胡秀英，王仲偉，黃蘇珍*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇南京210095；2.江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所（南京植物園），南京210014）

甜菊（Stevia rebaudiana Bertoni）屬菊科（Compositae）甜菊屬（Stevia），又名甜葉菊、甜草、甜茶等，原產(chǎn)南美，因植物全株富含甜味物質(zhì)甜菊糖苷而得名，尤以葉片中含量最高。甜菊糖苷不僅具有甜度高（為蔗糖的300倍）、熱量低（僅為蔗糖的1/300）、口感好、穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)，還具有降血糖、降血壓、預(yù)防肥胖和齲齒等藥理作用，是一種非常理想的甜味劑[1-3]。因此，甜菊作為一種新興的糖料作物日益引起人們的關(guān)注和重視，并成為繼甘蔗、甜菜之后的最具開發(fā)價(jià)值的“第三糖源”。

我國(guó)甜菊自引種成功以來，國(guó)內(nèi)科研、生產(chǎn)單位高度重視，30多年來做了大量的研究工作，培育出一些糖苷含量高的優(yōu)良品種。甜菊品種的優(yōu)劣主要在于糖苷含量的高低，在以往研究中發(fā)現(xiàn)，甜菊快速生長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾期、植株開花后糖苷含量呈低-高-低的趨勢(shì)。中層成葉，上層幼嫩葉和下層衰老的葉片中，糖苷含量遞減。甜菊在現(xiàn)蕾期中層葉最多且糖苷含量也最高[4-5]。SOD活力、POD活力、可溶性糖含量和甜菊糖苷含量等也可以作為評(píng)價(jià)甜菊品種品質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)。而萊鮑迪苷（RA）含量與莖葉總產(chǎn)量等呈顯著負(fù)相關(guān)，甜菊糖苷含量則與各農(nóng)藝性狀間相關(guān)均不顯著[6-9]。甜菊干葉產(chǎn)量、莖稈產(chǎn)量與糖苷產(chǎn)量無直接的關(guān)系，但可以作為衡量推廣栽培的標(biāo)準(zhǔn)[10]。本文旨在研究11個(gè)甜菊品種糖苷躍變期理化特性與糖苷含量的相關(guān)分析，為不同品種甜菊提供精確的采摘期。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所甜菊實(shí)驗(yàn)苗圃。地理坐標(biāo)為北緯32°04′，東經(jīng)118°45′。2015年南京8月天氣最高溫度：37℃，最低溫度：21℃，月平均最高溫度：33.06℃，平均最低溫度：23.9℃。相對(duì)濕度71%～80%，光照強(qiáng)度可達(dá)7萬lx～9萬lx。

1.2 供試材料

試驗(yàn)于2015年7月29日至8月20日進(jìn)行，供試材料分別為譜星1號(hào)、江甜1號(hào)、江甜2號(hào)、江甜3號(hào)、守田3號(hào)、中山1號(hào)、中山2號(hào)、中山3號(hào)、中山4號(hào)、中山5號(hào)和中山6號(hào)。

1.3 測(cè)定方法

每天上午9點(diǎn)，采摘植株從上第三分支上的一對(duì)葉，鮮葉樣品一部分置于-80℃冰箱保存，用于測(cè)定相關(guān)理化指標(biāo)，一部分在105℃殺青，65℃烘干用于測(cè)試甜菊糖苷含量。分別選擇為現(xiàn)蕾前10d、前5d、初蕾期及現(xiàn)蕾后5d、現(xiàn)蕾后10d和開花期樣品，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.1 超氧化物歧化酶（SOD）活力測(cè)定 采用氮藍(lán)四唑（NBT）還原法[11]：取甜菊葉片，粉碎、過80目篩。稱取0.25 g草粉，加入5 mL 50 mmol/L pH 7.5磷酸緩沖溶液，攪拌均勻后置于4℃下浸提24 h。將濾液于12000 r/min離心20 min，上清液即為SOD粗酶液。

1.3.2 過氧化物酶（POD）活力測(cè)定 采用愈創(chuàng)木酚比色法[12]：取200 mL PBS（pH 7.0），加入0.076 mL液體愈創(chuàng)木酚攪拌溶解，再加入0.112 mL 30%的過氧化氫。取3 mL反應(yīng)液并加入50μL酶液。以PBS為對(duì)照調(diào)零，其反應(yīng)時(shí)間2 min的A470值計(jì)算酶活量。

1.3.3 可溶性多酚的測(cè)定 采取Folin-Ciocalteu法[13]：以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)甜菊葉多酚進(jìn)行測(cè)定。甜菊葉多酚70%乙醇提取料液比1∶100，水浴150min。在1mL甜菊葉多酚提取液中加入Folin-Ciocalteu試劑1mL，10%NaCO33mL。在30℃條件下反應(yīng)2h，測(cè)定其在750nm處的吸光度。

1.3.4 可溶性糖含量測(cè)定 采取蒽酮比色法[14]：固液比0.33g/mL，水浴溫度95℃，提取時(shí)間1h。

1.3.5 可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定 參照曲春香等考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[15]，取0.1g甜菊的鮮葉，用3mL 0.1 mol/L pH6.8的PBS進(jìn)行勻漿抽提，于4℃條件下，浸泡4h，在4℃條件下，12000r/min離心10min，上清液為蛋白質(zhì)粗提液。

1.3.6 糖苷的測(cè)定 對(duì)Jaitak等[16]的甜菊糖苷提取方法進(jìn)行了改良和簡(jiǎn)化，將甜菊葉片烘干磨成細(xì)粉，按料液比1∶50（m:v）加入80%（v:v）乙醇，80℃水浴提取30 min，使糖苷快速且充分地溶解。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel2010和SPSS16.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性以及變異系數(shù)統(tǒng)計(jì)分析[19，23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菊糖苷含量躍變期理化指標(biāo)分析

2.1.1 不同甜菊品種SOD活力變化規(guī)律 SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。SOD在生物體內(nèi)的水平高低意味著衰老與死亡的直觀指標(biāo)[17]。

由圖1可以看出，甜菊11個(gè)品種在現(xiàn)蕾期前除了守田3號(hào)和中山2號(hào)外差異均不顯著，而現(xiàn)蕾后11個(gè)品種均呈下降趨勢(shì)且各期差異顯著，其中江甜3號(hào)下降幅度最大，現(xiàn)蕾后10d比現(xiàn)蕾時(shí)下降了5.22%，守田3號(hào)下降幅度最小為0.75%；從SOD酶活性整體水平看，譜星1號(hào)、江甜1號(hào)、江甜2號(hào)、守田3號(hào)、中山1號(hào)、中山3號(hào)和中山6號(hào)SOD酶活力較強(qiáng)，其中江甜2號(hào)活力水平相對(duì)最高，江甜3號(hào)、中山2號(hào)和中山4號(hào)較低，中山5號(hào)為最低。

圖1 不同甜菊品種超氧化物歧化酶（SOD）活力變化Figure 1.The dynamic changes of superoxide dismutase（SOD）activity in different Stevia materials

2.1.2 不同甜菊品種POD活力變化規(guī)律 過氧化物酶（POD）是植物體內(nèi)重要的呼吸酶類，其活性的高低與植物體內(nèi)酚類物質(zhì)的代謝、植物抗性等密切相關(guān)。如圖2可知，在現(xiàn)蕾期前10d內(nèi)，過氧化物酶活性沒有顯著差異，其活性變化基本相同?，F(xiàn)蕾后5～10d除了江甜3號(hào)未出現(xiàn)明顯下降的變化外，其他有明顯變化，江甜1號(hào)下降最多（20%），江甜2號(hào)下降最少（3%）；從POD活性總體水平看，江甜2號(hào)POD酶活性水平相對(duì)最高，江甜1號(hào)POD酶活性水平是最弱的，僅為江甜2號(hào)的37.93%。

圖2 不同甜菊品種過氧化物酶（POD）活力變化Figure 2.The dynamic changes of peroxidase（POD）activity in different Stevia materials

2.1.3 不同甜菊品種多酚含量變化規(guī)律 植物中多酚含量的測(cè)定方法有很多，福林酚比色法是植物多酚類化合物常用的測(cè)定方法，具有成本低廉、操作簡(jiǎn)便易行、準(zhǔn)確度和精密度高等優(yōu)點(diǎn)。據(jù)圖3，只有中山1號(hào)、中山4號(hào)和中山5號(hào)在現(xiàn)蕾時(shí)多酚含量最高，中山6號(hào)在現(xiàn)蕾前5d達(dá)到最高，其他在現(xiàn)蕾前10d就達(dá)到最高值。從多酚含量總體水平來看，江甜2號(hào)、中山4號(hào)和中山6號(hào)多酚含量最多。

圖3 不同甜菊品種多酚含量變化Figure 3.The dynamic changes of polyphenol content in different Stevia materials

2.1.4 不同甜菊品種可溶性糖含量變化規(guī)律 糖類物質(zhì)與植物抗寒性關(guān)系密切，因植物品種不同而含糖量不同，抗寒性強(qiáng)的品種可溶性糖含量偏高，抗寒性弱的品種可溶性糖含量偏低。如圖4看出，11個(gè)甜菊品種的可溶性糖含量現(xiàn)蕾時(shí)最高，之后開始下降?，F(xiàn)蕾前中山4號(hào)和中山5號(hào)可溶性糖含量有明顯增加趨勢(shì)，其余品種差異不明顯，同時(shí)中山4號(hào)和中山5號(hào)可溶性糖含量較高；現(xiàn)蕾后除了中山2號(hào)，其他品種呈明顯下降趨勢(shì)，中山1號(hào)下降（2.91%）最多，中山2號(hào)下降（0.04%）最少。

圖4 不同甜菊品種可溶性糖含量變化Figure 4.The dynamic changes of soluble sugar content in different Stevia materials

2.1.5 不同甜菊品種可溶性蛋白含量變化規(guī)律 可溶性蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累對(duì)于降低細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的滲透勢(shì)、平衡原生質(zhì)體內(nèi)外的滲透壓等具有重要作用。如圖5，現(xiàn)蕾前除了江甜1號(hào)差異明顯外，其他品種差異不明顯，現(xiàn)蕾后除了譜星1號(hào)、中山2號(hào)和中山6號(hào)可溶性蛋白質(zhì)含量不明顯，其他差異明顯，江甜3號(hào)可溶性蛋白質(zhì)含量下降（2.83%）最多，譜星1號(hào)可溶性蛋白質(zhì)含量下降（0.06%）最少；從整體來看，譜星1號(hào)，中山2號(hào)和中山6號(hào)現(xiàn)蕾前后可溶性糖含量無明顯變化，其他品種現(xiàn)蕾前后明顯變化。中山3號(hào)在現(xiàn)蕾前10d就達(dá)到頂峰，其他品種現(xiàn)蕾時(shí)達(dá)到最大值。

圖5 不同甜菊品種可溶性蛋白含量變化Figure 5.The dynamic changes of soluble protein content in different Stevia materials

2.2 甜菊糖苷含量躍變期糖苷含量變化規(guī)律分析

甜菊糖苷含量是評(píng)價(jià)甜菊品種品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，不同甜菊品種間糖苷含量存在明顯的差異，因此其品質(zhì)亦有顯著差異。

根據(jù)上面的方法，我們選擇11個(gè)甜菊品種進(jìn)行測(cè)量甜菊糖苷和萊鮑迪苷A含量，這里的糖苷含量是甜菊糖苷和萊鮑迪苷A含量之和，11份樣品中甜菊糖苷總含量為7%～11%。結(jié)果如圖6可以看出，除了中山1號(hào)、中山4號(hào)和中山6號(hào)現(xiàn)蕾期變化差異性不顯著，其他品種在現(xiàn)蕾期前后變化差異性顯著，下降最多的是江甜1號(hào)（3.89%），下降最少的是中山5號(hào)（0.22%）；從整體來看，江甜1號(hào)、守甜3號(hào)和中山6號(hào)糖苷總含量最高，江甜2號(hào)、中山1號(hào)、中山3號(hào)和中山4號(hào)糖苷總含量較低。譜星1號(hào)和中山3號(hào)在現(xiàn)蕾前5d達(dá)到最大值，其他9個(gè)品種在現(xiàn)蕾時(shí)達(dá)到頂峰。

圖6 不同甜菊品種糖苷含量變化Figure 6.The dynamic changes of glycosides in different Stevia materials

2.3 甜菊糖苷含量及產(chǎn)量與理化特性相關(guān)分析

如圖7，11個(gè)甜菊品種在初蕾期，中山6號(hào)和守田3號(hào)的糖苷含量最高，江甜1號(hào)、譜星1號(hào)、江甜3號(hào)、中山5號(hào)和中山2號(hào)糖苷含量較高，中山3號(hào)、江甜2號(hào)和中山4號(hào)糖苷較低，中山1號(hào)糖苷含量最低。按糖苷含量高低順序，產(chǎn)量、SOD活力和POD活力呈多峰曲線，各品種間差異明顯，多酚含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量曲線呈直線趨勢(shì)，各品種間無明顯差異性。如圖8，11個(gè)甜菊品種中，譜星1號(hào)從初蕾期到始花期糖苷含量下降最多，在初蕾期其糖苷含量比江甜3號(hào)和中山5號(hào)多，在始花期低于江甜3號(hào)和中山5號(hào)，其他與初蕾期保持一致。

圖7 11個(gè)甜菊品種初蕾期糖苷含量高低順序及生理指標(biāo)變化Figure7.The stevioside content sequence and physiological changes of 11 Stevia varieties in early bud

圖8 11個(gè)甜菊品種始花期糖苷含量高低順序及生理指標(biāo)變化Figure 8.The stevioside content sequence and physiological changes of 11 Stevia varieties in early flowering

3 討論

在正常情況下，植物的葉綠體和線粒體在電子傳遞過程中會(huì)產(chǎn)生活性氧，在POD、SOD的共同作用下，可以清除氧的自由基，減少自由基對(duì)膜的損傷，使活性氧處于產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡[9，18]。李強(qiáng)棟等認(rèn)為生殖生長(zhǎng)階段嫩葉適宜選用POD分析[19]。本文研究結(jié)果，POD、SOD酶活力在現(xiàn)蕾前保持穩(wěn)定，現(xiàn)蕾后稍有下降，這與廖春麗[21]等對(duì)大蒜和徐小萬[21]等人對(duì)辣椒研究結(jié)果一致。

可溶性糖和蛋白質(zhì)是一項(xiàng)質(zhì)量和資源評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，甜葉菊在花蕾期可溶性糖和蛋白質(zhì)達(dá)到最高，何開躍等人[22-23]研究矮牽牛和高山杜鵑的蕾期可溶性糖含量高于花期。本文研究結(jié)果，可溶性糖與可溶性蛋白含量在蕾后開始下降，與糖苷呈正相關(guān)性。表現(xiàn)在現(xiàn)蕾前1個(gè)月里，植株矮小、生長(zhǎng)緩慢?，F(xiàn)蕾期是生長(zhǎng)發(fā)育的轉(zhuǎn)折時(shí)期，因?yàn)榈厣?、地下部分生長(zhǎng)量達(dá)到一定的基礎(chǔ)，并且此時(shí)氣溫升高，植株生長(zhǎng)加快，同時(shí)植株生長(zhǎng)也進(jìn)入生殖生長(zhǎng)，所以此時(shí)各理化特性達(dá)到頂峰。初花期是營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)兩旺的時(shí)期，開始生殖生長(zhǎng)強(qiáng)于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)分配以供應(yīng)花為主，葉面積指數(shù)達(dá)到最大值。

翁伯琦等人[24]研究表明花生花針期、結(jié)莢期和飽果期花生葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量變化趨勢(shì)基本一致。11個(gè)甜菊品種在現(xiàn)蕾期前后，其多酚含量、可溶性糖、可溶性蛋白含量與糖苷含量變化趨勢(shì)一致，這與花生相同?，F(xiàn)蕾前后理化特性無明顯變化，采摘期可從現(xiàn)蕾前10d開始持續(xù)到現(xiàn)蕾后10d?，F(xiàn)蕾前明顯增加的，采摘期切忌提前，現(xiàn)蕾后理化特性明顯下降，采摘期一定要在現(xiàn)蕾時(shí)。

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