徐紅梅 曾祥福 鄧先珍 杜洋文

摘要：本研究對(duì)湖北省武陵山區(qū)油桐枯萎病進(jìn)行了病原菌分離與鑒定、致病性測(cè)定、病原菌生物學(xué)特性等研究。結(jié)果表明：油桐枯萎病病原菌為尖鐮孢。該病原菌在10～40 ℃溫度范圍均能生長(zhǎng)，最適生在溫度為25～30 ℃；在酸性、中性和堿性土壤條件下均能生長(zhǎng)，但在弱酸性條件下生長(zhǎng)最好。該病原菌能利用環(huán)境中的多種碳源和氮源。室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，5種供試殺菌劑對(duì)病原菌抑菌效果不同，50%多菌靈超微可濕性粉劑抑菌率最高。

關(guān)鍵詞：油桐；病原鑒定；生物學(xué)特性；毒力測(cè)定

中圖分類(lèi)號(hào)：S763.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1004-3020（2016）05-0042-04Pathogen Identification and Biological Characteristics of Tungoil Tree PestilenceXu Hongmei（1）Zeng Xiangfu（1，2，3，4）Deng Xianzhen（1，2，3，4）Du Yangwen（1，2，3，4）

（1.Hubei Academy of ForestryWuhan430075；2.Hubei Provincial Engineering Technology Research Center of

Woody OilBearing ForestWuhan430075；3.Hubei Collaborative Innovation Center for Exploiting Characteristic

Resources in Dabie MountainsHuanggang438000；4.Hubei Key Laboratory of NonTimber

Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive UtilizationWuhan430075）

Abstract： Pathogen identification and biological characteristics of Tungoil Tree Pestilence in Wuling Mountainous Area in Hubei Province was studied in this paper.It showed Fusarium oxysporum was the pathogen.The mycelia could grow in the temperature ranging from 10℃ to 40℃，and optimum temperature ranged from 25 ℃ to 30 ℃.The pathogen could grow in acid， neutal and alkaline soil with the highest growth in weak acid soil.The pathogen could absorb many kinds of carbon and nithogen source in the enviroment.Toxicity of five kinds of fungicides to the pathogen was tested in the lab.Different fungicides inhibit the growth of mycelia in different levels， and 50% carbendazim WP showed best effect.

Key words：Aleurites fordii ； pathogen identification； biological characteristics； toxicity test

油桐Vernicia fordii是大戟科油桐屬植物統(tǒng)稱(chēng)，為著名的的工業(yè)油料樹(shù)種。武陵山區(qū)自然條件適于種植油桐，在歷史上一直是中國(guó)桐油中心產(chǎn)區(qū)，油桐產(chǎn)業(yè)是該區(qū)重要的特色資源產(chǎn)業(yè)＼[1＼]。

病蟲(chóng)害防治是油桐生產(chǎn)栽培中的一項(xiàng)重要內(nèi)容，發(fā)生較嚴(yán)重的典型病害有油桐枯萎病、黑斑病、根腐病和炭疽病等[2]。對(duì)于這些油桐病害的深入研究，可查閱文獻(xiàn)并不多。油桐枯萎病在油桐產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)可造成重大損失。部分學(xué)者對(duì)油桐枯萎病進(jìn)行了研究，包括病原菌鑒定、病害發(fā)生規(guī)律、感病植物生理生化和抗性株系選育等內(nèi)容＼[3-6＼]。油桐枯萎病研究十分薄弱，主要涉及病原菌鑒定[7]。2015年6～10月，作者對(duì)湖北省來(lái)鳳縣油桐林（三年桐）病蟲(chóng)害進(jìn)行了初步調(diào)查，該地油桐病蟲(chóng)害發(fā)生較為頻繁，其中油桐枯萎病和黑斑病較為嚴(yán)重。油桐枯萎病病癥主要表現(xiàn)為葉片枯黃，較早脫落，但是油桐根系無(wú)明顯癥狀。本文對(duì)油桐枯萎病病原進(jìn)行了初步鑒定和生物學(xué)特性研究，以期為病害發(fā)生規(guī)律及防治研究提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1病原物分離

供試材料為湖北省來(lái)鳳縣百福司鎮(zhèn)沙道灣村油桐枯病發(fā)病葉片，2015年7月、9月分別采集樣品1次。采用組織分離法進(jìn)行病原物分離工作。

用無(wú)菌剪刀在病健交界處剪取約1 cm2組織塊，70%酒精中浸1 s后在01%升汞中消毒180～240 s，無(wú)菌水換洗3次。用無(wú)菌鑷子將其移至PDA（馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂17 g，蒸餾水1 000 mL）平板培養(yǎng)基上，每皿均勻分布3～5段。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使皿底向上，置于25 ℃恒溫箱中。培養(yǎng)2～3 d后，將植物組織周?chē)L(zhǎng)出的菌絲體轉(zhuǎn)接至新的PDA平板上進(jìn)行純化。觀察記錄各純化菌株培養(yǎng)性狀后保存于4℃冰箱備用。

1.2致病性測(cè)定

依據(jù)柯赫氏法則，測(cè)試各純化菌株的致病性。油桐健康葉片源自湖北省林科院九峰油桐示范林。剪取健康葉片，放入保鮮盒中，取長(zhǎng)滿平皿的菌絲塊緊貼在葉片表面，對(duì)照組加無(wú)菌培養(yǎng)基塊，25 ℃恒溫培養(yǎng)，保持90%相對(duì)濕度。48 h后觀察葉片發(fā)病情況，并記錄發(fā)病癥狀。將發(fā)病葉片進(jìn)行組織分離，獲得再分離菌株，與原接種菌株進(jìn)行比較。

1.3病原菌鑒定

將病原物接種在PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)3 d，觀察記錄菌落形態(tài)特征，主要包括生長(zhǎng)速度、菌絲顏色、是否有氣生菌絲、菌落結(jié)構(gòu)及色素產(chǎn)生情況等。挑取菌絲體，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲體形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、厚垣孢子的有無(wú)和產(chǎn)生方式及分生孢子形態(tài)、顏色、大小等特征。參考文獻(xiàn)資料＼[8-9＼]對(duì)病原菌形態(tài)進(jìn)行鑒定。

病原物基因組提取采用微波爐裂解法。核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1-5.8S-ITS2）基因擴(kuò)增采用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[10]。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，36次循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。病原物ITS基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)后獲得多個(gè)匹配的序列記錄，用CLUSTAL X軟件包進(jìn)行多序列比對(duì)。

1.4病原菌生物學(xué)特性研究

1.4.1溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

將保存?zhèn)溆玫木暝?5 ℃恒溫箱中預(yù)培養(yǎng)3 d，于菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，接種于PDA平板上，分別置于10，15，20，25，30，35，40 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次，4 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.4.2pH值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

用1 mol·L-1HCL和1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH值至4，5，6，7，8，9（酸度計(jì)測(cè)量pH值）。按1.4.1所述方法分別接種菌餅于不同pH值PDA培養(yǎng)基，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)3次，4 d后測(cè)量菌落直徑。

湖北林業(yè)科技第45卷第5期徐紅梅，等：油桐枯萎病病原鑒定及其生物學(xué)特性研究1.4.3碳源和氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

以查彼培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基（硝酸鉀20 g，磷酸氫鉀10 g，氯化鉀05 g，硫酸鎂05 g，硫酸亞鐵001 g，蒸餾水1 000 mL）。供試碳源為葡萄糖300 g，甘露醇276 g，可溶性淀粉2455 g，麥芽糖2725 g，蔗糖259 g，果糖2725 g（用量以葡萄糖300 g含碳量109 g為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行換算），滅菌后接種，以無(wú)碳源處理作為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次，置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，4 d后測(cè)量菌落直徑。

供試氮源為硝酸鉀100 g，尿素30 g，硫酸銨66 g，甘氨酸75 g，硝酸銨40 g（用量以硝酸鉀100 g的含氮量14 g為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行換算），滅菌后接種，以無(wú)氮源處理作為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次，置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，4 d后測(cè)量菌落直徑。

1.4.4不同殺菌劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的毒力測(cè)定

在無(wú)菌操作條件下，將供試殺菌劑分別用無(wú)菌水稀釋成所需濃度10倍于供試濃度的5個(gè)系列濃度梯度的藥液。向培養(yǎng)皿中加入藥液1 mL，再加入9 mL冷卻至50～60 ℃的PDA培養(yǎng)基，充分混勻，最終配制成所需濃度的含藥培養(yǎng)基，以不含藥劑的培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)濃度重復(fù)4次。供試藥劑和使用濃度見(jiàn)表1。

采用生長(zhǎng)速率法對(duì)菌絲生長(zhǎng)進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定[11]：在每個(gè)含藥劑平板中央接入一塊直徑為5 mm的菌餅，25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)4 d后測(cè)量菌落直徑，根據(jù)以下公式計(jì)算各藥劑濃度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率。所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS170統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，求出各藥劑毒力回歸方程、EC50及相關(guān)系數(shù)。

抑菌率（%）=對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑×100%表1供試藥劑和使用濃度表殺菌劑名稱(chēng)生產(chǎn)廠家使用濃度/（μg·mL-1）125%氟環(huán)唑懸乳劑西班牙巴斯夫歐洲公司50，25，125，625，31343%戊唑醇懸乳劑澳大利亞拜耳作物科學(xué)公司25，125，625，313，1650%多菌靈超微可濕性粉劑山東綠豐農(nóng)業(yè)有限公司125，625，313，16，0870%代森錳鋅可濕性粉劑山東富先達(dá)農(nóng)藥有限公司250，125，625，3125，156275%百菌清可濕性粉劑山西華農(nóng)生物化學(xué)有限公司100，50，25，125，6252結(jié)果和分析

2.1病原物分離培養(yǎng)

病葉組織在PDA平板上培養(yǎng)3 d后即可見(jiàn)菌絲在其邊緣長(zhǎng)出。經(jīng)過(guò)純化后共獲得5個(gè)純培養(yǎng)菌株。

2.2致病性測(cè)定

對(duì)5個(gè)菌株進(jìn)行致病性測(cè)定，結(jié)果顯示1個(gè)菌株對(duì)油桐健康葉片有強(qiáng)致病性。葉片接種3 d后出現(xiàn)褐色病斑，病斑形狀不規(guī)則，在25 ℃恒溫和高濕環(huán)境下，病斑擴(kuò)展迅速，15 d后部分供試嫩葉整葉褐化壞死。發(fā)病葉片組織分離后所得再分離菌株與接種菌株特征一致，符合柯赫氏法則。

2.3病原菌鑒定

該強(qiáng)致病力菌株氣生菌絲發(fā)達(dá)，白色絨絮狀，有明顯的分枝和分隔，能分泌紫紅色素。產(chǎn)生大小兩型分生孢子。作者結(jié)合病原物培養(yǎng)性狀、形態(tài)學(xué)特征和rDNAITS基因序列比對(duì)結(jié)果將其初步鑒定為尖鐮孢Fusarium oxysporum。

2.4病原菌生物學(xué)特性

2.4.1溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

結(jié)果表明，該菌在10～40 ℃溫度范圍均能生長(zhǎng)，25～30 ℃菌絲生長(zhǎng)較快，其中25 ℃為最適生長(zhǎng)溫度，培養(yǎng)4 d后菌落平均直徑為850 mm。高溫和低溫均不利于菌絲生長(zhǎng)。當(dāng)溫度低于10 ℃或者高于40 ℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度緩慢（圖1）。

2.4.2pH值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

結(jié)果表明，該菌可以在pH值4～9范圍內(nèi)生長(zhǎng)，pH值5～7時(shí)菌落生長(zhǎng)速度較快，其中pH值為6是最適生長(zhǎng)pH值，菌落平均直徑為563 mm。pH值大于7時(shí)，隨著pH值的升高，菌落的生長(zhǎng)速度逐漸降低（圖2）。

2.4.3碳源和氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

該菌在供試5種碳源培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，菌落直徑遠(yuǎn)大于缺碳對(duì)照，在蔗糖培養(yǎng)基上菌落直徑最大，平均直徑為686 mm，其次是甘露醇、葡萄糖、淀粉和麥芽糖。不同碳源培養(yǎng)基上菌落培養(yǎng)性狀差異不大，蔗糖為該菌菌絲生長(zhǎng)的最佳碳源（圖3）。

從圖4可以看出：該菌在供試5種氮源培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，菌落直徑大于缺氮對(duì)照，在硝酸鉀培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快，菌落平均直徑達(dá)到407 mm，其次是甘氨酸、硝酸銨、硫酸銨和尿素。不同氮源培養(yǎng)基上菌落培養(yǎng)性狀差異不大，硝酸鉀為該菌菌絲生長(zhǎng)的最佳氮碳源。

2.4.4不同殺菌劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，供試5種殺菌劑對(duì)該病原菌毒力不同，從大到小依次為：50%多菌靈超微可濕性粉劑﹥43%戊唑醇懸乳劑﹥125%氟環(huán)唑懸乳劑﹥75%百菌清可濕性粉劑﹥70%代森錳鋅可濕性粉劑。50%多菌靈超微可濕性粉劑對(duì)該病原菌的抑制效果最好，70%代森錳鋅可濕性粉劑效果最差，各殺菌劑對(duì)油桐枯萎病的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。表2供試藥劑對(duì)油桐枯萎病病原菌毒力測(cè)定結(jié)果處理毒力回歸方程相關(guān)系數(shù)EC50/（μg·mL-1）12.5%氟環(huán)唑懸乳劑y=0.591x+4.2060.95822.0243%戊唑醇懸乳劑y=0.556x+4.1120.87911.4150%多菌靈超微可濕性粉劑y=7.960x+0.2670.81753.9270%代森錳鋅可濕性粉劑y=0.447x+4.0320.975144.4975%百菌清可濕性粉劑y=1.008x+3.1580.95367.053結(jié)論與討論

本文對(duì)湖北省武陵山區(qū)油桐枯萎病開(kāi)展了病原菌分離與鑒定、致病性測(cè)定、病原菌生物學(xué)特性等研究，為該病害的發(fā)生規(guī)律和防治研究提供理論依據(jù)。組織分離所獲得的5個(gè)菌株經(jīng)致病性測(cè)定，有1個(gè)菌株為油桐枯萎病強(qiáng)致病菌。依據(jù)該強(qiáng)致病病原菌形態(tài)學(xué)特性及rDNA-ITS序列比對(duì)結(jié)果，鑒定油桐枯萎病的病原菌為尖鐮孢。生物學(xué)特性研究表明，該病原菌在10～40 ℃溫度范圍均能生長(zhǎng)，最適生在溫度為25～30 ℃；病原菌在pH值4～9可以生長(zhǎng)，pH值5～7時(shí)菌落生長(zhǎng)速度較快，表明病原菌在酸性、中性和堿性土壤條件下均能生長(zhǎng)，但在弱酸性條件下生長(zhǎng)最好。該病原菌能利用環(huán)境中的多種碳源和氮源，蔗糖和硝酸鉀分別為該菌菌絲生長(zhǎng)的最佳碳源和氮源，因此在生產(chǎn)管理中應(yīng)注意合理施肥?？傮w說(shuō)來(lái)，油桐枯萎病病原菌對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力很強(qiáng)，該生物學(xué)特性為其容易侵染和傳播奠定了基礎(chǔ)。

室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，供試5種殺菌劑對(duì)該病原菌毒力不同。毒力較強(qiáng)殺菌劑為：50%多菌靈超微可濕性粉劑、43%戊唑醇懸乳劑和12.5%氟環(huán)唑懸乳劑；毒力較差殺菌劑為：75%百菌清可濕性粉劑和70%代森錳鋅可濕性粉劑。生產(chǎn)過(guò)程中可以參考本研究結(jié)果，選擇50%多菌靈超微可濕性粉劑等殺菌劑防治油桐枯萎病。

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