窩重、斷奶窩重及其標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果如表5：

表5 長(zhǎng)白豬ESR、PRLR和FSH-β基因的各基因型與繁殖性狀的關(guān)系Table 5Relationships ofLandrace ESR，PRLR and FSH-β gene genotypes with reproductive traits

由表5可知，在長(zhǎng)白豬中，ESR基因第3內(nèi)含子、PRLR基因第10內(nèi)含子和FSH-β內(nèi)含子1的擴(kuò)增片段都存在多態(tài)性，其中，ESR基因的AA型與繁殖指數(shù)的關(guān)系較AB、BB型，表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）；PRLR基因的CD型與繁殖指數(shù)的關(guān)系較CC型和DD型基因型，表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）；FSH-β基因的FF型與繁殖指數(shù)的關(guān)系較EE、EF型，表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）。

2.4 長(zhǎng)白豬ESR、PRLR、FSH-β基因的組合基因型與繁殖指數(shù)的相關(guān)性分析

用SPSS13.0單因素方差分析，計(jì)算長(zhǎng)白豬ESR、PRLR、FSH-β基因的各組合基因型母豬的出生活仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、初生窩重、斷奶窩重及其標(biāo)準(zhǔn)誤，如表6。

表6 長(zhǎng)白豬ESR、PRLR和FSH-β基因部分組合基因型與繁殖指數(shù)Y的關(guān)系Table 6Relationshipsof Landrace ESR，PRLR and FSH-β combinations of genotypes wich reproductive index Y

由表6可知，三個(gè)基因的部分組合基因型基因效應(yīng)分析結(jié)果表明：組合基因型AACDFF的繁殖指數(shù)與組合基因型ABCDFF和BBDDFF的繁殖指數(shù)分別相差3.34和3.16，表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）。組合基因型AACDFF為長(zhǎng)白豬中三種基因的最佳組合基因型。

3 討論

諸多研究表明已經(jīng)證實(shí)了ESR、PRLR和FSH-β單個(gè)基因的多態(tài)性與繁殖性能的關(guān)系，曹晶晶等［6］在檢測(cè)地方豬品種和外來(lái)豬種ESR基因PvuⅡ位點(diǎn)的多態(tài)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，A型等位基因是長(zhǎng)白豬的優(yōu)勢(shì)等位基因。馮富彥等［7］研究表明，在豫南黑豬，杜洛克豬，長(zhǎng)白豬，大約克夏豬4個(gè)種豬的PRLR基因中，AB基因型頻率明顯高于BB基因型頻率，并呈現(xiàn)出AB＞BB的趨勢(shì)。王立辛等［8］報(bào)道PRLR基因在長(zhǎng)白豬、大白豬和杜洛克豬群中基因頻率及基因型頻率情況，長(zhǎng)白群中AB的基因頻率最高，A等位基因在各種群中占主導(dǎo)地位。蘇先敏等［9］分別檢測(cè)出臺(tái)系大白豬、杜洛克豬和大白豬存在FSH-β基因多態(tài)性，三個(gè)豬群中的BB基因型均為優(yōu)勢(shì)基因型，初產(chǎn)長(zhǎng)白母豬繁殖性能BB基因型均顯著高于AA型和AB型。試驗(yàn)研究結(jié)果上述等人的研究結(jié)果相一致。

在種群的遺傳改良研究中，已有越來(lái)越多的學(xué)者探索組合基因型的分布頻率和影響效應(yīng)。毛同輝等［10］在宗地花豬ESR、FSH-β基因多態(tài)性及其與繁殖性能相關(guān)性表明，在宗地花豬基礎(chǔ)群中，ESR、FSH-β合并基因型的遺傳效應(yīng)無(wú)明顯規(guī)律性，只某些基因型下（如AAAA、AAAB、AABB基因型母豬的平均產(chǎn)活仔數(shù)）呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。趙西彪等［11］在AREG、ESR和FSH-β亞基基因與豬產(chǎn)仔數(shù)關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，在小梅山豬中，三個(gè)基因的合并基因型基因效應(yīng)分析結(jié)果表明，頭胎總產(chǎn)仔數(shù)合并基因型BBBBAA最高，合并基因型ABAAAA最低，相差4.045頭/胎；頭胎產(chǎn)活仔數(shù)和經(jīng)產(chǎn)胎總產(chǎn)仔數(shù)合并基因型BBABAB最高，合并基因型ABAAAA與合并基因型BBAAAA相等且為最低，分別相差4.063頭/胎和2.188頭/胎；經(jīng)產(chǎn)胎產(chǎn)活仔數(shù)合并基因型BBBBAA最高，合并基因型ABAAAB最低，相差3.705頭/胎。在大白豬群中，頭胎總產(chǎn)仔數(shù)、經(jīng)產(chǎn)胎總產(chǎn)仔數(shù)和經(jīng)產(chǎn)胎產(chǎn)活仔數(shù)合并基因型ABBBBB最高，合并基因型AAABAB最低，分別相差4.667頭/胎、4.300頭/胎和5.667頭/胎；頭胎產(chǎn)活仔數(shù)合并基因型ABBBBB最高，合并基因型ABAABB最低，相差4.333頭/胎。合并基因型的遺傳效應(yīng)高于單個(gè)基因基因型的遺傳效應(yīng)但不是各個(gè)基因型效應(yīng)的簡(jiǎn)單加和。熊統(tǒng)安等［12］在通城豬中就ESR、PRLR兩個(gè)基因在產(chǎn)仔數(shù)性狀方面是否有互作效應(yīng)進(jìn)行了探討，在6種組合基因型中，除了BBBB組合型在二胎比BBAB產(chǎn)仔數(shù)高出0.33以外，BBAB組合基因型母豬總產(chǎn)仔數(shù)在頭胎、經(jīng)產(chǎn)分別比其它4種組合基因型總產(chǎn)仔數(shù)都最高。

試驗(yàn)在長(zhǎng)白豬中，ESR、PRLR和FSH-β三個(gè)基因的組合基因型基因效應(yīng)分析結(jié)果表明：組合基因型AACDFF的繁殖指數(shù)與組合基因型ABCDFF和BBDDFF的繁殖指數(shù)分別相差3.34和3.16，表現(xiàn)為差異顯著（P＜0.05）。組合基因型AACDFF為長(zhǎng)白豬中三種基因的最佳組合基因型。在長(zhǎng)白豬的選育中，可以保留AACDFF組合基因型的母豬作為種用。

無(wú)論是單個(gè)基因型或多個(gè)基因的組合基因型，遺傳背景和環(huán)境的不同，其影響效應(yīng)也會(huì)不同［13-14］。母豬繁殖性能是由環(huán)境因素和遺傳因素所共同決定的，因而繁殖性狀在受ESR、PRLR和FSH-β基因影響的同時(shí)，還可能受如OPN（骨橋蛋白基因）、RBP4（視黃酸結(jié)合蛋白4）等其他基因和環(huán)境的影響，在今后的研究中，應(yīng)考慮組合基因型的分布頻率和影響效應(yīng)，篩選出最佳繁殖性能基因型組合。

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ESR，PRLR and FSH-β Gene Polymorphism and Association Analysis with Reproductive Traits in Landrace

Li Chuanfeng，Wang Jianyong，Huang Dapeng
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

ESR，PRLR，and FSH-β were the candidate genes regulating porcine reproductive traits.Based on these three candidate genes，100 landraces were selected to genotype the detected polymorphism mutations using PCR-RFLP.Meanwhile，the systems engeering principle was used to establish reproductive performance index to build the best polygenic combination of distinct polymorphic sites of these three genes under the same breed，then the relation between the reproductive index and different genotypes was analyzed，finally the results of correlation analysis on genotypes and reproductive traits were usedto provide a molecular marker for optimal reproductive performance of artificially selected three breeds.The genetic effect analysis of combinative genotype showed that the reproduction index of the combined genotype AACDFF differed from ABCDFF and BBDDFF by 3.34 and 3.16 respectively，which was significantly different（P＜0.05）.

landrace；polymorphism；reproductive traits；combinative genotype

S828

A

1002-2090（2016）04-0025-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.04.007

2015-02-15

李傳鋒（1987-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院2012級(jí)碩士研究生。

黃大鵬，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：hbf970304@163.com。