， ，

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 呼和浩特 010019； 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)園藝研究院， 呼和浩特 010010)

老芒麥和紫芒披堿草及其雜種F1代與BC1代的ISSR分析

李小雷1，鮑紅春2，于卓1

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 呼和浩特 010019； 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)園藝研究院， 呼和浩特 010010)

利用ISSR技術(shù)對(duì)老芒麥(ElymussibiricusL.)和紫芒披堿草(ElymuspurpuraristatusC.P)及其雜種F1代與BC1代的遺傳差異性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，從90個(gè)ISSR引物中篩選出8個(gè)適宜引物，共擴(kuò)增出71個(gè)ISSR位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)比率為36.6%。供試材料的遺傳距離變幅為0.230 8～0.659 1，老芒麥與紫芒披堿草的遺傳距離較大(0.712 2)，以GD值0.50為基準(zhǔn)，分為兩類，母本老芒麥、正交F1代、L-BC1、Z-BC1為一類。父本紫芒披堿草、反交F1代為一類，BC1代偏向輪回親本老芒麥遺傳。

老芒麥； 紫芒披堿草； 雜種F1代； BC1代； ISSR

遠(yuǎn)緣雜交是不同物種間進(jìn)行基因交流、創(chuàng)造遺傳變異的有效途徑，目前已成為育種者進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新，選育新品種的重要手段[1-3]。小麥族(Triticeae Dumortier)屬于禾本科(Gramineae)，與人類關(guān)系十分密切，因其含有栽培小麥所缺乏的抗旱、抗病蟲，耐瘠薄、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等寶貴基因資源，現(xiàn)已成為麥類作物及牧草遺傳改良的巨大基因庫。小麥族中很多種類既為人們提供優(yōu)質(zhì)牧草，又在水土保持、防風(fēng)固沙等方面發(fā)揮重要作用，如披堿草屬(Elymus)、偃麥草屬(Elytrigia)、冰草屬(Agropyron)、大麥屬(Hordeum)等[4-8]。紫芒披堿草(ElymuspurpuraristatusC.P)與老芒麥(ElymussibiricusL.)均為小麥族披堿草屬(Elymus)的多年生禾草，紫芒披堿草為6倍體，其主要優(yōu)點(diǎn)是鮮草產(chǎn)量高、不易倒伏、抗病蟲、抗旱、耐鹽堿，但在飼草品質(zhì)方面遜于老芒麥；老芒麥為四倍體，具有葉量大、品質(zhì)優(yōu)、產(chǎn)籽量高等特點(diǎn)，但植株容易倒伏、種子落粒性強(qiáng)[9]。為使二者的優(yōu)良性狀綜合到一起，選育具有草質(zhì)好、產(chǎn)量高、抗性強(qiáng)等特性的披堿草新種質(zhì)，近年來筆者將紫芒披堿草與老芒麥相組配進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，成功地獲得了正、反交雜種F1代。觀察發(fā)現(xiàn)，正、反交雜種F1代為五倍體，雜種優(yōu)勢(shì)很強(qiáng)，具有較高的育種利用價(jià)值，但雜種F1代高度不育，致使其進(jìn)一步利用受到了限制。為此，用回交方法成功地獲得了(老芒麥×紫芒披堿草)×老芒麥和(紫芒披堿草×老芒麥)×老芒麥的回交一代，BC1代的育性得到了一定恢復(fù)。

ISSR是建立在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上的一種新型DNA分子標(biāo)記技術(shù)。它能快速、高效地檢測(cè)出重復(fù)序列之間區(qū)域的DNA多態(tài)性，具有DNA用量少、穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富、成本較低、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。目前已在植物遺傳多樣性分析、農(nóng)作物品種鑒定、遺傳作圖、物種分類及分子標(biāo)記輔助選擇育種等方面得到了廣泛應(yīng)用[10-13]。本試驗(yàn)擬對(duì)紫芒披堿草、老芒麥及其雜種F1代和BC1代進(jìn)行ISSR研究，旨在從分子水平上探討親本與其雜交后代間的相似性和遺傳差異程度，以期為正、反交F1代與回交BC1代及親本間的識(shí)別和鑒定提供理論依據(jù)，同時(shí)也為雜交后代的選育利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料(表1)種植在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作物試驗(yàn)場(chǎng)內(nèi)、試驗(yàn)地土壤為沙壤質(zhì)暗栗鈣土，肥力適中，具有灌溉條件，無霜期145 d，降水量400 mm左右。

表1 試驗(yàn)材料

注：“L-BC1”表示[老芒麥×紫芒披堿草]×老芒麥回交一代，“Z-BC1”表示[紫芒披堿草×老芒麥]×老芒麥回交一代。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取與檢測(cè)

剪取各供試材料的新鮮幼葉0.5 g，利用植物基因組試劑盒對(duì)基因組總DNA進(jìn)行提取，然后取3μL DNA溶液稀釋后，再用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測(cè)，電極緩沖液為1×TAE Buffer，電源電壓為50 V，電泳20 min后，凝膠用核酸染料進(jìn)行染色，然后用紫外凝膠成像系統(tǒng)儀觀察、照相。最后將模板DNA濃度調(diào)至20 ng/μL后，保存在冰箱-20 ℃下備用。

1.2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系20μL：20 ng/μL模板DNA 1μL、10×Buffer 2.0μL，25 mmol/L Mg2+1.6μL，10 mmol/L dNTPs 0.4μL，10μmol/L引物0.8μL，5 UTaqDNA 聚合酶0.2μL，ddH2O 14μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s)，循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用1.5%瓊脂糖膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，電泳緩沖液為1×TAE Buffer，電泳時(shí)間1.5 h。電泳結(jié)束后凝膠用EB染色，拍照、記錄、保存圖像。

1.2.3 引物篩選

利用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成的ISSR引物，選取紫芒披堿草與老芒麥基因組DNA為模板，對(duì)90條ISSR引物進(jìn)行篩選，對(duì)于帶型清晰、重復(fù)性好的引物用于所有個(gè)體擴(kuò)增。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

ISSR通常被認(rèn)為是顯性標(biāo)記，電泳圖譜的每條條帶都代表引物的一個(gè)特異結(jié)合位點(diǎn)，按照點(diǎn)樣順序?qū)Χ鄳B(tài)性條帶進(jìn)行逐條比對(duì)，將清晰的條帶賦值為 1，相同遷移率位置無帶或模糊不清的弱帶賦值為 0，生成0，1組成的數(shù)矩陣，運(yùn)用DPS分析軟件計(jì)算供試材料間的遺傳相似系數(shù) (GS) 及遺傳距離 (GD)，并根據(jù)UPGMA方法進(jìn)行聚類分析[14-15]。

1) 多態(tài)性條帶百分率(%)=(K/N)×100%，式中K為擴(kuò)增出多態(tài)性條帶數(shù)目，N為檢測(cè)到的條帶總數(shù)。

2) 遺傳相似系數(shù)(GS) 和遺傳距離(GD)：遺傳相似系數(shù)(GS)=2Nij/(Ni+Nj)，式中Nij是指第i材料和第j材料共同的條帶數(shù)目，Ni為第i材料中擴(kuò)增的條帶數(shù)，Nj為第j材料中擴(kuò)增的條帶數(shù)；

遺傳距離(GD)=1-GS。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取

由圖1可以看出，紫芒披堿草、老芒麥及其雜種F1代和BC1代均出現(xiàn)1條帶型清晰、無拖尾的條帶，表明利用試劑盒提取的基因組DNA純度較高，無降解，完全符合ISSR試驗(yàn)要求。

2.2 ISSR擴(kuò)增結(jié)果

以老芒麥和紫芒披堿草的基因組DNA為模板，利用90個(gè)ISSR引物對(duì)供試材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終篩選出帶型清晰、多態(tài)性明顯、重復(fù)性好的引物共8個(gè)，占所有引物的8.9%。將這8個(gè)引物用于各供試材料的PCR擴(kuò)增，每個(gè)引物擴(kuò)增條帶范圍在 7～11條，其DNA片段長(zhǎng)度介于250～2 000 bp之間，8個(gè)引物共擴(kuò)增出71條條帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出8.9條，其中多態(tài)性條帶26條，多態(tài)性條帶比率為36.6%(表2、圖2)，表明在DNA分子水平上供試材料間存在著一定的遺傳差異性。從部分引物擴(kuò)增的ISSR指紋圖譜可以看出，老芒麥×紫芒披堿草雜種F1代與回交后代植株及雙親之間的ISSR譜帶差異明顯，這些引物可作為回交后代與親本及雜種F1代相互識(shí)別和鑒定的依據(jù)。

表2 引物序列及位點(diǎn)多態(tài)性

引物序列(5’-3’)擴(kuò)增條帶數(shù)多態(tài)性條帶數(shù)多態(tài)性條帶率(%)A05(AG)8C9444．4A07(TG)8RA8337．5A11(AG)8TA10440A49(AC)8RT8225A57(AG)8CC7228．6A99(TC)8C9444．4A123(CT)8RC11545．5A127(GAA)69222．2Total712636．6

注：1為老芒麥；2為紫芒披堿草；3為正交F1代；4為反交F1代； 5為L(zhǎng)-BC1；6為Z-BC1。圖2 供試材料部分引物 ISSR 擴(kuò)增結(jié)果

2.3 材料間親緣關(guān)系聚類分析

遺傳距離(GD)表示2個(gè)材料間的遺傳差異程度，GD值愈大表明遺傳背景差異性越強(qiáng)，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。供試材料的遺傳距離范圍在0.230 8～0.659 1之間，平均距離為0.36，說明供試材料間遺傳基礎(chǔ)較寬(表3)。其中Z-BC1與老芒麥之間遺傳距離僅為0.230 8，親緣關(guān)系最近；老芒麥與紫芒披堿草之間遺傳距離達(dá)到0.659 1，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，表明親本間遺傳背景具有較強(qiáng)的差異性。

表3 供試材料的遺傳距離矩陣

試驗(yàn)材料ABCDEB0．6591C0．41030．5682D0．54550．38780．4545E0．31430．62500．51430．6250F0．23080．56820．53850．43180．4286

注：A為老芒麥；B為紫芒披堿草；C為正交F1代；D為反交F1代；E為L(zhǎng)-BC1；F為Z-BC1。

注：A為老芒麥；B為紫芒披堿草；C為正交F1代； D為反交F1代；E為L(zhǎng)-BC1；F為Z-BC1。圖3 供試材料的ISSR聚類圖

從圖3可知，當(dāng)遺傳距離為0.50時(shí)，供試的6個(gè)材料明顯地劃分為2個(gè)類群，一類群含有老芒麥、正交F1代、L-BC1、Z-BC1。另一類群含有紫芒披堿草、反交F1代，各類群內(nèi)供試材料親緣關(guān)系較近，類群之間遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，回交BC1代偏向四倍體老芒麥遺傳，表明回交后代與輪回親本老芒麥有較近的遺傳關(guān)系。

3 討論與小結(jié)

ISSR分子標(biāo)記具有很好的多態(tài)性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，且不受樣品生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期、基因是否表達(dá)及環(huán)境的影響。能從DNA水平上檢測(cè)個(gè)體間的遺傳差異性和相似性，被認(rèn)為是研究物種親緣關(guān)系及種質(zhì)資源鑒別的有力工具[16-21]。本試驗(yàn)從90條ISSR 引物中篩選出8條適宜引物對(duì)6份材料進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，共擴(kuò)增出位點(diǎn)71個(gè)，其中多態(tài)性位點(diǎn)為26個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為36.60%，結(jié)果表明，親本與雜交后代間的ISSR位點(diǎn)多態(tài)性較豐富，不同引物得到的多態(tài)性位點(diǎn)比率不同，且同一引物對(duì)6份供試材料擴(kuò)增出的譜帶其數(shù)目、大小及位置等存在明顯差異，ISSR可作為遺傳標(biāo)記用于雜種鑒定和回交后代目標(biāo)性狀植株選擇。

各供試材料的遺傳距離分布范圍在0.230 8～0.659 1之間，遺傳距離最大為親本老芒麥與紫芒披堿草，最小為Z-BC1與老芒麥；以遺傳距離(GD)0.50為基準(zhǔn)，將供試材料劃分為兩類：第一類為老芒麥、正交F1代、L-BC1、Z-BC1。第二類為紫芒披堿草、反交F1代。利用ISSR 標(biāo)記技術(shù)從分子水平上揭示6份供試材料的親緣關(guān)系, 這將為雜種后代的選育提供理論依據(jù)。

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ISSR Analysis ofElymussibiricus，Elymuspurpuraristatusand Their Hybrid F1代and BC1

LIXiaolei1，BAOHongchun2，YUZhuo1

(1.College of Agronomy，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010019，China； 2. Institute of Horticulture，Inner Mongolia Academy of Agriculture and Husbandary Sciences，Huhhot 010010，China)

The genetic differences amongElymussibiricusL.，ElymuspurpuraristatusC.P，their hybrid F1and BC1were investigated by using ISSR technique. The results showed that 71 loci were amplified from 8 primers out of 90 ISSR primers，the polymorphic loci percentage were 36.6%. The genetic distance (GD) of tested plants were ranged from 0.230 8 to 0.659 1，and the genetic distance ofE.sibiricusandE.purpuraristatuswas ulterior(0.712 2)，using the GD value of 0.5 as threshold，6 tested plants could be clustered into 2 groups：group 1 including female parentE.sibiricusandE.sibiricus×E.purpuraristatusF1、L-BC1、Z-BC1，group 2 including male parentE.purpuraristatus、E.purpuraristatus×E.sibiricusF1，BC1tended to inherit toward recurrent parentE.sibiricus.

Elymussibiricus；Elymuspurpuraristatus； hybrid F1；BC1；ISSR

2016-07-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31302021)及內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：2010 MS 0502)資助。

李小雷 (1980—)，男，黑龍江綏化市人；博士，講師，主要從事飼用作物遺傳育種研究。

于 卓(1958—)，男，博士，教授，博導(dǎo)，主要從事飼用作物及馬鈴薯育種研究。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.12.017

S 543+.9

A

1001-4705(2016)12-0017-04