程龍飛，林群群，許利娜，施少華，陳翠騰，仇微紅，萬(wàn)春和，陳紅梅，彭春香，葉賀佳，黃 瑜

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州350013；2.廣州市華南生物藥品有限公司，廣州 511300）

·研究論文·

2型和11型鴨疫里默氏菌二價(jià)滅活苗的研制

程龍飛1，林群群1，許利娜2，施少華1，陳翠騰1，仇微紅2，萬(wàn)春和1，陳紅梅1，彭春香1，葉賀佳2，黃 瑜1

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州350013；2.廣州市華南生物藥品有限公司，廣州 511300）

為研制血清2型和11型鴨疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA）二價(jià)滅活疫苗，以RA1325株（2型）和RA1229株（11型）為菌種，經(jīng)培養(yǎng)、滅活、濃縮，混合后制成二價(jià)滅活油乳劑疫苗。將疫苗皮下接種7日齡番鴨，免疫后7、14、21、56、63、70、77 d進(jìn)行攻菌試驗(yàn)，測(cè)定疫苗的免疫原性。免疫后每隔7 d用ELISA方法測(cè)定血清中的抗體。結(jié)果表明，疫苗免疫后14 d產(chǎn)生良好保護(hù)，保護(hù)率超過(guò)80%，免疫持續(xù)期可達(dá)60 d。免疫后14 ～ 63 d抗體效價(jià)處于較高水平，說(shuō)明研制的二價(jià)滅活疫苗能對(duì)血清2型和11型RA引起的鴨疫里默氏菌病產(chǎn)生良好的預(yù)防效果。

鴨疫里默氏菌；2型；11型；二價(jià)滅活疫苗；保護(hù)指數(shù)

鴨疫里默氏菌病，又名鴨傳染性漿膜炎，是由鴨疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer，RA）感染引起的各品種雛鴨和雛鵝的一種急性或慢性敗血性傳染病，導(dǎo)致發(fā)病禽死亡，耐過(guò)禽生長(zhǎng)不良，飼料轉(zhuǎn)化率降低，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。生物安全模式飼養(yǎng)、疫苗接種結(jié)合適當(dāng)?shù)乃幬飸?yīng)用是預(yù)防該病最經(jīng)濟(jì)有效的方法。國(guó)際上公認(rèn)的RA血清型有21種[2]，我國(guó)流行的RA血清型多達(dá)15種[3]。不同血清型菌株之間缺乏足夠的交叉保護(hù)，只有選擇與流行菌株相同血清型菌株制備的滅活苗才能提供最佳的免疫保護(hù)[4]。血清11型RA在我國(guó)流行的報(bào)道最早見(jiàn)于1999年，程龍飛等[5]發(fā)現(xiàn)2006年以來(lái)，11型RA的流行呈逐年上升的趨勢(shì)，2012年，血清2型和11型合計(jì)已超過(guò)流行菌株的80%。為適應(yīng)RA的流行新情況，本研究對(duì)血清2型和11型RA二價(jià)滅活疫苗實(shí)驗(yàn)室制品進(jìn)行了研制。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鴨疫里默氏菌RA1325株（2型）和RA1229株（11型），作為滅活疫苗的生產(chǎn)和檢驗(yàn)用菌種，均保存于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基 改良TSA平板和改良LB[6]。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1日齡番鴨，雌雄不限，體重60 ～70 g，隔離飼養(yǎng)至所需日齡。

1.2 方法

1.2.1 滅活油乳劑疫苗的制備 兩株細(xì)菌分別培養(yǎng)、計(jì)數(shù)、滅活、滅活檢驗(yàn)、濃縮，混合制備水相，與油佐劑按常規(guī)方法制成滅活油乳劑疫苗[6]。

1.2.2 疫苗的無(wú)菌檢驗(yàn) 按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行常規(guī)的無(wú)菌檢驗(yàn)。取3塊改良TSA平板，每個(gè)平板接種疫苗300μL，于燭缸中37℃恒溫箱培養(yǎng)48 h后觀察。

1.2.3 疫苗的安全檢驗(yàn) 對(duì)7日齡番鴨分別進(jìn)行1次單劑量接種、單劑量重復(fù)接種（間隔14 d）、超劑量（2倍量）接種試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)用鴨10羽，觀察7 d，察看并記錄試驗(yàn)鴨的精神狀態(tài)、采食、排糞、眼鼻分泌物等，觀察期結(jié)束后全部鴨處死剖檢，檢查注射部位的疫苗吸收情況。

1.2.4 疫苗的免疫期測(cè)定 7日齡番鴨隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組180羽，對(duì)照組130羽。免疫組鴨每只皮下注射疫苗0．3 mL，對(duì)照組鴨每只皮下注射生理鹽水0．3 mL，同條件隔離飼養(yǎng)。免疫后7、14、21、56、63、70、77 d，取免疫鴨12羽和對(duì)照鴨8羽，每羽注射RA1325株0．5 mL；另取免疫鴨12羽和對(duì)照鴨8羽，每羽注射RA1229株0．5 mL，觀察10 d。記錄各組死亡數(shù)量，統(tǒng)計(jì)各免疫組的保護(hù)率。當(dāng)對(duì)照組死亡率未達(dá)到100%時(shí)，以保護(hù)指數(shù)[7]來(lái)計(jì)算。保護(hù)指數(shù)＝（對(duì)照組死亡率－試驗(yàn)組死亡率）／對(duì)照組死亡率×100%

1.2.5 疫苗免疫后的抗體檢測(cè) 7日齡番鴨隨機(jī)分為2組，每組20羽。實(shí)驗(yàn)組鴨每只皮下注射疫苗0．3 mL，對(duì)照組鴨每只皮下注射生理鹽水0．3 mL，同條件隔離飼養(yǎng)。每隔7 d每組隨機(jī)取12羽，頸靜脈采血分離血清。分別以RA1325株和RA1229株的全菌裂解液為包被抗原，測(cè)定抗體效價(jià)[8]。

2　結(jié)果

2.1 疫苗無(wú)菌檢驗(yàn) 常規(guī)無(wú)菌檢驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。3個(gè)改良TSA平板亦無(wú)菌生長(zhǎng)，說(shuō)明無(wú)菌檢驗(yàn)合格。

2.2 疫苗安全檢驗(yàn) 觀察期內(nèi)各安全檢驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)鴨精神良好，采食、排糞正常，眼鼻無(wú)異常分泌物。觀察期結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)鴨處死剖檢，注射局部疫苗吸收良好，無(wú)紅腫硬結(jié)出現(xiàn)。

2.3 免疫持續(xù)期 免疫后7 d，免疫組開始產(chǎn)生保護(hù)，但保護(hù)率不高。免疫后14 d和21 d，免疫組對(duì)兩株菌的攻擊均能提供80%以上的保護(hù)，最高達(dá)91．6%。免疫后56 d即番鴨63日齡開始，提高攻菌數(shù)，仍然無(wú)法造成對(duì)照組100%的死亡率，故引入保護(hù)指數(shù)來(lái)表示。免疫后56 d和63 d，免疫指數(shù)仍然超過(guò)80%，因此將免疫持續(xù)期確定為免疫后60 d。

2.4 免疫后抗體水平的變化規(guī)律 以免疫后天數(shù)為橫坐標(biāo)，以抗體效價(jià)平均數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制的免疫后抗體水平的變化趨勢(shì)（圖1）。對(duì)照組鴨血清中的抗體效價(jià)始終為陰性。試驗(yàn)組免疫后7 d，血清中開始出現(xiàn)特異性抗體，免疫后28 d，抗體的效價(jià)最高，然后逐漸回落，63 d后抗體效價(jià)迅速下降。免疫后14～63 d，抗體效價(jià)始終保持較高水平。抗體水平與攻菌試驗(yàn)的結(jié)果具有一定的相關(guān)性。

表1　2型和11型鴨疫里默氏菌攻菌試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The challenge result of Riemerella anatipestifer sevotype 2 and sevotype 11 to ducks

3 討論

圖1　免疫后抗體水平消長(zhǎng)規(guī)律Fig.1 The dynamic change of antibody against RA

鴨疫里默氏菌病在我國(guó)主要養(yǎng)鴨區(qū)均有流行，鵝感染RA也常見(jiàn)報(bào)道。不同學(xué)者在不同地區(qū)發(fā)現(xiàn)的流行菌株的血清型并不完全一致，近期研制的疫苗有1型[9]、2型[10]、10型[11,12]、1型和2型[6,13,14]、1型2型和3型三價(jià)[4,15]、1型2型和4型三價(jià)[16]等滅活疫苗，都能適應(yīng)不同地區(qū)不同時(shí)期臨床生產(chǎn)的需要。張大丙等[17]確定他們1997年以來(lái)收集的菌株中就有血清11型菌株的存在，近幾年血清11型鴨疫里默氏菌的報(bào)道越來(lái)越多[5,18-21]，已成為較常見(jiàn)的血清型之一。本研究試制的血清2型和11型鴨疫里默氏菌二價(jià)滅活疫苗，安全性好，注射部位疫苗吸收良好；攻菌試驗(yàn)表明，免疫后7 d即能產(chǎn)生部分保護(hù)率，免疫后14 d的保護(hù)率超過(guò)80%，免疫期長(zhǎng)達(dá)60 d，適合血清2型和11型流行地區(qū)的鴨和鵝使用。

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EFFICACY OF THE BIVALENT INACTIVATED RIEMERELLA ANATIPESTIFER VACCINE CONTAINING SEROTYPES 2 AND 11

CHENG Long-fei1, LIN Qun-qun1, XU Li-na2, SHI Shao-hua1, CHEN Cui-teng1, QIU Wei-hong2, WAN Chun-he1, CHEN Hong-mei1, PENG Chun-xiang1, YE He-jia2, HUANG Yu1
(1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China; 2. Guangzhou South China Biological Medicine Co. Ltd., Guangzhou 511300, China)

The purpose of the present study was to develop an inactivated bivalent Riemerella anatipestifer vaccine containing serotypes 2 and 11. Riemerella anatipestifer strains RA1325 (serotype 2) and RA1229 (serotype 11) were cultured, inactivated and concentrated separately and mixed before formulation of a bivalent vaccine. To determine the immunogenicity of the vaccine, seven-day-old Muscovy ducks were subcutaneously vaccinated and then challenged with the live vaccine strains at days 7, 14, 21, 56, 63, 70 and 77 post challenge. Antibodies in serum samples were determined in ELISA every 7 days post vaccination. The results showed that the protection rate was over 80% at day 14 post challenge. The immunity duration of the vaccine was 60 days. The titers of antibodies during 14 to 63 days post vaccination were at a high level. The preliminary results indicated that this bivalent vaccine might be used to prevent serotypes 2 and 11 Riemerella anatipestifer infection in ducks.

Riemerella anatipestifer; serotype 2; serotype 11; bivalent inactivated vaccine; protection index

S852.612

A

1674-6422（2016）05-0025-04

2016-02-17

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-43）；福建省屬公益類項(xiàng)目（2015R1023-2）

程龍飛，男，碩士，研究員，主要從事動(dòng)物疫病研究

黃瑜，E-mail:huangyu_815@163．com