包春銘 黃金龍 朱萱萱 劉 寧 陸金春 姚 昶

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210029)

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穴位注射脂肪來源基質(zhì)血管成分抗皮膚老化的作用

包春銘 黃金龍1朱萱萱2劉 寧1陸金春3姚 昶4

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210029)

目的 探討穴位注射脂肪來源基質(zhì)血管成分(SVF)抗皮膚老化的作用。方法 將18個月的老齡大鼠分為模型組、針灸組、SVF注射組和針灸SVF組，將10月大鼠設(shè)為對照組，每組10只。各組的給藥方式分別為對照組皮下注射0.9%氯化鈉注射液；針灸組針刺足三里穴位；SVF注射組：皮下注射0.5 ml SVF細(xì)胞懸液；針灸SVF組針刺足三里穴位0.5 ml SVF細(xì)胞懸液。所有組別連續(xù)給藥22 d。治療結(jié)束檢測背部皮膚顯微特征、皮膚的超氧化歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和羥脯氨酸(HYP)和皮膚標(biāo)本DiI熒光染色吸光度。結(jié)果 SVF細(xì)胞數(shù)量為(1.05±0.7)×106。與對照組比，衰老模型組的表皮和真皮厚度明顯降低(P<0.05)，與衰老模型組比，穴位注射組、SVF注射組和針灸SVF組的表皮和真皮厚度均有不同程度的增加，針灸SVF組的表皮和真皮厚度的增加存在顯著差異(P<0.05)。對照組表皮完整，真皮見少許血管，大量膠原纖維組成致密結(jié)締組織。皮脂腺汗腺及毛囊清晰可見；衰老模型組皮膚尚完整，真皮內(nèi)少許血管，膠原纖維疏松，皮脂腺汗腺和毛囊不完整；穴位注射組、SVF組及針灸SVF組均可見真皮內(nèi)可見細(xì)長的血管向表皮延伸。與對照組比，衰老模型組的MDA明顯增高(P<0.05)，SOD和HYP明顯降低(P<0.05)，與衰老模型組比，穴位注射組、SVF注射組和針灸組的MDA有不同程度的降低，SOD和HYP有不同程度的增高，針灸SVF組的MDA降低與SOD和HYP增高均具有顯著差異(P<0.05)，對照組、衰老模型組和穴位注射組的DiI熒光吸光度較低，SVF注射組和針灸SVF組的DiI熒光吸光度較高(P<0.05)，與SVF注射組比，針灸SVF組的DiI熒光吸光度較高(P<0.05)。結(jié)論 足三里穴位注射SVF具有明顯的抗皮膚老化作用。

穴位注射；脂肪來源基質(zhì)血管成分(SVF)；皮膚老化

皮膚老化(SA)是伴隨人體衰老進(jìn)程的一個外在標(biāo)志，與年齡和日光照射相關(guān)，除了影響外在美觀，如皮膚松弛、色斑增多或膚色灰黃，還與惡性良性腫瘤的發(fā)生有關(guān)〔1,2〕。穴位注射是20世紀(jì)50年代興起的中西醫(yī)結(jié)合療法，屬于針灸范疇，因具有除簡便、廉價和無副作用外，還具有調(diào)和陰陽、疏通經(jīng)絡(luò)和扶正祛邪的特點(diǎn)，因此一直以來在保健駐顏方面占有重要且不可替代的優(yōu)勢〔1〕。自體脂肪組織是理論上最理想的軟組織填充材料來源，脂肪組織中的血管基質(zhì)成分是脂肪經(jīng)消化、過濾祛除成熟的脂肪組織得到且包括如內(nèi)皮前體細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞成分，可誘導(dǎo)分化為脂肪組織、成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，自1893年開始至今脂肪來源基質(zhì)血管成分(SVF)用于治療軟組織缺損已超過一百年〔2〕。本課題擬采用自然老齡大鼠為老化皮膚模型，考察穴位注射SVF是否具有抗SA的作用，并為穴位注射SVF的臨床應(yīng)用提供參考。

1 動物與方法

1.1 受試動物 18月齡SD 雌性大鼠和10月齡SD雌性大鼠，SPF級，體重(450±20)g和(220±20)g，由江蘇省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：SYXK(蘇)2012-0047，自由攝食飲水，12 h人工光照。

1.2 儀器和試劑 6805D電針儀購于汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠有限公司，DS-1勻漿機(jī)購于上海凈信實(shí)驗(yàn)設(shè)備科技部，WFZ-26A紫外分光光度計(jì)購于天津市新天光分析儀器技術(shù)公司，DYS-805倒置顯微鏡購于上海點(diǎn)應(yīng)光學(xué)儀器有限公司，PB300高速離心機(jī)購于張家港市翔宇離心機(jī)制造有限公司，手術(shù)用的醫(yī)療器械。DMEM，購于美國GIBCO公司，DiI應(yīng)用液購于美國Molecular Probe Inc公司，紅細(xì)胞裂解液、猴抗山羊和CD34、CD90山羊源性單克隆抗體異硫氰酸熒光素(FITC)購于美國 Sigma 公司，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國 Corning 公司，硫化鈉和蘇木素-伊紅(HE)試劑均購于市化工試劑廠。

1.3 SVF的制備與鑒定

1.3.1 SVF的制備 在無菌條件下，取SD大鼠，全麻后取腹股溝部脂肪墊，取腹股溝部脂肪墊的大鼠均分至SVF注射組和針灸SVF組，其余組別，全麻后暴露腹股溝即可。將取出的脂肪墊剔除血管和纖維，剪成1 mm3的小塊，按1∶1加入0.1%Ⅰ型膠原酶溶液于37℃恒溫?fù)u床中消化60 min，震蕩混勻3次，加入完全培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗)中和，離心吸除懸浮的上層脂滴、次層乳狀成熟脂肪細(xì)胞，再離心留下底層沉淀，沉淀用紅細(xì)胞裂解液(154 mmol/L NH4Cl+10 mmol/L KHCO3+0.1 mmol/L 乙二胺四乙酸)處理，去除紅細(xì)胞碎片，DMEM重懸沉淀，200目篩網(wǎng)過濾，得到SVF細(xì)胞懸液。將SVF細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)L-多聚賴氨酸預(yù)包被的蓋玻片上，37℃預(yù)熱的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗5 min×3次。加入0.1%triton溶液，室溫作用30 min，PBS洗滌5 min。4%胎牛血清(BSA)于37℃封閉20 min，甩干，分別加入CD34、CD90山羊源性單克隆抗體(CD34檢測內(nèi)皮細(xì)胞，CD90檢測干細(xì)胞)，設(shè)置 PBS 陰性對照，置4℃冰箱孵育過夜。PBS 沖洗5 min×3 次，加入猴抗山羊FITC二抗，37℃作用45 min，PBS 液漂洗5 min×3 次。

1.3.2 SVF活力檢測 取SVFs懸液置入試管中，加入等量0.4%臺盼藍(lán)染液，混勻，染色2 min，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，倒置顯微鏡下見深藍(lán)色細(xì)胞為死細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，計(jì)算細(xì)胞成活率。見圖1。

圖1 顯微鏡SVF細(xì)胞(×100)

1.3.3 計(jì)數(shù) 將SVFs懸液滴至計(jì)數(shù)板，采用血球計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，壓線細(xì)胞只記左側(cè)和上方細(xì)胞。

1.3.4 標(biāo)記 移植前取新鮮分離的SVF沉淀加入無血清的DMEM制成細(xì)胞懸液，每1×106細(xì)胞加入5 μl DiI應(yīng)用液于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育25 min，PBS清洗離心2次，再以PBS重懸，制成DiI標(biāo)記的SVF細(xì)胞懸液備用。

1.4 分組及給藥 18個月大鼠即為老年大鼠。將老年大鼠分為，模型組、針灸組、SVF注射組和針灸SVF組，將10月齡大鼠設(shè)為對照組，每組10只。各組的給藥方式分別為對照組皮下注射0.9%氯化鈉注射液；針灸組針刺足三里穴位；SVF注射組：皮下注射0.5 ml SVF細(xì)胞懸液；針灸SVF組針刺足三里穴位0.5 ml SVF細(xì)胞懸液。針刺足三里穴位：定位取穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》，即膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下，用1 cm的毫針在大鼠雙側(cè)“足三里”進(jìn)針5～7 mm，留針行針約5 min。所有組別連續(xù)給藥22 d。

1.5 方法及指標(biāo)

1.5.1 背部皮膚顯微特征 治療結(jié)束第2天，8%硫化鈉頸背部皮膚脫毛，脫椎處死，立即取背部正中皮膚約1.0 cm×1.0 cm方形，剔除脂肪組織，置于中性甲醛溶液中固定，采用HE染色，測量真皮和表皮厚度，記錄皮膚顯微。

1.5.2 皮膚的超氧化歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和羥脯氨酸(HYP)檢測 取頸背部皮膚組織，除去皮下脂肪和結(jié)締組織，剪刀剪碎并研缽成皮膚勻漿。采用考馬斯亮藍(lán)法檢測勻漿中SOD、MDA和HYP水平。

1.5.3 皮膚標(biāo)本熒光染色 切取各組0.5 cm×0.5 cm大小的老化皮膚組織，30%蔗糖溶液脫水，OCT試劑包埋樣本組織制成10 μm的冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察DiI熒光顯色情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析或χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同組別的皮膚顯微比較 SVF細(xì)胞數(shù)量為(1.05±0.7)×106。與對照組比，衰老模型組的表皮和真皮厚度明顯降低(P<0.05)，與衰老模型組比，穴位注射組、SVF注射組和針灸SVF組的表皮和真皮厚度均有不同程度的增加，針灸SVF組的表皮和真皮厚度的增加存在顯著差異(P<0.05)。對照組表皮完整，真皮見少許血管，大量膠原纖維組成致密結(jié)締組織。皮脂腺汗腺及毛囊清晰可見；衰老模型組皮膚尚完整，真皮內(nèi)少許血管，膠原纖維疏松，皮脂腺汗腺和毛囊不完整；穴位注射組皮膚完整，真皮內(nèi)可見少許細(xì)長血管向表皮延伸，大量膠原纖維組成致密結(jié)締組織。皮脂腺汗腺及毛囊清晰可見；SVF注射組可見表皮完整，真皮內(nèi)可見少許細(xì)長血管向表皮延伸，大量膠原纖維組成致密結(jié)締組織。皮脂腺汗腺及毛囊清晰可見；針灸SVF組可見表皮完整，真皮內(nèi)可見細(xì)長的血管向表皮延伸，大量膠原纖維組成致密結(jié)締組織。皮脂腺汗腺及毛囊清晰可見。見表1，圖2。

表1 不同組別的皮膚厚度比較

與對照組比較：1)P<0.05，與衰老模型組比較：2)P<0.05，與穴位注射組比較：3)P<0.05，與SVF注射組比較：4)P<0.05；下表同

2.2 不同組別的皮膚SOD、MDA、HYP和DiI熒光吸光度水平比較 與對照組比，衰老模型組的MDA明顯增高(P<0.05)，SOD和HYP明顯降低(P<0.05)，與衰老模型組比，穴位注射組、SVF注射組和針灸SVF組的MDA不同程度降低，SOD和HYP有不同程度的增高，針灸SVF組的MDA降低與SOD和HYP增高均具有顯著差異(P<0.05)，對照組、衰老模型組和穴位注射組的DiI熒光吸光度較低，SVF注射組和針灸SVF組的DiI熒光吸光度較高(P<0.05)，與SVF注射組比，針灸SVF組的DiI熒光吸光度較高(P<0.05)。見表2，圖3。

圖2 不同組別的皮膚顯微比較(×100)

組別SOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)HYP(U/mgprot)Dil熒光吸光度對照組265.3±52.676.5±19.5275.4±24.50.2±0.1衰老模型組169.8±46.71)152.4±26.91)245.6±24.11)0.2±0.1穴位注射組211.6±51.4106.5±14.82)306.8±26.42)0.1±0.1SVF注射組234.6±42.62)103.9±1.572)309.4±27.72)0.5±0.22)3)針灸SVF組256.4±43.32)3)4)82.4±16.82)3)4)375.4±21.42)3)4)0.8±0.32)3)4)F/P值6.5/<0.0524.1/<0.0528.1/<0.0525.9/<0.05

圖3 不同組別的皮膚DiI熒光吸光度比較

3 討 論

中醫(yī)認(rèn)為，脾經(jīng)、胃經(jīng)、任脈和督脈是臨床最常用的經(jīng)脈，其中胃經(jīng)足三里是保健穴中應(yīng)用比較多的穴位，大量研究顯示足三里穴是延緩衰老臨床治療的主要穴位。

人體的氣血生化之源是脾胃，脾胃也被稱為“后天之本”，人的一切生命活動和生長發(fā)育都有賴于脾胃之運(yùn)化，胃經(jīng)善調(diào)氣血，可雙向調(diào)節(jié)脾胃，平衡整體的氣血陰陽，胃經(jīng)的本質(zhì)是抗衰老的重要經(jīng)脈，足三里是胃經(jīng)的重要穴位之一，也是抗衰老的常用穴位?！鹅`柩》有云“陰陽俱有余，若皆不足，則有寒有熱，皆調(diào)于三里”?！夺t(yī)說》有云，“若要安，三里莫要干”?！锻馀_秘要》有云“三里養(yǎng)先后天之氣，灸三里可使元?dú)獠凰?，故稱長壽之灸”。《通玄指要賦》有云“三里卻五勞之羸瘦”，以上均證明了針灸足三里的保健抗衰老的作用〔3～6〕。自由基衰老學(xué)說逐漸成為衰老理論中的核心理論：紫外線照射使皮膚組織內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基(·O2-、H2O2和·OH-等)，使組織抗氧化防御體系能力減弱，侵害細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，形成過氧化脂質(zhì)，脂質(zhì)過氧化物的降解產(chǎn)物MDA與氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)和磷脂等和游離氨基反應(yīng)形成脂自由基，它廣泛地參與機(jī)體的生理與病理過程。諸多研究也顯示給老年大鼠針刺足三里保健抗衰老和抗皮膚老化的機(jī)理在于抗氧化和清除自由基：如李映霞等對老化模型采用針刺足三里，結(jié)果顯示針刺足三里對無毛小鼠皮膚光老化具有顯著的保護(hù)作用，與足三里具有清除MDA，提高SOD和HYP活力達(dá)到抗氧化目的有關(guān)〔7～9〕。本課題結(jié)果也顯示，針刺足三里可以降低衰老大鼠皮膚的MDA水平，提高HYP含量，增強(qiáng)SOD活力，與文獻(xiàn)結(jié)果相似。

SVF是脂肪組織經(jīng)過膠原酶的消化得到的多種細(xì)胞的復(fù)合體，該復(fù)合體含有脂肪干細(xì)胞，脂肪干細(xì)胞具有多向分化的能力，如分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或骨細(xì)胞，其中分化的內(nèi)皮細(xì)胞具有促進(jìn)血管生成，改善血管功能；復(fù)合體還可分泌多種生長因子和細(xì)胞因子，這些因子有助于促進(jìn)血管形成與組織修復(fù)〔10～12〕。本課題結(jié)果顯示，與對照組比，皮下注射SVF 和“足三里”注射SVF均有助于增加衰老皮膚的真皮和表皮厚度，改善衰老皮膚的血管和結(jié)構(gòu)，使皮膚年輕化，且DiI熒光吸光值也顯示了上述改善作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是SVF。綜上所述，足三里注射SVF具有明顯的抗SA作用，與針刺足三里穴位清除氧自由基、提高SOD活力、促進(jìn)膠原蛋白生成、SVF促進(jìn)衰老皮膚血管生成、改善血管功能有關(guān)，但針刺足三里具有促進(jìn)衰老皮膚血管生成的作用效果不及SVF皮下注射，其中原因仍不明確。

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〔2016-02-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

國家自然科學(xué)基金(No.81373646)；江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目Ⅱ期(012062003010)

姚 昶(1967-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事創(chuàng)傷修復(fù)研究。

包春銘(1981-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事脂肪干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化研究。

R75

A

1005-9202(2016)21-5224-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.004

1 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院整形外科

2 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心

3 武警江蘇總隊(duì)南京醫(yī)院檢驗(yàn)科

4 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科