唐娟，王德芳，徐艷，唐興江

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

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缺血后處理對高脂血癥大鼠腦缺血再灌注后腦組織TNF-ɑ和SOCS-3表達(dá)的影響

唐娟，王德芳，徐艷，唐興江

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

目的 觀察缺血后處理(IPO)對高脂血癥大鼠局灶性腦缺血再灌注(I/R)損傷后腦組織腫瘤壞死因子ɑ(TNF-ɑ)和細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(SOCS-3)表達(dá)的影響。方法 選擇成年健康雄性SD大鼠105只，制作高脂血癥模型后隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、I/R組和IPO組各35只。采用改良線栓法制作局灶性腦I/R模型(I/R組)；再灌注前采用灌注15 s、閉塞15 s，重復(fù)3次的形式制作IPO模型(IPO組)。分別于7個(gè)時(shí)間點(diǎn)(造模后3、6、12、24、48、72 h及7 d)每組各取5只大鼠處死取腦組織，用HE染色法觀察各組腦組織病理形態(tài)改變，免疫組化法測定腦組織TNF-ɑ、SOCS-3的表達(dá)。結(jié)果 sham組腦組織無病理損傷改變，IPO組腦組織病理損傷較I/R組減輕。I/R組腦組織TNF-ɑ、SOCS-3表達(dá)于造模后3 h升高，24 h達(dá)到峰值，隨后各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量逐漸下降，于7 d時(shí)仍有少量表達(dá)。IPO組各時(shí)間點(diǎn)腦組織TNF-ɑ、SOCS-3表達(dá)趨勢與I/R組相同，但于造模后6、12、24、48、72 h時(shí)TNF-ɑ表達(dá)較I/R組降低(P均<0.05)，SOCS-3表達(dá)較I/R組升高(P均<0.05)，且各時(shí)間點(diǎn)IPO組、I/R組腦組織TNF-ɑ、SOCS-3表達(dá)均高于sham組(P均<0.05)。結(jié)論 IPO能抑制高脂血癥大鼠局灶性腦I/R損傷后腦組織TNF-ɑ的表達(dá)、上調(diào)SOCS-3的表達(dá)。

腦缺血；再灌注損傷；高脂血癥；缺血后處理；腫瘤壞死因子ɑ；細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3；大鼠

近年來，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，特別是高脂飲食的過多攝入，高脂血癥發(fā)病率不斷上升，成為心腦血管疾病發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，嚴(yán)重威脅人們身體健康。盡快恢復(fù)腦血流是減輕腦缺血的重要措施,但缺血再灌注(I/R)使腦組織產(chǎn)生不同程度的損傷。因此，尋求有效的腦保護(hù)方法以減輕I/R損傷成為臨床研究熱點(diǎn)。Zhao等[1]對心肌I/R犬模型的研究發(fā)現(xiàn)，采用反復(fù)多次間斷性再灌注的方法能夠縮小心肌梗死面積，改善心功能，首次提出了缺血后處理(IPO)的概念。但以高脂血癥為基礎(chǔ)的局灶性腦缺血大鼠模型來探討IPO的作用罕見報(bào)道。2015年10月～2016年3月，本研究探討IPO對高脂血癥大鼠局灶性腦I/R損傷后腦組織腫瘤壞死因子ɑ(TNF-ɑ)和細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(SOCS-3)表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探究IPO對腦保護(hù)作用的可能機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物分組、試劑及儀器 健康成年雄性SD大鼠105只，體質(zhì)量160～180 g，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。參考吳栩等[2]的高脂飼料配方進(jìn)行飼養(yǎng)，制備高脂血癥模型。將105只高脂血癥大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、I/R組、IPO組各35只。TC試劑盒、TG試劑盒、LDL-C試劑盒和HDL-C試劑盒[貝克曼庫爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(蘇州)有限公司]；兔抗大鼠TNF-ɑ多克隆抗體(美國Bioworld公司)；兔抗大鼠SOCS-3多克隆抗體(美國Bioworld公司)；DAB顯色劑(杭州赫貝科技有限公司)。全自動生化分析儀(日本Hitachi公司)；Leica DM 2500顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 IPO模型制備 用10%水合氯醛對大鼠行腹腔麻醉，麻醉成功，大鼠取仰臥位，將其頭部和四肢固定于解剖臺上，充分暴露頸部組織。sham組僅單純暴露右側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動脈；I/R組采用Longa等[3]的改良線栓法制作右側(cè)大腦中動脈栓模型，缺血90 min拔出線栓實(shí)施再灌注；IPO組參照孫靜等[4]的造模方法，即缺血90 min后，在實(shí)施再灌注前，將線栓拔出5 mm，維持15 s灌注后再將線栓插入維持15 s，如此反復(fù)3次。造模后根據(jù)Longa等[3]的評分原則對各組神經(jīng)功能缺失情況進(jìn)行評價(jià)，將無神經(jīng)功能缺失癥狀體征、開顱后出現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血、未完成實(shí)驗(yàn)即死亡的大鼠予以剔除，后續(xù)補(bǔ)入。分別于造模后3、6、12、24、48、72 h及7 d每組各取5只大鼠予以水合氯醛麻醉，迅速斷頭取腦組織，并去除低位腦干和小腦。將所取腦組織置于4%的多聚甲醛中固定，石蠟包埋，從視交叉后方連續(xù)冠狀位切片(厚3 μm)，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 大鼠腦組織形態(tài)學(xué)觀察 采用HE染色法。將備用切片予以二甲苯脫蠟，梯度濃度乙醇至水，蘇木素-伊紅染色，中性樹膠封片。光鏡下找到梗死灶一側(cè)，400倍高倍鏡下觀察梗死灶及其周圍組織的病理改變。

1.4 大鼠腦組織中TNF-ɑ、SOCS-3表達(dá)檢測 采用Envision法，具體步驟參照說明書。低倍鏡下于每張切片梗死灶周圍選取4個(gè)不同象限視野進(jìn)行觀察，于400倍高倍鏡下分別選取5個(gè)不連續(xù)視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，TNF-ɑ、SOCS-3表達(dá)陽性的細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色，或其胞質(zhì)內(nèi)有棕褐色顆粒。

2 結(jié)果

2.1 各組腦組織形態(tài)學(xué)改變 sham組腦組織未見明顯病理改變，其神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、胞質(zhì)、胞核等均表現(xiàn)正常，間質(zhì)無水腫、無炎性細(xì)胞浸潤等。I/R組于造模后3 h時(shí)即觀察到腦組織神經(jīng)細(xì)胞輕微的病理損害表現(xiàn)，神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞核固縮，但無明顯細(xì)胞壞死，部分可見空泡樣改變，炎性浸潤細(xì)胞少見；于造模后12 h時(shí)出現(xiàn)較為明顯的病理改變；24～48 h時(shí)病理改變達(dá)到高峰，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)典型的病理改變：細(xì)胞核固縮(濃染)、變形(呈梭形、新月形、長條形、三角形等)、碎裂甚至溶解，細(xì)胞高度水腫，出現(xiàn)空泡樣改變(即氣球樣變性)，炎性細(xì)胞浸潤明顯，且主要位于右側(cè)大腦皮質(zhì)及基底核區(qū)；72 h后病變減輕，細(xì)胞水腫程度逐漸減輕，炎性細(xì)胞浸潤逐漸減少。與I/R組比較，IPO組24～72 h腦組織細(xì)胞水腫程度減輕、炎性細(xì)胞浸潤減少。

2.2 各組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織TNF-ɑ、SOCS-3表達(dá)比較 見表1、2。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織TNF-ɑ陽性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)/視野，±s)

注：與前一時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05；與sham組比較，#P<0.05；與I/R組比較，★P<0.05。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織SOCS-3陽性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)/視野，±s)

注：與前一時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05；與sham組比較，#P<0.05；與I/R組比較，★P<0.05。

3 討論

近年來，IPO作為缺血性腦血管疾病的處理措施備受關(guān)注。IPO可能通過影響炎癥反應(yīng)、凋亡途徑、蛋白激酶B途徑等多種途徑來減輕I/R損傷[5]。但是對于IPO的方式、時(shí)間窗、缺血程度、再灌注/閉塞時(shí)間、循環(huán)次數(shù)等仍備受爭議。本研究采用孫靜等[4]的最佳IPO方案，并在預(yù)實(shí)驗(yàn)中觀察到在腦缺血90 min時(shí)予以反復(fù)3次再灌注15 s/缺血15 s的措施能夠產(chǎn)生腦保護(hù)作用。

目前研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)是腦I/R損傷的重要機(jī)制之一。在腦I/R早期，內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞及血管周圍的炎性細(xì)胞便釋放出TNF-ɑ、IL-6、IL-1等大量細(xì)胞炎癥因子，過度表達(dá)的細(xì)胞炎癥因子可引起腦組織強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，從而引起腦組織I/R損傷。作為炎癥反應(yīng)的起始因子，TNF-ɑ在腦I/R損傷中發(fā)揮著極其重要的作用，可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等釋放大量炎癥因子，促進(jìn)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞黏附，引起白細(xì)胞浸潤，激活炎癥細(xì)胞的級聯(lián)反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞與TNF-ɑ的表達(dá)呈正相關(guān)，表明TNF-ɑ與腦缺血的炎癥反應(yīng)有關(guān)[6]。細(xì)胞炎癥因子(TNF-ɑ、IL-6、IL-1等)主要通過JAK/STAT等細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮腦損傷作用，而SOCS-3可以對JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行負(fù)性調(diào)控，以減少炎癥因子的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)，起到腦保護(hù)作用[7]。

He等[8]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-ɑ在大鼠腦I/R 3 h開始表達(dá)，并于24 h達(dá)到高峰，抑制其活性或減少其表達(dá)將會減輕大鼠腦組織損傷程度。Xing等[9]運(yùn)用局灶性缺血60 min后，反復(fù)5次再灌注30 s/缺血30 s的處理方法發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的TNF-ɑ、IL-1 mRNA和細(xì)胞間黏附因子1的蛋白表達(dá)較對照組均明顯降低。本研究結(jié)果顯示，TNF-ɑ在sham組僅見少量表達(dá)，在I/R組中于I/R 3 h開始表達(dá)上升，6 h明顯上升，24 h達(dá)高峰。同時(shí)，IPO組大鼠TNF-ɑ在I/R 24 h達(dá)高峰，72 h時(shí)仍維持在較高水平，在6～72 h時(shí)，其表達(dá)較I/R組均明顯降低(P均<0.05)，且I/R組和IPO組各時(shí)間點(diǎn)TNF-ɑ表達(dá)均高于sham組(P均<0.05)，與上述文獻(xiàn)報(bào)道基本相符?？梢姡琁PO可以啟動機(jī)體相關(guān)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，減輕炎癥反應(yīng)，從而減輕腦I/R損傷。但是，本研究炎癥因子表達(dá)與既往類似研究結(jié)果比較，其表達(dá)趨勢雖然相似，但各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量卻更高，從而推測高脂血癥可能也會影響炎癥因子的表達(dá)。Bate等[10]應(yīng)用大鼠局灶性缺血模型發(fā)現(xiàn)，在梗死半球一側(cè)，SOCS-3 mRNA表達(dá)在I/R 12 h達(dá)高峰，24 h時(shí)仍維持在較高水平。有研究表明，若抑制腦缺血后SOCS-3的表達(dá)，腦梗死體積將明顯增加，神經(jīng)功能損害也明顯加重[11]；而上調(diào)SOCS-3表達(dá)，則可明顯縮小腦梗死體積[12]。因此，可以推測SOCS-3在缺血性腦損傷中起重要的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，sham組可見極少量SOCS-3表達(dá)，I/R組SOCS-3在I/R 3 h開始表達(dá)，并于24 h達(dá)高峰，至7 d天時(shí)仍有少量表達(dá)；IPO組在6～72 h時(shí)，SOCS-3較I/R組表達(dá)升高(P均<0.05)，與上述研究表達(dá)趨勢相似。說明IPO可以上調(diào)SOCS-3的表達(dá)，并且，其與TNF-ɑ表達(dá)變化趨勢相同。說明I/R上調(diào)TNF-ɑ的表達(dá)，引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)的同時(shí)，受損腦組織自身也會上調(diào)SOCS-3的表達(dá)，以抑制炎癥因子表達(dá)，起到內(nèi)源性保護(hù)作用。因此，IPO在一定程度上能上調(diào)SOCS-3的表達(dá)，以抑制炎癥因子的過度釋放，從而減輕腦組織炎性反應(yīng)，達(dá)到腦保護(hù)作用。

綜上所述，IPO對I/R損傷具有一定保護(hù)作用。但不同于既往研究，本研究采用高脂血癥大鼠來制作局灶性腦缺血模型，更接近于人體的自然發(fā)病過程。但炎癥因子表達(dá)較既往類似研究表達(dá)更高，因此，在高脂血癥的基礎(chǔ)上給予IPO是否進(jìn)一步影響了炎癥因子及其上調(diào)因素的表達(dá)有待下一步研究證實(shí)。

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唐興江(E-mail：3161946txj@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.37.012

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2016-04-10)