姜元欣 劉伯科 劉小玲

(1. 廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2. 廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004)

?

余甘子抑制口臭活性物質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定

姜元欣1,2劉伯科2劉小玲2

(1. 廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2. 廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004)

以電子鼻檢測及評價(jià)模型為抑臭活性導(dǎo)向方法，余甘子95%乙醇提取物經(jīng)過有機(jī)溶劑分級萃取、硅膠正相分離、C18反相柱分離后得到了抑制口臭活性含量最高的EⅡM20組分，將該組分進(jìn)行多次正相分離與HPLC制備分離，得到了3個(gè)單體化合物L(fēng)1(6.8 mg)、L2(4.5 mg)、L3(4.9 mg)，采用1H NMR、13C NMR、HR-ESI-MS等多種波譜分析對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。波譜分析表明：L1為麥芽糖(maltose)，L2為1,2-苯二甲酸-雙-2’甲基庚酯[Bis(2-methylheptyl)phthalate]，L3為1-(4’-氨苯基)-1,2異二醇[1-(4’-amino-phenyl)-ethane-1,2-diol]。為后續(xù)口臭研究及余甘子的開發(fā)利用提供了依據(jù)。

余甘子；口臭；分離純化；結(jié)構(gòu)鑒定

余甘子(PhyllanthusemblicaL.)為大戟科(Euphorbiaceae)葉下珠屬(Phyllanthus)熱帶、亞熱帶落葉小喬木的果實(shí)[1]，目前主要分布于中國南部的廣東、廣西、福建、貴州、云南等省區(qū)以及熱帶的印度、馬來西亞、泰國、巴基斯坦等國家。中國余甘子資源分布廣、品種繁多、產(chǎn)量豐富，但其開發(fā)利用率及產(chǎn)品附加值低。余甘子作為藏藥使用歷史悠久，其富含對人體有利的多種營養(yǎng)與活性成分，包括有酚類、糖類、皂苷、有機(jī)酸、黃酮等類型物質(zhì),如鞣花酸、柚皮素、云香苷、桂皮酸、槲皮素、沒食子酸、β-谷甾醇、二十六烷酸等[2-3]。自2004年起國內(nèi)外對余甘子植株活性研究報(bào)道日益增多。近年來研究表明余甘子具有抗氧化[4-5]、抗腫瘤[6]、抗衰老[7]抗菌與消炎[8]等作用。

口臭是一種口腔疾病，甚至是全身疾病的征兆。全球約25%的人遭受口臭的困擾，口臭對患者造成嚴(yán)重的生理及心里障礙。Lee等[9]探討了口臭與幽門螺桿菌的關(guān)系，研究表明幽門螺桿菌是口臭的致臭菌之一，能夠生成硫化氫和甲硫醇等揮發(fā)性硫化物。Mehrotra[10]研究了余甘子對幽門螺旋桿菌的抑制作用，結(jié)果表明余甘子中的多酚類、黃酮類物質(zhì)具有很好的抗幽門螺旋桿菌作用。Barwall[11]論述了口腔清新劑的質(zhì)量評價(jià)方法。除此之外，國內(nèi)外針對口臭形成的本質(zhì)、口臭的評價(jià)方法、抑制口臭的有效成分、改善口臭食品的研究還很缺乏?；诖耍狙芯恳噪娮颖羌夹g(shù)作為評價(jià)手段，以抑臭能力作為活性導(dǎo)向追蹤，對余甘子抑臭能力進(jìn)行評價(jià)，并對其提取物的抑臭成分進(jìn)行分離純化，以期從余甘子中尋找有抑制口臭的成分，為余甘子開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

余甘子(PhyllanthusemblicaL.)：品種為玻璃甘，產(chǎn)自廣東潮州，購于廣西南寧市海吉星水果批發(fā)市場；

乙醇、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、硫酸、十二烷基硫酸鈉、三乙醇胺：分析純；

牛血清蛋白：上海羅氏制藥有限公司；

甲醇、乙腈：色譜級， 美國Fisher Scientific公司；

超純水：過0.45 μm濾膜的娃哈哈純凈水；

硅膠薄層板GF254、柱層析用硅膠(100～200目)：青島海洋化工廠；

Agilent ZORBAX SB-C18柱：5 μm，4.6 mm×250 mm，美國安捷倫公司；

RP-C18：材料為Ultimate spherical XB-C18，40～70 μm，100 ?，浙江月旭科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱：HH.CP-7型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

電子天平：TLE204E型，梅特勒—托利多儀器(上海)公司；

紫外分析儀：WD-9403C型，北京市六一儀器廠；

高效液相色譜儀：Waters e2695型，Waters 2998光電二極管陣列檢測器(DAD)，Empower 2工作站，美國Waters公司；

質(zhì)譜儀：Agilent 1100 Series型，美國安捷倫公司；

超導(dǎo)核磁共振儀：DRX-500，德國Bruker公司；

質(zhì)譜儀：API-QSTAR-TOF型，加拿大Applied Biosystem Corporation公司；

便攜式電子鼻：PEN3，德國AIRSENSE公司；

分光光度計(jì)：722N型，上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.3.1 余甘子抑制口臭活性評價(jià)方法 課題組研究發(fā)現(xiàn)，電子鼻傳感器中R6(檢測甲基類化合物)、R7(檢測無機(jī)硫化物)、R9(檢測有機(jī)硫化物)與感官評價(jià)值相關(guān)性好，在口臭的評估與檢測中，R6、R7、R9可作為口腔惡臭的表征傳感器，其響應(yīng)值越大表明口臭氣味越嚴(yán)重。樣品的電子鼻測定圖譜導(dǎo)入電子鼻分析模型中所得的臭味指數(shù)值越大，表明其口臭越嚴(yán)重。因此本研究采用電子鼻的臭味指數(shù)為抑制口臭活性評價(jià)指標(biāo)。將待測組分配置成濃度為3.25 mg/mL的樣品液，在10 mL頂空瓶中分別加入1 mL全唾和0.2 mL樣品液，振蕩均勻后，置于37 ℃密封恒溫孵化12 h后，采用電子鼻分析其臭味程度，評價(jià)樣品的抑臭活性。

1.3.2 余甘子中抑臭活性物質(zhì)的提取分離 余甘子抑臭活性物質(zhì)提取分離純化路線見圖1。

(1) 余甘子活性物質(zhì)提取及有機(jī)溶劑萃?。河喔首庸麑?shí)采摘后，經(jīng)清洗晾干，去核，于55 ℃恒溫干燥2～3 d，粉碎，得余甘子干燥粉末，加入5倍體積的95%乙醇，超聲提取1.5 h后，于50 ℃水浴恒溫提取22.5 h，提取3次，合并提取液，過濾，于50 ℃真空濃縮干燥得乙醇提取浸膏(P)，并將浸膏用3倍體積的水分散，得懸浮液，依次用等體積氯仿、乙酸乙酯、正丁醇充分萃取，萃取次數(shù)4次以上，濃縮干燥，得到氯仿萃取組分(C)、乙酸乙酯萃取組分(E)、正丁醇萃取組分(B)、水余液組分(W)。采用1.3.1方法評價(jià)各萃取組分抑臭活性。

圖1 余甘子抑臭活性物質(zhì)提取分離流程

(2) E組分的硅膠柱層析分離：將1.3.2(1)溶劑萃取中活性較高的乙酸乙酯萃取組分(E)再用硅膠進(jìn)行柱層析分離。稱取乙酸乙酯(E)萃取組分112 g，用等量硅膠干法拌樣后，裝入玻璃層析柱，硅膠層析柱內(nèi)徑11 cm，柱高為50 cm。采用氯仿—甲醇體系進(jìn)行梯度洗脫；依次用9∶1(Ⅰ)，8∶2(Ⅱ)，7∶3(Ⅲ)，6∶4(Ⅳ)，1∶0(Ⅴ)進(jìn)行洗脫。按不同梯度收集樣品并真空濃縮至干，分別得到EⅠ、EⅡ、EⅢ、EⅣ、EⅤ組分。將各組分樣品配置成同濃度的待測樣品液，采用1.3.1方法測定不同洗脫組分的抑制口臭活性。

(3) EⅡ組分的C18反相層析柱分離：將1.3.2(2)乙酸乙酯萃取物硅膠柱層析的氯仿-甲醇體系8∶2(Ⅱ)洗脫組分EⅡ進(jìn)行C18低壓反相柱分離。C18反相層析柱內(nèi)徑5 cm，柱高為40 cm。采用20%甲醇水溶液、40%甲醇水溶液、60%甲醇水溶液、100%甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，按不同梯度收集樣品并濃縮至干，得到EⅡM20、EⅡM40、EⅡM60、EⅡM100。將各梯度樣品配置成同濃度的待測樣品液，采用1.3.1方法測定不同洗脫組分的抑制口臭活性。

(4) EⅡM20的HPLC分離：將1.3.2(3)中C18低壓反相柱分離洗脫組分EⅡM20用硅膠柱層析分離，干法裝柱后依次采用氯仿—甲醇體系50∶1(α)，15∶1(β)，10∶1(γ)，5∶1(δ)，3∶1(ε)，1∶1(ζ)進(jìn)行梯度洗脫，并采用薄層色譜法(TLC法)分析收集合并餾分，將所得餾分利用高壓制備液相色譜進(jìn)行分離。樣品溶解于甲醇溶液中，色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，紫外檢測波長：190～800 nm全波長掃描，流動(dòng)相：超純水與甲醇(色譜級)或者超純水與乙腈(色譜級)等度洗脫，流速：1.0 mL/min，溫度：25 ℃。

1.3.3 結(jié)構(gòu)鑒定 化合物L(fēng)1、L2、L3溶解于MOD中，采用BrukerDRX-500、DRX-600型超導(dǎo)核磁共振儀測定，測定氫譜(1H NMR)和碳譜(13C NMR)，以四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)。高分辨電子轟擊質(zhì)譜(HR-ESI-MS)采用API-QSTAR-TOF型質(zhì)譜儀測定。大氣壓化學(xué)電離源APCI，掃描范圍(scan range)：50～1 000 amu，掃描方式(scan mode)：full scan(SIM)。

2 結(jié)果與分析

2.1 余甘子粗提物及溶劑萃取物的活性分析

余甘子粗提物及不同溶劑萃取物的活性分析見表1。由表1可知，水余液的得率最高，表明余甘子粗提物中主要為極性大的物質(zhì)，中等極性物質(zhì)較少，極性小的物質(zhì)最少。與空白對照比對，乙醇粗提物的電子鼻模型臭味指數(shù)均顯著降低(約為空白的一半)，說明余甘子有明顯的抑臭作用。電子鼻傳感器R7(W1W)、R9(W2W)信號顯示，乙酸乙酯萃取部位與其他部位有顯著性差異，且信號值最低，說明余甘子乙酸乙酯萃取部位有明顯抑制無機(jī)硫化物和有機(jī)硫化物產(chǎn)生的作用；傳感器R6(W1S)信號顯示，氯仿與乙酸乙酯萃取部位無顯著性差異，但兩者相對其他部位有顯著差異，說明余甘子中小極性物質(zhì)有明顯抑制甲基類化合物產(chǎn)生的活性。與95%乙醇粗提物相比，各萃取組分臭味指數(shù)有一定差異，其中氯仿和正丁醇萃取物與乙醇粗提物相當(dāng)，而水余液不如乙醇粗提物。比較其傳感器信號值顯示，乙酸乙酯萃取物的抑制活性最顯著，同時(shí)對甲基類化合物的抑制也相當(dāng)顯著，說明余甘子萃取分離后所得乙酸乙酯萃取物活性顯著高于95%乙醇提取液，萃取分離對余甘子的抑臭活性物質(zhì)進(jìn)行了富集純化。

2.2 E組分的硅膠柱分離及活性分析

乙酸乙酯萃取組分經(jīng)硅膠柱分離得到5個(gè)組分EⅠ、EⅡ、EⅢ、EⅣ、EⅤ，其得率與抑制口臭活性比較見表2。

表1 余甘子粗提物與不同溶劑萃取物抑臭活性比較?

? 同列數(shù)據(jù)后的不同字母表示存在顯著差異(P<0.05)。

表2 不同組分抑制口臭活性的比較?

? 同列數(shù)據(jù)后的不同字母表示存在顯著差異(P<0.05)。

由表2經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，觀察傳感器R7(W1W)與R9(W2W)數(shù)據(jù)，各硅膠分離組分均顯著低于對照組，其中組分EⅡ降低程度最大，且與其他4個(gè)分離組分有顯著性差異，表明5個(gè)組分都具備抑制全唾中硫化物生成的活性，且組分EⅡ的活性最強(qiáng)。對于傳感器R6(W1S)，5個(gè)組分與空白對照組有顯著性差異，但5個(gè)組分相互間差異性不明顯，說明5個(gè)組分都有抑制甲基類化合物生成的活性。

5個(gè)組分對全唾臭味指數(shù)的影響見圖2。由圖2可知，組分EⅡ、EⅢ、EⅣ有降低臭味指數(shù)的活性，組分EⅡ活性最強(qiáng)，與其余組分有顯著性差異；組分EⅠ、EⅤ促進(jìn)了臭味指數(shù)升高，其中組分EV尤為明顯，呈現(xiàn)顯著性差異。因此EⅡ組分中活性成分抑制口臭能力最強(qiáng)，可以作為活性跟蹤的組分，需對其做進(jìn)一步分離純化。

不同字母表示存在顯著差異(P<0.05)

2.3 組分EⅡC18反相柱粗分離及活性分析

組分EⅡ(64.68 g)經(jīng)C18反相層析柱分離所得組分得率與抑制口臭活性比較見表3和圖3。由表3可知，4個(gè)反相層析分離組分中EⅡM20的得率最高，達(dá)到80.13%。各洗脫組分與空白對照組相比皆有顯著性差異，但組分間無差異，說明各組分都有抑制口臭的活性，且活性能力相當(dāng)。觀察三個(gè)傳感器信號值，與EⅡ相比，除EⅡM20有所升高或基本持平外，其余洗脫組分EⅡM40、EⅡM60、EⅡM100有一定程度的降低，但與EⅡM20無顯著差異。說明C18反相層析柱的不同乙醇濃度洗脫物，其抑制口臭沒有顯著差異，鑒于其他組分洗脫物的含量少，而20%甲醇水溶液洗脫的得率為80.13%，因此對20%甲醇水溶液洗脫部位EⅡM20做進(jìn)一步的制備分離。

不同字母表示存在顯著差異(P<0.05)

組分得率/%傳感器R7(W1W)R6(W1S)R9(W2W)空白對照/12.867±0.742b11.022±0.444b8.620±0.432bEⅡM1000.932.865±0.161a2.701±0.121a2.601±0.164aEⅡM600.903.006±0.215a3.175±0.231a2.606±0.190aEⅡM409.202.935±0.391a2.802±0.261a2.861±0.284aEⅡM2080.134.052±0.852a3.734±0.672a3.633±1.042aEⅡ/3.835±0.022a3.471±0.101a3.745±0.042a

? 同列數(shù)據(jù)后的不同字母表示存在顯著差異(P<0.05)。

2.4 EⅡM20組分的HPLC分離及純度檢測

EⅡM20組分經(jīng)硅膠反復(fù)正相分離及液相制備分離后得到3個(gè)化合物：L1(6.8 mg)、L2(4.5 mg)、L3(4.9 mg)，通過HPLC 190～800 nm全波長掃描進(jìn)行純度檢測，L1、L3的最大吸收波長在202 nm左右，L2的最大吸收波長在280 nm左右(圖略)，所得化合物純度均在98%以上。

2.5 化合物L(fēng)1、L2、L3結(jié)構(gòu)鑒定

化合物L(fēng)1為無色粒狀晶體，熔點(diǎn) 110 ℃，易溶于水，微溶于甲醇。13C NMR(125 MHz，CD3OD)譜中給出碳信號δ：98.1(C-1)，73.8(C-2)，74.8(C-3)，71.8(C-4)，71.8(C-5)，62.7(C-6)，93.9(C-1’)，72.9(C-2’)，76.2(C-3’)，78.0(C-4’)，78.0(C-5’)，62.8(C-6’)。1H NMR(500 MHz，CD3OD)譜中給出12個(gè)質(zhì)子信號δ：4.87，4.75，4.57，4.33，3.64，3.56，3.46，3.22，3.12。ESI-MS(m/z)正離子檢測：203[Glucose+Na]+，負(fù)離子檢測：161[Glucose -H3O]-，相對分子質(zhì)量為342。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的麥芽糖譜圖數(shù)據(jù)基本一致(由于溶劑不同化學(xué)位移值差異較大)，確定化合物L(fēng)1為麥芽糖(maltose)，見圖4。

化合物L(fēng)2為淺黃色油狀液體，微具氣味，溶于甲醇。13C NMR(150 MHz，CD3OD)譜中給出碳信號δ：163.1(C-1)，133.5(C-2)，132.4(C-3)，132.4(C-4)，132.4(C-5)，132.4(C-6)，133.5(C-7)，163.1(C-8)，64.3(C-1’)，40.1(C-2’)，31.6(C-3’)，30.1(C-4’)，24.9(C-5’)，24.0(C-6’)，14.4(C-7’)，11.4(C-8’)，64.3(C-1’’)，40.1(C-2’’)，31.6(C-3’’)，30.1(C-4’’)，24.9(C-5’’)，24.0(C-6’’)，14.4(C-7’’)，11.4(C-8’’)。1H NMR(600 MHz，CD3OD)譜中給出質(zhì)子信號δ：7.70(m，2H)，7.52(m，2H)，4.26(dd，J1=8.5 Hz，J2=1.6 Hz，2H)，4.19(dd，J1=8.5 Hz，J2=1.6 Hz，2H)，1.69(m，2H)，1.46～1.32(m，16H)，0.95～0.90(dd，J=13.8，6.3 Hz，12H)。ESI-MS(m/z)正離子檢測：391[M+H]+，413[M+Na]+，166[phthalic acid]+，相對分子質(zhì)量為390。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物L(fēng)2為1,2-苯二甲酸-雙-2’甲基庚酯[Bis(2-methylheptyl)phthalate]，見圖5。

圖4 化合物L(fēng)1的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖5 化合物L(fēng)2的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

化合物L(fēng)3為無色晶體，溶解甲醇，13C NMR(150 MHz，CD3OD)譜中給出碳信號δ：73.8(C-1)，64.4(C-2)，147.9(C-1’)，132.4(C-2’)，129.9(C-3’)，113.8(C-4’)，129.9(C-5’)，132.4(C-6’)。1H NMR(600MHz，CD3OD)譜中給出10個(gè)質(zhì)子信號δ：2.02，4.01，4.59，5.01，6.66，7.12。ESI-MS(m/z)負(fù)離子檢測：150[M-H3]-，相對分子質(zhì)量為153。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物L(fēng)3為1-(4’-氨苯基)-1,2異二醇[1-(4’-amino-phenyl)-ethane-1,2-diol]，見圖6。 經(jīng)以上分析，發(fā)現(xiàn)分離鑒定的3個(gè)化合物結(jié)構(gòu)都不是一類物質(zhì)，且均不是新化合物，在其他研究抗氧化活性的植物原料中均有報(bào)到，其中一種為最為普通的多羥基化合物——麥芽糖，另一種為塑化劑類結(jié)構(gòu)類似物，第三種為含苯環(huán)的多羥基化合物。

圖6 化合物L(fēng)3的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

3 結(jié)論

以電子鼻口臭檢測及評價(jià)模型為抑臭活性導(dǎo)向方法，采用有機(jī)溶劑分級萃取、硅膠正相柱分離、C18反相柱分離等方法，從余甘子干果95%乙醇提取物分離得到了抑制口臭活性最強(qiáng)的EⅡM20組分，將該組分進(jìn)行多次正相硅膠柱分離與HPLC制備分離，分離得到了3種化合物，利用1H NMR、13C NMR、HR-ESI-MS等多種波譜結(jié)構(gòu)鑒定了maltose(L1)、1,2-Bis(2-methylheptyl)phthalate (L2)、1-(4’-amino-phenyl)-ethane-1,2-diol(L3)。本研究的抑臭評價(jià)手段對清咽類保健食品或口腔清新類產(chǎn)品的研發(fā)提供一個(gè)評價(jià)的方法。由于未能進(jìn)一步制備純化的化合物再次進(jìn)行除臭活性分析，試驗(yàn)結(jié)果對尋找有價(jià)值的口腔除臭成分還有一定的不足和困難。

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Extraction, separation & identification of bioactive compositions fromPhyllanthusemblicaL. for oral odor inhibity

JIANGYuan-xin1,2LIUBo-ke2LIUXiao-ling2

(1.GuangxiAgriculturalVocationalCollege,Nanning,Guangxi530007,China;2.CollegeofLightIndustryandFoodEngineering,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi530004,China)

Using electronic nose measure and evaluation model as a guidance method for inhibiting halitosis, the strongest bioactive fractions(EⅡM20) were separated from the 95% ethanol emblica extract by organic solvent extraction, repeated normal and reverse phase column chromatography. Consequently, three compounds were isolated from the EⅡM20 by semi-preparative HPLC. Their quantity-quality were 6.8 mg, 4.5 mg, 4.9 mg, repectively. The structures of the three compounds were elucidated by comprehensive spectroscopic methods such as1H NMR,13C NMR, HR-ESI-MS. The spectroscopy analysis indicated that the compounds were maltose, Bis(2-methylheptyl)phthalate and 1-(4’-amino-phenyl)-ethane-1,2-diol.

PhyllanthusemblicaL.; oral odor; purification; structural identification

廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院基金項(xiàng)目(編號：YKJ 1610)

姜元欣(1980-)，男，廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院講師，廣西大學(xué)在讀博士研究生。E-mail: 631553385@qq.com

2016-05-24

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.10.005