毛雪，賈孟軍，劉玉梅*

（新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆烏魯木齊830046）

不同品種葡萄枝蔓中原花青素含量及其活性的比較研究

毛雪，賈孟軍，劉玉梅*

（新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆烏魯木齊830046）

以不同品種葡萄枝蔓為原料提取其中的原花青素并進(jìn)行分離純化，同時(shí)采用清除自由基的方法評(píng)價(jià)得到的高、低聚原花青素的抗氧化活性。結(jié)果表明：各品種葡萄枝蔓中原花青素的總含量為36.81～68.49 mg/g；其中，低聚原花青素的含量在9.75～16.87 mg/g之間，高聚原花青素含量在13.56～26.04 mg/g之間。各提取物的抗氧化活性研究表明，高、低聚原花青素都有較強(qiáng)的抗氧化活性。通過顯著性分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)原花青素質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除能力與葡萄枝蔓的品種有關(guān)，而對(duì)羥基自由基的清除能力與原花青素的聚合度有關(guān)；當(dāng)質(zhì)量濃度提高到0.05 mg/mL時(shí)，其對(duì)羥基自由基的清除能力也與葡萄枝蔓的品種有關(guān)。

葡萄枝蔓；原花青素；抗氧化活性；F檢驗(yàn)；SSR檢驗(yàn)

原花青素（proanthocyanidin，PC）是植物界中廣泛存在的一大類多酚類化合物的總稱[1-3]，由不同數(shù)量的兒茶素、表兒茶素或沒食子酸經(jīng)C4-C6或C4-C8鍵縮合而成[4-6]。按照聚合度的不同，一般將二～四聚體稱為低聚體，五聚體以上的稱為髙聚體[7]。研究證明，原花青素抗氧化活性和清除自由基能力是維生素C（Vitamin C，VC）的20倍、維生素E（Vitamin E，VE）的50倍[8]，并且還具有保護(hù)心血管[9]、抗氧化[10]、抗突變、抗癌[11-12]、抗輻射[13]、促進(jìn)細(xì)胞增殖等多種生物學(xué)活性[14]，且無(wú)毒性，對(duì)80多種疾病具有直接或間接的預(yù)防和治療作用[15]，是目前國(guó)際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基最有效的天然抗氧化劑之一，在醫(yī)藥[16]、保健和化妝品[17-18]等領(lǐng)域有著廣泛用途。

葡萄是多年生藤本植物，在新疆種植面積廣泛。在栽培管理中，為了提高葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)，每年都要對(duì)枝蔓進(jìn)行修剪，因此會(huì)產(chǎn)生大量的葡萄枝蔓。如何充分利用這些廢棄的葡萄枝蔓，提高其附加價(jià)值是我們關(guān)注的重點(diǎn)。

本研究收集了新疆吐魯番、瑪納斯兩地種植的12種葡萄枝蔓，在對(duì)各品種葡萄枝蔓中原花青素的含量進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用乙酸乙酯和正丁醇對(duì)粗提液進(jìn)行了分離純化，獲得了初步提純的低聚、髙聚原花青素兩個(gè)樣品，同時(shí)對(duì)乙酸乙酯和正丁醇萃取后的殘留水相部分（其他物質(zhì)）也進(jìn)行了含量分析，并對(duì)各部分的提取率進(jìn)行了計(jì)算。對(duì)純化后的不同品種葡萄枝蔓中的高、低聚原花青素，采用2,2-苯基-1-間三硝苯基聯(lián)肼（1,1-dipheny-2-picry-hydrazy-1，DPPH）自由基和羥基自由基的抗氧化活性體系進(jìn)行了活性評(píng)價(jià)，并采用統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)各品種提取物的抗氧化活性的差異進(jìn)行了顯著性分析，以期為葡萄枝蔓的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

葡萄枝蔓分別采自新疆吐魯番（無(wú)核白、馬奶子葡萄品種）及瑪納斯地區(qū)（其余品種），干燥，用前粉碎，過40目篩。

原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（含量為95%）：上海源葉生物科技有限公司提供；DPPH：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇等（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

RHP-1000A快速開蓋型萬(wàn)能高速粉碎機(jī)：永康市榮浩工貿(mào)有限公司；BS210S電子天平：德國(guó)賽多利斯有限公司；UV-5300PC紫外/可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；R201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；DHG-9075A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；80-2型離心沉淀器：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3方法

1.3.1原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用甲醇溶解、定容至10 mL，為儲(chǔ)備液。將上述儲(chǔ)備液用甲醇稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為0.004 8 mg/mL、0.009 5 mg/mL、0.019 0 mg/mL、0.0285mg/mL、0.0380mg/mL、0.0475mg/mL、0.0570mg/mL、0.066 5 mg/mL、0.076 0 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。用甲醇做參比，在波長(zhǎng)280 nm條件下用紫外/可見分光光度計(jì)測(cè)定該系列溶液的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2樣品中原花青素的提取及含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取10.000 0 g過40目篩的葡萄枝蔓樣品，加入300 mL體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液，在65℃水浴中攪拌提取90 min，抽濾并洗滌，濾渣再次加入300 mL體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液，按前述步驟再次提取90 min，抽濾后合并兩次濾液，得原花青素提取液，減壓濃縮（≤45℃）至（80±5）mL，離心分離上清液。取0.1 mL上述上清液用甲醇定容至10 mL容量瓶中，在波長(zhǎng)280 nm處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液中原花青素的質(zhì)量濃度C，并換算得到各品種葡萄枝蔓中原花青素的含量（mg/g），計(jì)算公式如下：

式中：n為提取液稀釋倍數(shù)；C為稀釋后提取液中原花青素的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；m為葡萄枝蔓的質(zhì)量，g。

1.3.3高、低聚原花青素的分離及含量測(cè)定

將1.3.2方法所得上清液用200mL的乙酸乙酯分成75 mL、 50 mL、40 mL和35 mL四次進(jìn)行萃取，合并乙酸乙酯相，減壓蒸餾（≤35℃）得低聚原花青素產(chǎn)品。將乙酸乙酯萃取后殘留水相分別用50 mL、40 mL、30 mL、20 mL和10 mL正丁醇分5次萃取，合并萃取液，減壓濃縮（≤45℃）得高聚原花青素產(chǎn)品。正丁醇萃取的水相混合物經(jīng)減壓蒸餾脫去大部分水分后，常溫干燥，即為其他物質(zhì)。

分別準(zhǔn)確稱取5.0 mg上述所得的高、低聚原花青素樣品和殘留物，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，稀釋后在波長(zhǎng)280 nm條件下測(cè)定其吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液中原花青素的濃度C，并換算得到相應(yīng)的原花青素的含量。

1.3.4高、低聚原花青素抗氧化活性的研究

（1）清除DPPH自由基活性評(píng)價(jià)

配制0.04 mg/mL的DPPH甲醇溶液（避光放置）。取1 mL樣品于試管中，加入DPPH溶液3 mL，充分混勻，放置40 min。用1 mL甲醇作為空白對(duì)照組代替樣品，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)其吸光度值，每組樣品做三個(gè)平行。為避免樣液顏色差異可能引起的誤差，本實(shí)驗(yàn)采用1 mL樣品溶于3 mL甲醇溶液作參比[19]。DPPH自由基清了作率（E）計(jì)算公式如下：

式中：A（樣）表示添加樣品時(shí)溶液吸光度值；A（控）表示未添加樣品時(shí)溶液的吸光度值。

（2）清除羥基自由基活性評(píng)價(jià)（HO·鄰二氮菲-2價(jià)鐵離子法）

取0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液1 mL于試管中，依次加入磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH=7.4）2 mL和蒸餾水1 mL，充分混勻后，加0.75 mmol/L硫酸亞鐵液1 mL，混勻，加入0.01%H2O21 mL，于37℃下溫育60 min，于波長(zhǎng)536 nm處測(cè)其吸光度值，記為AP；用1 mL蒸餾水代替上述1 mL H2O2，測(cè)其吸光度值，記為AB；用試樣液1 mL代替上述1 mL蒸餾水，測(cè)得吸光度值，記為AS[20]。羥基自由基清除率（d）通過下式計(jì)算：

（3）SSR法計(jì)算顯著性[21-22]

新復(fù)極差檢驗(yàn)法（the shortest significant ranges，SSR）是由鄧肯于1955年提出的，通過計(jì)算平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤、最小顯著極差（least significant ranges，LSR），即可檢驗(yàn)各平均數(shù)間差異的顯著性。

1.3.5統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果均是采用Microsoft Excel或OriginPro 8.6專業(yè)軟件來(lái)處理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2　結(jié)果與分析

2.1原花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)，以原花青素質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。根據(jù)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=17.675 3X+0.060 9，R=0.999 4，線性范圍0.004 8～0.076 0 mg/mL。在此范圍內(nèi)原花青素質(zhì)量濃度與吸光度值有良好的線性關(guān)系。

圖1　原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of proanthocyanidin

2.2不同品種葡萄枝蔓中原花青素的含量分析

不同品種的葡萄枝蔓中原花青素的含量見表1。

表1　12種葡萄枝蔓中總原花青素的含量Table 1　Content of total proanthocyanidin of 12 grape vines

由表1可知，12種葡萄枝蔓中原花青素的含量在36.81～68.49 mg/g之間，其中吐魯番地區(qū)的無(wú)核白和馬奶子葡萄枝蔓中的原花青素的含量均高于瑪納斯地區(qū)的葡萄枝蔓，瑪納斯地區(qū)的葡萄枝蔓以白詩(shī)南中原花青素的含量相對(duì)較高。按照1.3.3節(jié)的方法分離測(cè)定各葡萄品種枝蔓中的高、低聚原花青素含量的結(jié)果表明，各品種高、低聚原花青素占總原花青素的比例也有差異。其中，低聚原花青素的含量為9.75～16.87mg/g，所占的比例為24.14%～31.58%，高聚原花青素的含量為13.56～26.04 mg/g，所占的比例為26.91%～47.65%。

2.3葡萄枝蔓中原花青素抗氧化活性評(píng)價(jià)

按照1.3.4節(jié)的方法，對(duì)所提取的12種葡萄枝蔓中的高低聚原花青素產(chǎn)品進(jìn)行了清除DPPH自由基和清除羥基自由基（HO·鄰二氮菲-2價(jià)鐵離子法）的試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2　高、低聚原花青素DPPH自由基和羥基自由基清除率Table 2　Scavenging activity of polymer procyanidins and oligomeric procyanidins on DPPH radical and hydroxyl radical%

由表2可知，相同質(zhì)量濃度的高聚和低聚原花青素對(duì)于DPPH自由基與羥基自由基都有一定的清除能力，但各品種的高聚與低聚原花青素的清除能力有一定的差異，這可能與其原花青素的聚合度不同有一定的關(guān)系。有關(guān)形成這種差異的原因，還有待后續(xù)的研究去闡明。同一品種葡萄枝蔓中高聚和低聚原花青素清除DPPH自由基的能力強(qiáng)于清除羥基自由基的能力，在羥基自由基清除試驗(yàn)中，質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL的高聚和低聚原花青素的清除能力強(qiáng)于質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL的原花青素，說(shuō)明清除羥基自由基的能力與原花青素的質(zhì)量濃度也有一定的關(guān)系。

2.4高、低聚原花青素清除自由基活性的統(tǒng)計(jì)分析

2.4.1高、低聚原花青素的抗氧化活性差異的顯著性分析

為了比較高聚和低聚原花青素的活性與其聚合度和葡萄枝蔓的品種有無(wú)直接差異，將高、低聚原花青素作為組，12種葡萄枝蔓作為重復(fù)觀測(cè)值（即k=2，n=12）。對(duì)DPPH自由基清除率數(shù)據(jù)和羥基自由基清除率數(shù)據(jù)進(jìn)行F檢驗(yàn)[21]，結(jié)果見表3。

表3　自由基清除率試驗(yàn)F檢驗(yàn)(k=2,n=12)Table 3　F-test of radical scavenging activities

根據(jù)表3結(jié)果可知，當(dāng)原花青素質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL時(shí)，高、低聚原花青素對(duì)羥基自由基的清除能力存在極顯著的差異，而對(duì)DPPH自由基的清除能力不存在差異（P＞0.05）。當(dāng)原花青素質(zhì)量濃度提高到0.05 mg/mL時(shí)，羥基自由基清除試驗(yàn)中高、低聚原花青素也無(wú)差異（P＞0.05）。

根據(jù)上述結(jié)論，可將高低聚原花青素作為組內(nèi)觀測(cè)值（高低聚各取兩個(gè)測(cè)定值，n=4），12種葡萄枝蔓作為組（k=12），考察不同品種葡萄枝蔓清除自由基能力的差異顯著性。將DPPH和羥基自由基清除率數(shù)據(jù)再次進(jìn)行F檢驗(yàn)，所得結(jié)果見表4。

表4　自由基清除率F檢驗(yàn)(k=12,n=4)Table 4　F-test of radical scavenging activities

根據(jù)表4數(shù)據(jù)可知，當(dāng)原花青素質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL時(shí)，僅DPPH自由基清除活性有顯著性差異（P＜0.05），而對(duì)羥基自由基清除能力無(wú)差異（P＞0.05）。當(dāng)原花青素質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL時(shí)，各品種對(duì)羥基自由基的清除能力存在極顯著的差異（P＜0.01）。說(shuō)明在DPPH清除試驗(yàn)（0.02 mg/mL）和羥基自由基清除試驗(yàn)（0.05 mg/mL）中，原花青素對(duì)自由基的清除能力與葡萄枝蔓的品種有關(guān)，而當(dāng)原花青素質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL時(shí)，其清除羥基自由基的能力與葡萄枝蔓的品種無(wú)關(guān)，這與表3所得結(jié)論相吻合。

2.4.2不同品種葡萄枝蔓中原花青素的抗氧化活性顯著性分析

表5　不同葡萄品種的高低聚原花青素DPPH自由基清除活性比較Table 5　Comparison of polymer procyanidins and oligomeric procyanidins of different grape on DPPH radical scavenging activity

因F檢驗(yàn)證明清除DPPH自由基（0.02 mg/mL）的活性和清除羥基自由基（0.05mg/mL）的活性均與葡萄枝蔓的品種有關(guān)，因此，為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)各品種的抗氧化活性差異，采用新復(fù)極差法（SSR法）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了多重比較[21-22]，并根據(jù)SSR和LSR值比較不同品種葡萄枝蔓的顯著關(guān)系，不同葡萄品種的高低聚原花青素對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除活性結(jié)果見表5、表6。

由表5數(shù)據(jù)可知，在DPPH自由基清除試驗(yàn)中，雷司令、煙73、貴人香這三種葡萄枝蔓分別與無(wú)核白和馬奶子存在顯著性差異（0.01＜LSR＜0.05），且霞多麗也與無(wú)核白存在顯著性差異（0.01＜LSR＜0.05）。其余葡萄品種的高低聚原花青素提取物清除DPPH自由基的活性無(wú)差異（LSR＞0.05）。

表6　不同葡萄品種的高低聚原花青素羥基自由基清除活性比較Table 6　Comparison of polymer procyanidins and oligomeric procyanidins of different grape on hydroxyl radical scavenging activity

由表6數(shù)據(jù)可以看出，在羥基自由基清除試驗(yàn)中，霞多麗、佳美、煙73這三種葡萄枝蔓與無(wú)核白、晚紅蜜、美樂、白詩(shī)南、紅提之間存在極顯著的差異（LSR＜0.01）；馬奶子、赤霞珠與無(wú)核白和晚紅蜜之間差異也極顯著（LSR＜0.01）。而雷司令與無(wú)核白、佳美、煙73、霞多麗之間存在顯著性差異（0.01＜LSR＜0.05），貴人香與無(wú)核白、佳美、煙73存在顯著性差異（0.01＜LSR＜0.05），赤霞珠與美樂、白詩(shī)南、紅提之間也差異顯著（0.01＜LSR＜0.05）。其余葡萄品種的高低聚原花青素提取物清除羥基自由基的活性無(wú)顯著差異（LSR＞0.05）。

3　結(jié)論

通過對(duì)晚紅蜜、白詩(shī)南等12種葡萄枝蔓中的原花青素進(jìn)行提取分離，結(jié)果顯示不同品種的葡萄枝蔓之間的原花青素含量存在一定的差異，12個(gè)品種的葡萄枝蔓中總原花青素的含量為36.81～68.49 mg/g；其中，低聚原花青素的含量為9.75～16.87 mg/g，高聚原花青素含量為13.56～26.04 mg/g。通過研究不同品種的高、低聚原花青素提取物的抗氧化活性，結(jié)合F檢驗(yàn)和SSR檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析表明，在DPPH自由基清除試驗(yàn)（0.02 mg/mL）和羥基自由基清除試驗(yàn)（0.05 mg/mL）中高低聚原花青素的差異與葡萄枝蔓的品種有關(guān)。羥基自由基清除試驗(yàn)（0.02 mg/mL）中，其清除羥基自由基的能力與聚合度有關(guān)而與葡萄枝蔓品種無(wú)關(guān)，而此質(zhì)量濃度下的DPPH自由基清除試驗(yàn)中，不同葡萄枝蔓品種之間存在著顯著性差異。對(duì)葡萄枝蔓中的原花青素提取分離，提高了葡萄種植產(chǎn)區(qū)廢棄物的利用價(jià)值，同時(shí)高低聚原花青素均具有良好的抗氧化活性，作為天然的抗氧化劑有很好的開發(fā)潛力和應(yīng)用價(jià)值。與從葡萄籽中提取原花青素的工藝比較，采用葡萄枝蔓提取原花青素，對(duì)大多數(shù)葡萄品種而言，還可以省去脫脂脫蛋白等前處理過程，具有提取工藝簡(jiǎn)單，提取收率高等優(yōu)勢(shì)。

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Comparative study on the content and antioxidant activity of proanthocyanidins derived from grape vines of different varieties

MAO Xue,JIA Mengjun,LIU Yumei*
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Xinjiang University,Urmuqi 830046,China)

Using the vines of different grape varieties as raw material,the total proanthocyanidins were analyzed and the proanthocyanidins crude extract were separated and purified.At the same time,the scavenging activity of free radical was detected to evaluate antioxidant activities of polymeric procyanidins(PPCs)and oligomeric proanthocyanidins(OPCs).The results suggested that the total proanthocyanidin contents in grape vines of different varieties were 36.81-68.49 mg/g.Among them,the OPCs content was 9.75-16.87 mg/g and PPCs were 13.56-26.04 mg/g.The antioxidant activity of the extracts showed that PPCs and OPCs all had strong antioxidant activity.The significance analysis results showed that when the proanthocyanidin concentration was 0.02 mg/ml,the scavenging ability of DPPH radical had relation with the varieties of the grape vines,and the scavenging ability towards hydroxyl radical had relation with the degree of proanthocyanidin polymerization.When the concentration of proanthocyanidin increased to 0.05 mg/ml,the scavenging ability of hydroxy radical also had relation with the varieties of the grape vines.

grape vines;proanthocyanidins;antioxidant activity;F-test;SSR-test

TS201.2

0254-5071（2016）10-0072-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.016

2016-05-27

國(guó)家自然科學(xué)基金（31360403）

毛雪（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)。

劉玉梅（1965-），女，教授級(jí)高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)槭称饭δ芤蜃印?/p>