蘇存生，賀建龍，熊鵬，岳春，于鳳川，孫付保*

1(江南大學 生物工程學院，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫, 214122) 2(淮陰師范學院 化學化工學院, 江蘇省生物質能與酶技術重點實驗室，江蘇 淮安, 223005) 3(南陽理工學院 生物與化學工程學院，河南 南陽, 473004)

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里氏木霉Rut-C30發(fā)酵熱水預處理稻草產纖維素酶

蘇存生1，賀建龍2，熊鵬2，岳春3，于鳳川1，孫付保1*

1(江南大學 生物工程學院，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫, 214122) 2(淮陰師范學院 化學化工學院, 江蘇省生物質能與酶技術重點實驗室，江蘇 淮安, 223005) 3(南陽理工學院 生物與化學工程學院，河南 南陽, 473004)

為提高工業(yè)生產菌TrichodermareeseiRut-C30產酶能力，以熱水預處理稻草(hot water pretreated rice straw, HWPRS)為碳源，開展系統(tǒng)優(yōu)化培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件以及采用添加劑等方面的實驗工作。菌株初始搖瓶發(fā)酵HWPR 產纖維素酶在168 h時濾紙酶活(FPA)為1.20 U/mL。通過單因素實驗與正交實驗，獲得最佳培養(yǎng)基(g/L)：HWPRS 50.0、玉米漿6.0、(NH4)2SO44.0、KH2PO41.0、尿素0.2、MgSO4·7H2O 0.4、CaCl20.3；最佳培養(yǎng)條件：pH6.0、轉速220 r/min、溫度30 ℃、接種量φ6%；優(yōu)化后菌株產酶FPA達2.69 U/mL，是優(yōu)化前2倍以上。添加吐溫-80能顯著提高產酶，β-葡萄糖苷酶活(BG)提高26%；添加乳糖主要能提高BG酶活；實驗中首次發(fā)現(xiàn)殼聚糖類物質能促進纖維素酶發(fā)酵，其中殼聚糖效果最明顯，添加1.5 g/L殼聚糖時纖維素酶FPA與BG分別提高了10%和30%，使纖維素酶FPA、CMCase和BG分別達到3.67、8.65和1.76 U/mL。該產酶穩(wěn)定性為上罐實驗證實，所產纖維素酶FPA水平是初始搖瓶發(fā)酵的3倍，初步顯示了其工業(yè)發(fā)酵潛力。

熱水預處理稻草；里氏木霉Rut-C30；纖維素酶；發(fā)酵優(yōu)化；殼聚糖

在木質纖維素生產燃料乙醇過程中，纖維素酶將纖維質原料水解為可發(fā)酵性糖，為后續(xù)微生物生產燃料乙醇提供基質，纖維素酶酶解是纖維素乙醇商業(yè)化的關鍵步驟[1-2]。據報道，纖維素酶成本占纖維素乙醇成本的20%～40%，目前纖維素酶成本高和用量大是纖維素乙醇生產成本居高不下的重要原因[1, 3]?？梢?，如何經濟高效地生產纖維素酶是當前纖維素乙醇行業(yè)值得關注的課題。

在發(fā)酵基質方面，傳統(tǒng)上使用純纖維素及其衍生物，如結晶纖維素、羧甲基纖維素鈉和紙漿等，表明了纖維基質發(fā)酵產纖維素酶可行性[4-5]。為降低生產成本，近年來逐步出現(xiàn)了利用天然纖維質原料替代高成本的工業(yè)產物發(fā)酵產纖維素酶的報道，例如利用甘蔗渣、橡木和農作物秸稈等替代純的纖維素進行發(fā)酵產酶[6-7]。2013年，CULBERTSON等[2]用20 g/L的氨氣爆破預處理的玉米秸稈進行搖瓶發(fā)酵產纖維素酶，酶活在144 h達到1.90 U/mL；2015年，馬立娟等[8]用10 g/L的玉米芯進行搖瓶發(fā)酵產酶，酶活在120 h達到1.53 U/mL。這些工作展示了利用天然纖維質廢棄物發(fā)酵產纖維素酶具有切實可行性與潛在經濟性。

然而，目前利用天然纖維質原料發(fā)酵產酶水平并不高，F(xiàn)PA大多在1.0 U/mL左右。于是，陸續(xù)有研究者開展了纖維素酶發(fā)酵工藝優(yōu)化方面的工作。2005年，JUHASZ等[7]以40 g/L酸預處理橡木為底物采用分批補料方式對纖維素酶發(fā)酵條件進行優(yōu)化，酶活在168 h達到3.20 U/mL，比之前提高近1倍；鐘桂芳等[9]以18 g/L麩皮為碳源進行響應面優(yōu)化發(fā)酵條件，酶活達到3.12 U/mL，比優(yōu)化前提高72%。此外，CHANDRA等[10]發(fā)酵時添加氨基丁酸與茉莉酸，酶活達到3.21 U/mL，比之前提高3倍；劉佳等[11]在固態(tài)發(fā)酵時添加鼠李糖與吐溫-80使酶活提高50%。這些工作顯示，利用實驗設計優(yōu)化和采用合適添加劑等策略進行纖維素酶發(fā)酵工藝優(yōu)化，是提高纖維素酶發(fā)酵水平的有效途徑。

基于此，本文以HWPRS為碳源，嘗試采用試驗設計系統(tǒng)優(yōu)化和添加劑等手段提高工業(yè)化菌株T.reeseiRut-C30發(fā)酵產酶水平，為現(xiàn)行纖維素酶發(fā)酵工業(yè)提供技術支撐。實驗首先考察了該工業(yè)菌株的現(xiàn)行發(fā)酵水平，接著依次采用單因素與正交實驗對纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件進行系統(tǒng)優(yōu)化，在此基礎上開展了吐溫-80、乳糖與殼聚糖等添加劑探索，最后在5 L發(fā)酵罐上進行了發(fā)酵驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種與試劑

里氏木霉T.reeseiRut-C30由淮安百麥綠色能源公司饋贈。熱水預處理稻草(hot water pretreated rice straw, HWPRS)是粉碎至粒徑小于5 mm的稻草在180 ℃高壓熱水中處理10 min，由淮安百麥綠色能源公司提供。Whatman No.1濾紙購于英國Whatman公司；吐溫-80、乳糖、殼聚糖等試劑均購自于上海國藥集團，玉米漿為市場購買。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：土豆200，葡萄糖20，pH自然。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：HWPRS 20.0，玉米漿2.0，(NH4)2SO41.4，KH2PO42.0，尿素0.3，MgSO4·7H2O 0.3，CaCl20.3，pH5.0；Mandels營養(yǎng)鹽微量元素(mg/L)：FeSO4·7H2O 5.0，MnSO4·H2O 1.6，ZnSO4·7H2O 1.4，CoC12·6H2O 3.7，過濾除菌后加入培養(yǎng)基。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

取1.0 mL含量為1.0×108/mL里氏木霉Rut-C30孢子懸液接種到種子培養(yǎng)基中，于30 ℃和180 r/min旋轉式搖床培養(yǎng)24 h，獲得種子菌液。

1.2.2 纖維素酶發(fā)酵的初步探討

發(fā)酵時取上述種子液按體積百分比 6%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基上，于30 ℃和180 r/min旋轉式搖床培養(yǎng)168 h，定期取樣測定酶活。

1.2.3 單因素實驗

對發(fā)酵培養(yǎng)基(HWPRS、玉米漿、(NH4)2SO4、KH2PO4、尿素、MgSO4·7H2O、CaCl2)和上述培養(yǎng)條件(初始pH、轉速、溫度、接種量)進行單因素實驗，考察某一個因素時保持其他條件不變，找出對纖維素酶影響最為明顯的因素。

1.2.4 正交實驗

根據上面單因素實驗確定的因素水平，設計正交實驗。對發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件分別設計L18(37)和L9(34)兩個正交表，如表1和表2所示。

表1 L18(37)發(fā)酵培養(yǎng)基正交實驗因素水平表

表2 L9(34)發(fā)酵培養(yǎng)條件正交實驗因素水平表

1.2.5 添加劑考察

在正交優(yōu)化基礎上，進行吐溫-80添加時間 (24、48、72、96、120 h) 與添加量 (0、1.0、2.0、4.0、6.0 g/L) 優(yōu)化；在其基礎上對乳糖添加量 (0、0.25、0.5、1.0、1.5 g/L) 進行優(yōu)化；最后優(yōu)化殼聚糖添加量 (0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L)，促進里氏木霉Rut-C30產酶，提高酶活。

1.2.6 上罐放大

按照上述優(yōu)化好的條件進行5 L發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)：溫度30 ℃，通氣量1.5 v/v/min，攪拌轉速220 r/min，pH≥4.5，溶氧在前48 h控制在80%左右，48 h后控制在40%左右。每隔24 h取樣，測定酶活。

1.3 分析測定方法

1.3.1 酶活測定

發(fā)酵液取樣后于4 ℃、8 000 r/min離心10 min獲得上清液，經適當稀釋以測定纖維素酶活性。測定時取稀釋酶液0.5 mL與1.0 mL的50 mmol/L檸檬酸緩沖液(pH4.8)混合，加入50 mg (1 cm × 6 cm) Whatman No.1濾紙條后于50 ℃靜置反應1 h，加入1.0 mL DNS溶液后于沸水浴5 min。冷卻至室溫后稀釋10倍測定OD540值，并根據相關公式換算成酶活[12]。CMCase與BG則分別以1%的CMC和水楊苷為底物，反應時間30 min，其他條件不變。酶活定義：水解底物時每分鐘產生1 μmol葡萄糖所需酶量定義為1個酶活單位(U)。

1.3.2 蛋白測定

參考Bradford法測定蛋白含量[13]。實驗時吸取適當稀釋發(fā)酵液0.5 mL于5 mL離心管中，再加入2.50 mL考馬斯亮藍溶液，通過渦流混勻后測定OD595值，根據蛋白標曲換算成蛋白含量。

2 結果與討論

2.1 纖維素酶發(fā)酵的初步探討

本實驗以合作單位淮安百麥綠色能源生物有限公司的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行初步的搖瓶發(fā)酵，結果如圖1所示。隨著發(fā)酵進行，菌株產酶逐步提高，144 h時纖維素酶FPA、CMCase和BG酶活均達到最高水平，分別為1.20、6.70和0.81 U/mL。該實驗結果與公司數(shù)據(內部交流)相一致，代表著現(xiàn)有纖維素酶發(fā)酵工業(yè)水平。已有文獻顯示，里氏木霉在酸處理橡木、汽爆橡木和玉米芯等天然纖維素質原料上發(fā)酵產酶FPA可達3～5 U/mL[7-9]，顯示出該菌具有較大的發(fā)酵潛力。因此，后續(xù)實驗中嘗試從培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等方面對該菌株發(fā)酵HWPRS產酶過程進行系統(tǒng)優(yōu)化以提高其產酶水平。另外，考慮到公司實際生產中采用較昂貴的添加劑進行產酶誘導，所以本文也將探討一些廉價添加劑的使用以降低纖維素酶生產成本。

圖1 HWPRS發(fā)酵纖維素酶初步探索Fig.1 Preliminary cellulase fermentation of HWPRS

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 單因素優(yōu)化

實驗對發(fā)酵培養(yǎng)基碳源(HWPRS)、氮源[(NH4)2SO4、玉米漿、尿素]和無機鹽(KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2)等進行單因素實驗，結果如圖2所示。

當培養(yǎng)基中碳源濃度較低時，發(fā)酵所產纖維素酶活隨著基質HWPRS添加明顯提高，在HWPRS濃度為40.0 g/L時酶活最高，達到1.38 U/mL，此后進一步添加基質酶活反而下降，可能是基質過高會導致整個發(fā)酵體系的傳質傳氧降低，進而影響產酶，也可能是高濃度基質吸附過多纖維素酶導致發(fā)酵液中游離酶濃度降低[14-15]。因此，選擇40.0 g/L作為適宜的發(fā)酵基質濃度。玉米漿作為一種常見易得的氮源，不僅含有豐富的氮元素，又能為微生物生長提供多種必需的生長因子，為合成各種酶提供前體[16]。實驗中纖維素酶活隨玉米漿濃度增大不斷上升，當玉米漿加量為4.0 g/L時酶活達到最高值1.48 U/mL，因此確定玉米漿濃度為4.0 g/L。當(NH4)2SO4濃度達到3.0 g/L時纖維素酶發(fā)酵酶活達到最高值1.37 U/mL，因而選擇(NH4)2SO4添加量為3.0 g/L，這與文獻報道是一致的[15]。同樣地，實驗中確定尿素添加量為0.3 g/L、KH2PO4為2.0 g/L、MgSO4·7H2O為0.3 g/L和CaCl2為0.3 g/L。

圖2 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素實驗Fig.2 Single factor experiment of selecting the fermentation medium

2.2.2 培養(yǎng)基正交實驗

上述單因素實驗確定出培養(yǎng)基中各成分含量，本實驗通過設計正交實驗考察這些因素對發(fā)酵產酶的影響，結果如表3所示。

對正交實驗使用“正交設計助手II v3.1”進行7因素3水平實驗設計，并對所得實驗結果進行分析。由表3可知，培養(yǎng)基中各成分對纖維素酶產量影響各不相同。由極差分析可知，各個因素對纖維素酶分泌的影響順序按照極差大小排序依次是：玉米漿 >HWPRS > (NH4)2SO4>尿素 > KH2PO4>MgSO4·7H2O > CaCl2。

根據表4方差分析，培養(yǎng)基中所有成分對纖維素酶影響順序依次為：玉米漿 > HWPRS > (NH4)2SO4>尿素 > KH2PO4> MgSO4·7H2O > CaCl2，這與上面極差分析是一致的。確定出最佳組合為A3B3C3D1E1F3G2，即產酶最適發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：HWPRS 50.0，玉米漿6.0，(NH4)2SO44.0；KH2PO41.0；尿素0.2；MgSO4·7H2O 0.4；CaCl20.3。按照最佳組合進行驗證，F(xiàn)PA最高產量達到2.40 U/mL，實驗結果處于正交實驗中較高水平，結果可信，較優(yōu)化前提高了1倍；CMCase與BG分別達到7.12 U/mL與0.87 U/mL，與優(yōu)化前相比略有提高。

表3 L18(37)正交實驗及結果

表4 正交實驗分析結果

2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化

培養(yǎng)條件對微生物發(fā)酵具有重要意義，在微生物發(fā)酵過程中，合適的培養(yǎng)條件不僅能夠穩(wěn)定菌體的生長，還能夠促進產酶[5, 17]。在上述最適培養(yǎng)基基礎之上，考察初始pH、轉速、溫度與接種量等主要培養(yǎng)條件對發(fā)酵產酶的影響。

2.3.1 培養(yǎng)條件單因素實驗

發(fā)酵初始pH、轉速、溫度與接種量等參數(shù)的單因素實驗如圖3所示。當培養(yǎng)基初始pH較低時，纖維素酶發(fā)酵酶活隨著pH增加而明顯上升，在pH5.5時酶活達到最高為2.51 U/mL，因此確定最適發(fā)酵初始pH5.5。在轉速方面，纖維素酶發(fā)酵隨著轉速增加，傳質傳氧加快，從而提高了產酶水平；當轉速過大時，搖瓶轉動產生剪切力也會對菌絲體造成損害，進而影響產酶[18]。當轉速為220 r/min時酶活最高達到2.56 U/mL，所以確定220 r/min為最佳轉速。在培養(yǎng)溫度28～32 ℃時里氏木霉發(fā)酵所產酶活變化不大，但溫度升高到34 ℃時酶活迅速降低，確定適宜培養(yǎng)溫度為30 ℃。同樣地，實驗中確定最適接種量φ為8%。

圖3 發(fā)酵條件單因素實驗Fig.3 Single factor experiment of fermentation condition

2.3.2 培養(yǎng)條件正交實驗

基于上述的單因素實驗結果，對培養(yǎng)條件進行4因素3水平正交實驗設計如表5和表6所示。

表5 L9(34)正交實驗及結果

表6 正交實驗分析結果

經過極差和方差分析，確定各個條件對酶活影響大小順序依次為：接種量>pH>溫度>轉速 ，最佳組合為A3B2C2D1，即：pH6.0、轉速220 r/min、溫度30 ℃、接種量φ6%。進一步實驗驗證獲得該酶發(fā)酵酶活為2.69 U/mL，比培養(yǎng)條件優(yōu)化前提高了12.1%；CMCase與BG達到7.32 U/mL與0.91 U/mL，與優(yōu)化前相差別不大。

2.4 添加劑對纖維素酶的促進作用

2.4.1 添加吐溫-80

一些資料顯示，表面活性劑吐溫-80能改變細胞結構，增大細胞膜通透性，進而促進內容物外流，使得胞外蛋白分泌加速[11]。本實驗考察吐溫-80添加時間與添加量對纖維素酶發(fā)酵酶活的影響，結果如圖4。由圖4A可知，在發(fā)酵前48 h添加吐溫-80不利于發(fā)酵產酶，從發(fā)酵72 h開始時添加對纖維素酶酶活提高有積極作用，在96 h添加時酶活達到最高水平3.12 U/mL，添加時間再晚時酶活反而降低。因此，選擇吐溫-80添加時間為發(fā)酵96 h。在96 h添加不同量吐溫-80考察添加量對產酶影響，如圖4B所示。在添加量較低時酶活隨著吐溫-80添加而明顯提高，在添加4.0 g/L時酶活達到3.15 U/mL，添加量再高時酶活反而降低。因此確定在96 h添加吐溫-80，添加量為4.0 g/L；此時纖維素酶FPA、CMCase和BG分別達到3.15、8.28和1.22 U/mL，比對照組分別提高了13%、13%和26%。

圖4 添加吐溫-80對HWPRS發(fā)酵產纖維素酶的影響Fig.4 Effect of the Tween-80 on the cellulase production from HWPRS

2.4.2 添加乳糖誘導產酶

文獻報道顯示，添加乳糖對纖維素酶發(fā)酵具有誘導作用。在上述實驗基礎上，考察乳糖添加對發(fā)酵誘導產酶的影響[19]。由圖1可知，在發(fā)酵48 h內主要是菌體生長，產酶能力較弱，若此時添加乳糖會被消耗用于生長。因此，本實驗選擇在發(fā)酵中期(48、72和96 h)添加不同濃度乳糖(0.25、0.5、1.0、1.5 g/L)，考察乳糖對發(fā)酵產酶影響。由圖5看出，少量乳糖對纖維素酶發(fā)酵產酶具有促進作用，但濃度過高也不利于纖維素酶合成，反而抑制酶的表達。主要原因可能是少量乳糖進入細胞內部后誘導酶表達，但乳糖濃度過高時乳糖分解產生單糖抑制了纖維素酶表達[19]。在乳糖添加量0.5 g/L時纖維素酶3種酶活均達到最高水平，F(xiàn)PA、CMCase和BG分別為3.29、8.40和1.36 U/mL。與添加前相比，乳糖添加對BG酶活提高最為明顯，提高了13%以上。確定乳糖最佳添加量為0.5 g/L。

圖5 乳糖添加對HWPRS發(fā)酵產纖維素酶的影響Fig.5 Effect of the lactose addition on cellulase production from HWPRS

2.4.3 添加殼聚糖

殼聚糖是幾丁質脫乙酰基后的產物，是自然界中含量僅次于纖維素的天然糖鏈資源，有文獻報道里氏木霉能夠降解殼聚糖產生殼寡糖[20]。陸大年等[21]發(fā)現(xiàn)在纖維素酶解過程中添加殼聚糖能促進酶解。然而，殼聚糖能否對纖維素酶發(fā)酵生產有作用，尚未見諸報道。

選取殼聚糖、幾丁質、羧甲基殼聚糖、殼寡糖等幾種結構相近的物質，考察它們對纖維素酶發(fā)酵影響。由圖6可知，發(fā)酵時添加殼聚糖能明顯提高產酶水平，羧甲基殼聚糖對產酶作用不明顯，而幾丁質和殼寡糖對產酶有一定抑制作用。因此確定殼聚糖為添加物質。實驗接著探討殼聚糖的最適添加時間與添加量，如圖7所示。在發(fā)酵前48 h添加殼聚糖對產酶無益，甚至有明顯抑制作用，在發(fā)酵48 h后添加時殼聚糖對發(fā)酵產酶有明顯促進作用，在96 h添加時酶活最高達到3.41 U/mL。進一步考察殼聚糖添加量發(fā)現(xiàn)，當加量較少時3種酶活均隨著殼聚糖添加而不斷提高，當殼聚糖添加量為1.50 g/L時酶活達到最高水平，此時FPA、CMCase和BG分別為3.67、8.65和1.76 U/mL，與未添加相比分別提高11%、3%和29%。從結果看出，殼聚糖對纖維素酶BG酶活的促進作用尤為明顯。分析原因可能是，殼聚糖在菌體生長早期添加會影響菌體生長與產酶，在菌體進入穩(wěn)定期大量產酶階段添加，殼聚糖被快速降解成小分子二(三)糖產物，進入細胞內部后進一步強化纖維素酶誘導表達；此外，殼聚糖還能夠特異性地結合在細胞表面增強細胞膜的通透性，促進酶的分泌[22]。因此確定殼聚糖最適添加時間與添加量為：發(fā)酵96 h添加1.50 g/L殼聚糖。

圖6 不同添加劑對纖維素酶影響Fig. 6 Effect of different additives on cellulase

圖7 殼聚糖對HWPRS發(fā)酵產纖維素酶促進作用Fig.7 Active role of chitosan addition on the cellulase production from HWPRS

2.5 上罐放大實驗

在上述搖瓶發(fā)酵基礎上，進行5 L發(fā)酵罐上產酶實驗。發(fā)酵溫度控制在30 ℃，pH、溶氧控制與發(fā)酵酶活情況如圖8所示。由圖8A看出，在發(fā)酵前48 h，發(fā)酵液pH迅速下降，通過補加氨水控制pH不低于4.5，此時發(fā)酵主要處于菌體旺盛生長階段，其中在發(fā)酵24 h時恒速流加乳糖；發(fā)酵48 h后菌體進入穩(wěn)定期，pH開始回升，溶氧48 h以前控制在80%左右，48 h后在40%左右以使菌體更好產酶[23]，其中在發(fā)酵96 h添加吐溫-80與殼聚糖。由圖8B顯示，在發(fā)酵前48 h由于發(fā)酵處于菌體生長期，所以酶蛋白分泌較少，產酶量較低；菌體在發(fā)酵48 h后開始大量向外分泌蛋白，相應的纖維素酶酶活FPA和CMCase迅速上升，BG酶活也不斷增加。96 h之后，pH趨于穩(wěn)定，菌體產酶能力有所下降，酶活積累速度下降，在144 h時酶活達到最高值。FPA、CMCase、BG3種酶活分別達到3.50、8.94和1.74 U/mL。與搖瓶發(fā)酵結果相比，上罐發(fā)酵初步探索的酶活與搖瓶數(shù)據相近，但并沒有較大程度提高。認為主要原因是搖瓶參數(shù)跟上罐參數(shù)之間并不完全一致，尤其是在溶氧控制和pH控制上，有待進一步優(yōu)化。因此后續(xù)將通過控制溶氧和pH以及觀察菌體形態(tài)相結合等策略，進一步提高產酶。

本實驗纖維素酶發(fā)酵水平與已有報道的比較結果如表7所示。目前的纖維素酶發(fā)酵碳源非常廣泛，眾多研究已從早期的纖維素及其衍生物轉向更具工業(yè)意義的天然木質纖維素原料，如玉米秸、橡木、玉米芯等，這些基質濃度通常在4%～6%。相對于纖維素及其衍生物發(fā)酵(>10 FPU/mL)，天然木質纖維素基質發(fā)酵產酶仍較低，不足5.0 FPU/mL。本文報道的HWPRS發(fā)酵產酶FPA為3～4 U/mL，處于較高水平。與其它天然纖維質原料相比，本發(fā)酵所產纖維素酶比酶活明顯高于同行報道，比如FPA達4～5 U/mg蛋白；另外，CMCase接近9.0 U/mL，也處于較高水平。由此可見，HWPRS發(fā)酵產纖維素酶具有巨大的工業(yè)應用潛力。

A-發(fā)酵參數(shù)控制；B-發(fā)酵產酶曲線圖8 纖維素酶5 L發(fā)酵罐發(fā)酵參數(shù)Fig.8 Cellulases fermentation in a 5 L stirred tank reactor

木質纖維素底物含量/(g·L-1)規(guī)模纖維素酶/(U·mL-1)FPACMCaseBG蛋白含量/(mg·mL-1)文獻工業(yè)纖維素36搖瓶9.13-0.922.57[4]微晶纖維素42搖瓶15.883-2.32[5]AFEX-玉米秸桿6030L罐1.91.61.71.32[2]橡木30搖瓶3.21.720.86-[7]燕麥殼水解液40搖瓶2.81.73.2-[25]蒸汽爆炸橡木20搖瓶4.4--1.14[24]玉米芯10搖瓶1.53-0.612.11[8]木糖渣4030L罐5.25--1.85[26]堿化秸桿70搖瓶0.770.941.320.85[24]HWPRS50搖瓶3.678.651.760.69本研究HWPRS505L罐3.58.941.740.81本研究

3 結論

本文通過單因素實驗與正交實驗對里氏木霉發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件進行優(yōu)化，顯著提高了纖維素酶活水平，纖維素酶FPA達到2.69 U/mL，是優(yōu)化前2.2倍。吐溫-80和乳糖等添加劑也能促進發(fā)酵產酶。本文首次發(fā)現(xiàn)殼聚糖類物質能促進纖維素酶發(fā)酵產酶，使纖維素酶FPA、CMCase和BG分別提高了11%、3%和29%，分別達到3.67、8.65、1.76 U/mL，其發(fā)酵穩(wěn)定性好。結合表7，HWPRS發(fā)酵所產纖維素酶FPA比酶活較高，可達4～5 U/mg蛋白，其CMCase接近9.0 U/mL，也處于較高水平。確定HWPRS發(fā)酵產纖維素酶具有巨大的工業(yè)應用潛力。

[1] DOS REIS L,FONTANA R C, DELABONA PDA S, et al. Increased production of cellulases and xylanases byPenicilliumechinulatumS1M29 in batch and fed-batch culture[J]. Bioresource Technology, 2013, 146: 597-603.

[2] CULBERTSON A,JIN Ming-jie, DA COSTA SOUSA L, et al. In-house cellulase production from AFEX pretreated corn stover usingTrichodermareeseiRut-C30[J]. RSC Advances, 2013, 3: 25960-25969.

[3] 方鎮(zhèn)宏, 鄧紅波, 張小希, 等. 木薯纖維素乙醇發(fā)酵的纖維素酶成本評價[J]. 生物工程學報, 2013, 29(3): 312-324.

[4] 張曉月, 孜力汗, 李勇昊, 等. 里氏木霉Rut-C30產纖維素酶培養(yǎng)基優(yōu)化及其酶解特性[J]. 過程工程學報, 2014, 14(2):312-318.

[5] YAN Zhong-li, CAO Xiao-hong, LIU Qing-dai, et al. A shortcut to the optimization of cellulase production using the mutantTrichodermareeseiYC-108[J]. Indian Journal of Microbiology, 2012, 52(4): 670-675.

[6] 呂雄, 趙晶, 夏黎明. 碳源對里氏木霉纖維素酶誘導合成的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2010, 36(3): 1-4.

[7] JUHASZ T,SZENGYEL Z, RECZEY K, et al. Characterization of cellulases and hemicellulases produced byTrichodermareeseion various carbon sources[J]. Process Technology, 2005, 40(11): 3 519-3 525.

[8] 馬立娟, 蔡瑞, 崔有志, 等. 玉米芯誘導里氏木霉 Rut-C30產纖維素酶的分析[J]. 天津科技大學學報, 2015(3):122-128.

[9] 鐘桂芳, 翟莉莉, 樊攀, 等. 里氏木霉產纖維素酶的條件優(yōu)化及酶學性質研究[J]. 食品與發(fā)酵科技, 2013, 49(4): 10-13.

[10] CHANDRA M,SANGWAN N S, KUMAR H, et al. DL-2 aminobutyric acid and calliterpinone are the potential stimulators ofTrichodermacellulase activities[J]. Biomass and Bioenergy, 2014, 62: 212-217.

[11] LIU Jia, YUAN Xing-zhong, ZENG Guang-ming, et al. Effect of biosurfactant on cellulase and xylanase production byTrichodermaviridein solid substrate fermentation[J]. Process Biochemistry, 2006, 41(11): 2 347-2 351.

[12] MILLER G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J]. Analytical Chemistry, 1959, 31(3): 426-428.

[13] BRADFORD M. A rapid method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72(1-2):248-254.

[14] 王錢錢, 詹懷宇, 孫建中, 等. 纖維素酶在木質纖維素底物上的吸附脫附以及循環(huán)利用[J]. 造紙科學與技術, 2014, 33(3): 9-14.

[15] DAOUD F B,KADDOUR S, SADOUN T. Adsorption of cellulaseAspergillusnigeron a commercial activated carbon: kinetics and equilibrium studies[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2010, 75(1): 93-99.

[16] 張傳志, 康振, 堵國成, 等.重組谷氨酸棒桿菌發(fā)酵L-苯丙氨酸培養(yǎng)基的優(yōu)化[J]. 微生物學通報, 2015, 42(1): 74-84.

[17] ROSYIDA V T,INDRIANINGSIH A W, MARYANA R, et al. Effect of temperature and fermentation time of crude cellulase production byTrichodermareeseion straw substrate[J]. Energy Procedia, 2015, 65: 368-371.

[18] 胡彩靜, 代淑梅, 李秋園. 里氏木霉(Trichodermareesei)產纖維素酶液態(tài)發(fā)酵條件的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2005, 31(9): 45-48.

[19] 王方忠, 蔣藝, 劉奎美, 等. 絲狀真菌中纖維素酶與半纖維素酶的合成調控[J]. 生物加工過程, 2014, 12(1): 72-79.

[20] 劉靖, 夏文水. 纖維素酶中雙功能酶水解殼聚糖作用方式研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2006, 32(5): 31-35.

[21] 陸大年，付康麗. 一種纖維素酶活化劑: 中國, CN 103695401 A[P]. 2014-04-02.

[22] 余雄偉, 王月慧. 不同分子量殼聚糖對細胞膜通透性的影響[J]. 食品工業(yè), 2011(6): 4-6.

[23] 余曉斌 具潤漠. 里氏木霉液體發(fā)酵法生產纖維素酶[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 1998, 24(1): 20-25.

[24] ZHANG L,WANG Xiao-qing, RUAN Zhen-hua, et al. Fungal cellulase/xylanase production and corresponding hydrolysis using pretreated corn stover as substrates[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2014, 172(2): 1 045-1 054.

[25] SUN Wei-cheng, CHENG Chung-hsien, LEE Wen-chien, et al. Protein expression and enzymatic activity of cellulases produced byTrichodermareeseiRut-C30 on rice straw[J]. Process Biochemistry, 2008, 43(10): 1 083-1 087.

[26] XIA Li-ming, SHEN Xue-liang. High-yield cellulase production byTrichodermareeseiZU-02 on corn cob residue[J]. Bioresource Technology, 2004, 91(3): 259-262.

Cellulase production from the hot water pretreated rice straw by Trichoderma reesei Rut-C30

SU Cun-sheng1, HE Jian-long2, XIONG Peng2, YUE Chun3, YU Feng-chuan1, SUN Fu-bao1*

1(Laboratory of Industrial Biotechnology of Department of Education, School of Bitechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(Jiangsu Key Laboratory for Biomass-Based Energy and Enzyme Technology, School of Chemistry and Chemical Engineering, Huaiyin Normal University, Huaian 223005，China) 3(Department of Biological and Chemical Engineering, Nanyang Institute of Technology, Nanyang 473004, China)

In order to enhance the cellulase production ability of industrial strainTrichodermareeseiRut-C30, this study with hot water pretreated rice straw (HWPRS) as carbon source focused on optimization of the fermentation nutrition and condition and the supplement with some additives. The FPA of cellulase produced at our laboratory level for 168 h were 1.20 U/mL. With single-factor and orthogonal experiments, the fermentation medium was optimized as below (g/L): HWPRS 50.0, corn steel liquid 6.0, (NH4)2SO44.0, KH2PO41.0, urea 0.2, MgSO4·7H2O 0.4, CaCl20.3. And the fermentation conditions were selected as follows: pH6.0, rotation speed 220 r/min, temperature 30 ℃, inoculation sizeφ6%. Under above optimized condition, the FPA of cellulase reached 2.69 U/mL, which was double of FPA before optimization. By supplement with some additives, it was found that Tween-80 and lactose both enhanced the enzyme activity of cellulase production significantly, especially the BG activity. Initially, it was found that chitosan and its derivate facilitated cellulase fermentation, in which the chitosan effect was best. The FPA and BG activity of cellulase produced after adding 1.50 g/L chitosan reached 3.67 U/mL and 1.76 U/mL, respectively, which increased by 10% and 30% as compared to that without addition, and the CMCase reached 8.65 U/mL. The fermentation level was basically stable when enlarged to 5 L fermenter level. Thus, the cellulase FPA level studied herein was 3 times of that before the optimization from HWPRS, indicating a promising industrial future of cellulase production.

hot water pretreated rice straw (HWPRS);TrichodermareeseiRut-C30; cellulase; fermentation optimization; chitosan

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610003

碩士研究生(孫付保副教授為通訊作者,E-mail: fubaosun@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學基金(21176106)；中國博士后科學基金(2015M571666)；江蘇省生物質綠色燃料與化學品重點實驗室資助課題(JSBGFC14006)；河南省科技開放合作項目(162106000007)

2016-03-02，改回日期：2016-03-28