王 虎 白 楊 單 臣

(吉林省人民醫(yī)院，吉林 長春 130021)

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抑肽酶對跟腱斷裂白兔模型跟腱修復(fù)中轉(zhuǎn)化生長因子-β2表達的影響

王 虎 白 楊 單 臣

(吉林省人民醫(yī)院，吉林 長春 130021)

目的 觀察抑肽酶對白兔跟腱斷裂修復(fù)的影響。方法 選用60只新西蘭白兔，隨機分為三組(正常對照組、模型損傷組、抑肽酶治療組)，于造模后第3天及第1、2、3、4周采集標本，RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)化生長因子-β2(TGF-β2) mRNA表達，免疫組化染色觀察TGF-β2蛋白表達。結(jié)果 抑肽酶組在3 d TGF-β2 mRNA表達明顯高于模型組(P<0.05)，在1 w后，抑肽酶組TGF-β2 mRNA表達低于模型組，但無統(tǒng)計學(xué)意義。在第2～3周時，抑肽酶組中表達量明顯低于模型組(P<0.05)。TGF-β2蛋白在正常白兔跟腱有少量表達，術(shù)后第3天時抑肽酶治療組表達量高于模型組，第1周抑肽酶組中表達量明接近模型。2～4 w時抑肽酶組中表達量明顯減少且低于模型組。結(jié)論 抑肽酶可減輕炎癥反應(yīng)，早期可通過調(diào)控TGF-β2的表達量，促進跟腱斷裂的修復(fù)。

抑肽酶；跟腱斷裂；轉(zhuǎn)化生長因子-β2

跟腱斷裂在臨床骨科治療過程中主要以石膏固定及手術(shù)治療為主，但均不能取得滿意的臨床效果，可能會再次出現(xiàn)跟腱斷裂〔1，2〕。抑肽酶是非特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑，通過抑制激肽釋放酶以及纖溶酶而達到止血的目的，廣泛用于體外循環(huán)的心血管手術(shù)和多種疾病的治療〔3〕。目前抑肽酶在骨科應(yīng)用的報道較少。本研究擬觀察抑肽酶對跟腱斷裂的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物 新西蘭白兔，雌雄兼用，體重(2.8±0.2)kg。吉林大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 跟腱斷裂白兔模型的建立 白兔適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后進行造模。造模前12 h開始禁食、不禁水，直至實驗結(jié)束。將白兔固定于手術(shù)臺上，實施跟腱局部麻醉后，用手術(shù)刀切斷跟腱內(nèi)側(cè)1/2組織，使中央部分成“V”字缺損。跟腱周圍被膜絲線連續(xù)縫合，絲線間斷縫合皮膚。術(shù)后無菌紗布包扎傷口，并扎緊，防止脫落。每只兔肌肉注射青霉素(1次/d，40萬U/次)，連續(xù)3 d。傷口不給予更換紗布，不給予夾板固定，給予籠外放養(yǎng)，自由活動。所有動物外科手術(shù)操作由同一實驗人員完成。

1.2.2 動物分組及給藥 取60只新西蘭白兔，隨機分為三組：正常對照組(不做任何處理)，抑肽酶組(制備模型縫合鍵周膜后，損傷部位周圍注射抑肽酶10 000 kIU/ml，縫合皮膚)，模型組，在損傷部位注射等容量生理鹽水。

1.2.3 RT-PCR方法檢測TGF-β2 mRNA表達 于造模后第3天及第1、2、3、4周每組白兔耳緣靜脈注射空氣 20 ml處死動物，取下造模側(cè)的跟腱組織后，稱取組織研磨裂解進行總RNA提取，利用核酸定量儀檢測樣品濃度。采用RT-PCR法檢測TGF-β2基因的表達。TGF-β2(191 bp)正義鏈：5′ccggaggtgatctccatcta3′；反義鏈：5′actgagccagagggtgttgt3′。βactin(350 bp)正義鏈：5′aggccaaccgcgagaagaI，gacc3′；反義鏈：5′aggccaaccgcgagaagatgacc3′設(shè)置條件：變性94℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃30 s。配置1.5%的瓊脂糖凝膠，吸取5 μl PCR產(chǎn)物點樣，120 U，30 min電泳。利用凝膠成像儀觀察結(jié)果并采集圖片，使用Quantity One對圖片進行灰度掃描分析。

1.2.4 免疫組化染色觀察TGF-β2蛋白表達 于造模后第3天及第1、2、3、4周每組白兔耳緣靜脈注射空氣 20 ml處死動物，取下造模側(cè)的跟腱組織后，將跟腱用10%福爾馬林固定，經(jīng)石蠟包埋后，縱切厚4 μm標本，進行免疫組織化學(xué)檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS14.0 軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

全部實驗動物皮膚切口在術(shù)后1 w內(nèi)基本愈合，未發(fā)生傷口感染情況。

2.1 RT-PCR方法檢測TGF-β2 mRNA表達 圖1，圖2可見，抑肽酶組在3 d TGF-β2 mRNA表達明顯高于模型組(P<0.05)，在1 w后，抑肽酶組TGF-β2 mRNA表達低于模型組，但無統(tǒng)計學(xué)意義。在第2～3周時，抑肽酶組中表達量明顯低于模型組(P<0.05)。第4周時兩組的TGF-β2的表達量接近于正常組。

1.正常組;2.模型組;3.抑肽酶組，下圖同圖1 白兔跟腱組織中TGF-2 mRNA表達

2.2 TGF-β2在抑肽酶對白兔跟腱斷裂模型跟腱修復(fù)中的表達 TGF-β2蛋白在正常白兔跟腱有少量表達，術(shù)后第3天時抑肽酶治療組表達量高于模型組，第1周抑肽酶組中表達量明接近模型。2～4 w時抑肽酶組中表達量明顯減少且低于模型組。見圖3。

圖2 白兔跟腱組織中β-actin mRNA表達

圖3 TGF-β2在白兔跟腱組織中的免疫組化表達(DAB,×200)

3 討 論

跟腱斷裂早期修復(fù)過程中常常形成粘連導(dǎo)致肌腱愈合不佳。資料報道，產(chǎn)生粘連的主要原因是由于損傷早期，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，在炎性細胞的作用下，成纖維細胞過量增殖，在損傷周圍出現(xiàn)大量膠原纖維〔1〕。TGF-β 是一個多功能的多肽家族，在調(diào)節(jié)細胞的增殖與分化、細胞外基質(zhì)的形成、細胞的移動、黏附、機體的生長發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)等方面均有著非常重要的作用〔2，3〕。TGF-β促進組織修復(fù)的保護性因子，對軟骨細胞生長及細胞外基質(zhì)合成具有重要的調(diào)節(jié)作用〔4〕。TGF-β2又被稱為軟骨因子β，它可以促進骨膜間充質(zhì)細胞的增殖，使其分化為軟骨細胞，還可以促進細胞外基質(zhì)如膠原、透明質(zhì)酸酶和蛋白聚糖的合成〔5〕。TGF-β作用于肌腱愈合的所有階段，能刺激外源性細胞遷移、調(diào)節(jié)蛋白酶、纖維素連接作用和刺激膠原產(chǎn)生〔6〕。TGF-β2可在體外促進肌腱細胞膠原的生成〔7〕。Decker等〔8〕對損傷修復(fù)后的馬屈肌腱中的TGF-β的內(nèi)源性表達情況進行研究，發(fā)現(xiàn)TGF-β2作為表達水平最高的生長因子，在修復(fù)第5天出現(xiàn)高峰，在本實驗中可見，TGF-β2蛋白在正常白兔跟腱有少量表達，術(shù)后第3天時抑肽酶治療組表達量高于模型組，第1周抑肽酶組中表達量明接近模型。2～4 w時抑肽酶組中表達量明顯減少且低于模型組。TGF-β2蛋白在正常白兔跟腱有少量表達，術(shù)后第3天時抑肽酶治療組表達量高于模型組，第1周抑肽酶組中表達量明接近模型。2～4 w時抑肽酶組中表達量明顯減少且低于模型組。這種現(xiàn)象說明抑肽酶可以通過改變TGF-β2的提前表達加速跟腱組織的愈合，而在后期TGF-β2表達下降，是否抑肽酶此時通過抑制跟腱的外源性愈合機制而主要是依靠腱細胞自身的分化增殖的內(nèi)源性愈合機制促進跟腱的愈合，還是抑肽酶通過調(diào)控其他細胞因子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等促進跟腱后期的愈合值得進一步研究。

1 Khanna A，F(xiàn)riel M，Gougoulias N，etal.Prevention of adhesions in surgery of the flexor tendons of the hand：what is the evidence〔J〕.Br Med Bull，2009；90(1)：85-109.

2 Heino J，Ignotz RA，Hemler ME，etal.Regulation of cell adhesion receptors by transforming growth factor-beta.Concomitant regulation of integrins that share a common beta 1 subunit〔J〕.J Biol Chem，1989；264(4)：380-9.

3 Ignotz RA，Massague J.Transforming growth factor-beta stimulates the expression of fibronectin and collagen and their incorporation into the extracellular matrix〔J〕.J Biol Chem，1986；261(9)：4337-45.

4 Livne E，Laufer D，Blumenfeld I.Osteoarthritis in the temparomandbular joint (TMJ) of aged mice and the in vitro effect of TGF-beta 1 on cell proliferation matrix synthesis,an alkaline phosphatase activity〔J〕.Microsc Res Tech，1997；37(4)：314-23.

5 Van Osch GJ，Van der Veen SW，Burger EH，etal.Chondrogenic potential of in vitro multiplied rabbit perichondrium cells cultured in alginate beads in defined medium〔J〕.Tissue Eng，2000；6(4)：321-30.

6 Kibe Y，Takenaka H，Kishimoto S.Spatial and temporal expression of basic fibroblast growth factor protein during wound healing of rat skin〔J〕.Br J Dermatol，2000；143(4)：720-7.

7 Kein MB，Yalamanchi N，Pham H.Flexor tendon healing in vitro：effects of TGF-beta on tendon cell collagen production〔J〕.J Hand Surg Am，2002；27(4)：615-20.

8 Decker R，Ibertsson-wikland K，Kristrom B，etal.Metabolic outcome of GH treatment in prepubertal short children with and without classical GH deficiency〔J〕.Clin Endocrinol (Oxf)，2010；73(3)：346-56.

〔2015-12-09修回〕

(編輯 袁左鳴)

吉林省自然科學(xué)基金項目(No.201215199)

單 臣(1968-)，男，主任醫(yī)師，主要從事周圍神經(jīng)及軟組織損傷的研究。

王 虎(1972-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事足踝疾病診治及四肢軟組織損傷修復(fù)治療研究。

R39

A

1005-9202(2016)21-5236-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.009