劉麗娜，鐘乃鳳，王 赟，張 潔，周 靜

（貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院，貴陽 550025）

·簡報·

2-型豬鏈球菌保護性抗原ESA的細(xì)胞定位及B細(xì)胞表位預(yù)測

通過生物信息學(xué)方法預(yù)測2-型豬鏈球菌（Streptococcus suis serotype 2，SS2）保護性抗原ESA（epidermal surface antigen, ESA）在SS2中的分布和B細(xì)胞表位，為研究SS2的多表位疫苗奠定基礎(chǔ)。以ESA推定的氨基酸序列為基礎(chǔ)，通過生物信息學(xué)軟件對ESA進行信號肽、跨膜序列等分析，然后分別以Kyte-Doolittle法、Emini法和Jameson-Wolf法分析蛋白的親水性、表面可能性以及抗原指數(shù)；輔以Garnier-Robson法、Chou-Fasman法和Karplus-Schulz法分析蛋白二級結(jié)構(gòu)中柔性區(qū)域，進而預(yù)測ESA的B細(xì)胞表位。結(jié)果表明，ESA為跨膜蛋白，B細(xì)胞表位位于N-端第30～35、59～64、178～185、245～253區(qū)域。多參數(shù)或多個軟件聯(lián)合使用能預(yù)測SS2保護性抗原ESA的B細(xì)胞表位和細(xì)胞定位，為實驗研究提供幫助，大大縮減實驗時間。

2-型豬鏈球菌；ESA；細(xì)胞定位；B細(xì)胞表位

劉麗娜，鐘乃鳳，王 赟，張 潔，周 靜

（貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院，貴陽 550025）

多表位疫苗（multi-epitope vaccine）是近年發(fā)展起來的一種新型分子疫苗[1]，是指同時攜帶多個目標(biāo)抗原相關(guān)以及輔助性的表位的疫苗，也稱雞尾酒式疫苗。它采用的是一種獨特的疫苗設(shè)計思路，其中只含有抗原中能有效刺激免疫應(yīng)答的表位，無關(guān)部分均被去除。相比傳統(tǒng)疫苗，多表位疫苗更安全、無毒、穩(wěn)定，可以直接刺激機體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。在疫苗設(shè)計時，從多個抗原分子的特異性保守氨基酸區(qū)域選擇多個B細(xì)胞表位，構(gòu)建多表位疫苗可以誘導(dǎo)更廣泛且有效的免疫應(yīng)答，以提供不同分離株之間的交叉免疫保護[2,3]。發(fā)展多表位疫苗有利于提供更完全更有針對性的免疫保護。另外，對抗原表位的研究，將深層次地揭示蛋白抗原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的分子機制。在前期研究工作中，證實免疫小鼠2型豬鏈球菌（Streptococcus suis serotype 2，SS2）的表皮表面抗原（epidermal surface antigen, ESA）[4-8]能產(chǎn)生高效價抗血清，免疫小鼠能抵抗高致病力菌株的致死性攻擊，是SS2新的保護性抗原[9]。

篩選表位的方法主要包括酶解法、化學(xué)法、串聯(lián)重復(fù)多肽合成法、噬菌體展示肽庫技術(shù)、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)預(yù)測法和MHC單鏈分子結(jié)合法等[10]。其中，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測法具有快速、直觀等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于表位疫苗研究[11,12]。本文對2型豬鏈球菌的新保護性抗原SS2的親性、表面可能性、抗原些粒等蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)及親性區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測分析。

1　材料與方法

1.1 ESA的氨基酸序列 SS2全基因組序列測定和推定氨基酸序列參見文獻[13]，ESA含有489個氨基酸殘基。

1.2 ESA在SS2中的細(xì)胞定位預(yù)測 利用跨膜螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件TMHMM Server 2．0、信號肽預(yù)測軟件SignalP 4．1 Server和非經(jīng)典分泌蛋白預(yù)測軟件SecretomeP對ESA的氨基酸序列進行分析。

1.3 ESA的二級結(jié)構(gòu)柔性區(qū)域預(yù)測 用Garnier-Robson法[17]、Chou-Fasman法[18]和Karplus-Schulz法[19]預(yù)測ESA二級結(jié)構(gòu)中的柔性區(qū)域。

1.4 ESA的B細(xì)胞表位預(yù)測 分別用Kyte-Doolittle法[14]、Emini法[15]和Jameson-Wolf法[16]分析蛋白的親水性、表面可能性以及抗原性指數(shù)。綜合以上各方法的預(yù)測結(jié)果，推測ESA的B細(xì)胞抗原表位。

2　結(jié)果與討論

2.1 ESA的細(xì)胞定位預(yù)測 利用SignalP 4．1 Server分析ESA的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其N端不存在信號肽序列（圖1）；使用SecretomeP對ESA的氨基酸序列進行分析，其SecP分值為0．100835（＜0．5），ESA為非分泌蛋白；利用TMHMM Server 2．0分析ESA的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)ESA為跨膜蛋白，其氨基酸在1～6區(qū)域為胞內(nèi)序列，7～29區(qū)域為跨膜序列，30～489區(qū)域為胞外序列（圖2）。

圖1　ESA信號肽預(yù)測Fig. 1 Signal peptide prediction of ESA

圖2　ESA跨膜區(qū)域預(yù)測Fig. 2 Transmembrane region prediction of ESA

2.2 ESA蛋白預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)柔性區(qū)域 Garnier-Robson法、Chou-Fasman法和Karplus-Schulz法預(yù)測的結(jié)果見圖3、圖4和圖5。綜合分析圖3、圖4和圖5，同時被三種方法預(yù)測為柔性結(jié)構(gòu)的區(qū)域位于ESA蛋白N-端的第32～33、44～46、50-54、62～64、180～182、250～251。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的表位分布有較大關(guān)系。蛋白抗原構(gòu)象不是剛性不變的，其多肽骨架有一定程度的活動性；轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲區(qū)域的結(jié)構(gòu)比較松散，易于發(fā)生扭曲、盤旋，并展示在蛋白分子表面，成為抗原表位的可能性較大。

圖3　Garnier-Robson法預(yù)測的ESA蛋白的二級結(jié)構(gòu)柔性區(qū)域Fig. 3 Flexible regions of ESA predicted by the Garnier-Robson’s method

圖4　Chou-Fasman法預(yù)測的ESA蛋白的二級結(jié)構(gòu)柔性區(qū)域Fig. 4 Flexible regions of ESA predicted by the Chou-Fasman’s method

圖5　Karplus-Schulz法預(yù)測的ESA蛋白的柔性區(qū)域Fig. 5 Flexible regions of ESA predicted by the Karplus-Schulz’s method

2.3 ESA蛋白的B細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果 蛋白抗原各氨基酸殘基可分為親水殘基和疏水殘基兩類。在機體內(nèi)，疏水性殘基一般埋在蛋白內(nèi)部，而親水性殘基位于表面，因此蛋白的親水部位與蛋白的抗原位點有著密切的聯(lián)系。表面可能性較高區(qū)域, 位于蛋白分子表面；表面可能性較低區(qū)域，即埋藏于蛋白分子內(nèi)部區(qū)域?？乖苑桨刚J(rèn)為疏水性氨基酸殘基也經(jīng)常出現(xiàn)在表位中, 疏水性殘基和親水性殘基在蛋白抗原位點中的相對出現(xiàn)率對抗原表位的定位預(yù)測有一定意義[20]。采用Kyte-Doolittle法分析ESA的親水性，Emini法預(yù)測ESA的表面可能性，以及Jameson-Wolf法預(yù)測ESA的抗原性指數(shù)，結(jié)果見圖6～8。經(jīng)親水性指數(shù)、表面可能性指數(shù)和抗原性指數(shù)篩選出的氨基酸區(qū)段中（親水性指數(shù)≥0，表面可能性指數(shù)≥1，抗原性指數(shù)≥0），如果其內(nèi)部或附近又有柔性結(jié)構(gòu)，則很有可能為B細(xì)胞表位所在區(qū)域。綜合各種預(yù)測結(jié)果，ESA蛋白N-端第30～35、59～64、178～185、245～253區(qū)段很有可能存在B細(xì)胞表位。

圖6　ESA蛋白的親水性分析Fig. 6 Hydrophilicity plot for ESA

圖7　ESA蛋白的表面可能性區(qū)域Fig. 7 Surface probability plot for ESA

圖8　ESA蛋白的抗原性指數(shù)Fig. 8 Antigenicity index for ESA

因此，本研究將蛋白親水性、表面可能性以及抗原指數(shù)的預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)中柔性區(qū)域的分析相結(jié)合，綜合判定ESA的B細(xì)胞表位所在區(qū)段。新的保護性抗原ESA B細(xì)胞表位的預(yù)測將為SS2多表位疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

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PREDICTION OF CELLULAR LOCALIZATION AND B CELL EPITOPES OF PROTECTIVE ANTIGEN ESA OF STREPTOCOCCUS SUIS SEROTYPE 2

LIU Li-na, ZHONG Nai-feng, WANG Yun, ZHANG Jie, ZHOU Jing
(School of Biology&Engineering, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, China)

The cellular location and B cell epitopes of the protective antigen ESA (epidermal surface antigen, ESA) of Streptococcus suis serotype 2 (S. suis 2) were predicted for the development of a multi-epitope vaccine using bioinformatics. Putative amino sequence of ESA was analyzed using bioinformatics software containing signal peptide and transmembrane region prediction. The secondary structural fl exible regions of ESA were analyzed by using the Garnier-Robson's method, Chou-Fasman's method and Karplus-Schulz's method based on its putative amino sequence. The hydrophilicity plot, surface probability plot and antigenicity index were obtained by using the methods of Kyte-Doolittle, Emini and Jameson-Wolf, respectively. Combined with these results, ESA was predicted as a transmembrane protein and amino acids 30～35, 59～64, 178～185, 245～253 at the N-terminus might represent possible B cell epitopes for ESA. In conclusion, the cellular localization and B cell epitopes of ESA were predicted based on multiple parameters and softwares, which would benefi t design and future research of a multi-epitope vaccine.

Streptococcus suis serotype 2; epidermal surface antigen; localization; B cell epitope

S852.611

B

1674-6422（2016）05-0069-05

2016-04-26

貴州省科技合作計劃（黔科合LH字[2015]7318）

劉麗娜，女，博士，主要從事微生物學(xué)方面研究

劉麗娜，E-mail：strawberry2@126．com