尤 晴, 李小宇, 張春雨, 張淋淋, 宋景榮, 王永志*, 李啟云*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 長春 130118; 2. 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 農(nóng)業(yè)部東北作物有害生物綜合治理重點實驗室, 吉林省農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室, 公主嶺 136100; 3. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué),哈爾濱 150030; 4. 呼倫貝爾市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 扎蘭屯 162652)

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馬鈴薯Y病毒屬三種病毒通用型單克隆抗體的鑒定

尤 晴1,2, 李小宇2, 張春雨2, 張淋淋3, 宋景榮4, 王永志2*, 李啟云2*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 長春 130118; 2. 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 農(nóng)業(yè)部東北作物有害生物綜合治理重點實驗室, 吉林省農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室, 公主嶺 136100; 3. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué),哈爾濱 150030; 4. 呼倫貝爾市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 扎蘭屯 162652)

構(gòu)建了馬鈴薯Y病毒屬的大豆花葉病毒(Soybeanmosaicvirus, SMV)、馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY, PVY)、三葉草黃脈病毒(Cloveryellowveinvirus, CLYVV)的原核表達(dá)載體pET28-SMV CP、pET28-PVY CP和pET28-CLYVV CP,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、表達(dá)和純化,獲得SMV、PVY和CLYVV的CP蛋白。采用ELISA方法,用9株實驗室制備的單克隆抗體對含SMV、PVY、CLYVV的病毒汁液和純化的重組CP蛋白進(jìn)行檢測分析。結(jié)果表明,9株單克隆抗體均識別SMV病毒,2D3、4F9、4G12和6E7單克隆抗體能夠識別PVY病毒,4F9和4G12能夠識別 CLYVV病毒,但PVY、CLYVV病毒與抗體的親和力低于SMV病毒;對于重組表達(dá)的衣殼蛋白:SMV、CLYVV與抗體2D3、4F9、4G12和6E7反應(yīng)強(qiáng)烈,PVY與4F9和4G12抗體反應(yīng)稍強(qiáng)。綜上,本研究鑒定出能識別SMV、PVY、CLYVV的通用單克隆抗體4F9和4G12。

大豆花葉病毒; 馬鈴薯Y病毒; 三葉草黃脈病毒; CP蛋白; 抗體鑒定

馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)是植物病毒中最大的屬,包括 111 個確定種和 86 個暫定種[1],占已知植物病毒的30%。該屬病毒引起的病毒病對糧食作物、園藝觀賞植物、經(jīng)濟(jì)作物、牧草、藥材、果樹等造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。Potyvirus寄主范圍最廣,可侵染豆科、茄科、菊科、莧科和藜科植物,是大豆、馬鈴薯、煙草、番茄、玉米等重要農(nóng)作物的主要病害。病毒粒子呈彎曲的線狀,長約 700～750 nm,其基因組為大約10 000個核苷酸組成的單鏈正義RNA分子。基因組只含有一個開放閱讀框,其兩端含有非編碼區(qū)(untranslated region,UTR)。開放閱讀框編碼一個大的多聚蛋白,多聚蛋白在翻譯后自我分解為VPg(virus-encoded genome linked protein)、P1、HC-Pro(aphid transmission helper component-protease)、P3、CI(cylindrical inclusion protein)、6K1、6K2、NIa(nuclear inclusion protein a)、NIb(nuclear inclusion protein b)、CP(coat protein)等蛋白質(zhì)[3-4]。大多數(shù)Potyvirus成員由蚜蟲以非持久性方式傳播。蚜蟲傳播病毒需要病毒編碼的兩種蛋白,一種是衣殼蛋白(CP),另一種是輔助成分-蛋白酶(HC-Pro)[5-6]。1982年Doem等[7]首次成功研制出煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus, TMV)的單克隆抗體以來,因其具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點,在多種植物病毒上得到廣泛應(yīng)用。美國Hill等[8]曾研制出兩株對SMV有不同抗原決定簇特異性的單克隆抗體;為建立我國的SMV雜交瘤細(xì)胞株,國內(nèi)郭景榮等[9]早在1990年獲得3株分泌抗SMV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,且與同屬的豇豆蚜傳花葉病毒(Cowpeaaphid-bornemosaicvirus,CAMV)和西瓜花葉病毒-2(Watermelonmosaicvirus-2,WMV-2)以及不同屬的TMV均無交叉反應(yīng);王永志等[10]等制備了9株SMV衣殼蛋白的單克隆抗體。同樣國內(nèi)外已篩選并建立了分泌抗PVY的中和抗體[11-14]。Potyvirus成員復(fù)雜,且株系分化大、變異頻繁,了解各種之間親緣關(guān)系、是否存在相同的抗原表位、分析抗原特異性,對單克隆抗體的制備及今后病毒檢測提供了依據(jù)。因此,研究PVY、SMV、CLYVV CP蛋白之間抗原表位的關(guān)系及其分子變異情況,將有助于了解病毒病的流行和演化趨勢,為今后快速檢測和抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究采用的SMV(寄主為大豆)是本實驗室保存的東北大豆花葉病毒3號株系,PVY(寄主為馬鈴薯)采自內(nèi)蒙古扎蘭屯,CLYVV(寄主為蠶豆)為本實驗室保存毒株,其CP基因已通過前期試驗獲得。9株抗SMV的單克隆抗體1C2、2A8、2C1、2D3、3B8、4F9、4G12、5D2和6E7[10]由實驗室制備和保存。

La-TaqDNA聚合酶、1st strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒和限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物公司,SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程股份有限公司,T4 DNA連接酶購自Thermo公司,Ni2+離子親和層析柱購自美國GE公司,HRP標(biāo)記的鼠源抗體購自Sigma公司。

1.2 PVY、SMV和CLYVV衣殼蛋白基因的克隆

根據(jù)GenBank中登錄的PVY、SMV、CLYVV的基因序列設(shè)計了擴(kuò)增CP基因的特異性引物,上游引物的下畫線處為NcoⅠ酶切位點,下游引物的下畫線處為BamHⅠ酶切位點。上游引物分別為PVY-F:5′-AATAATAATCCATgggAAATgACACAATCgATgCAg-3′、SMV-F:5′-AATAATAAT-CCATgggCAAggAgAAggAAggAgAC-3′、CLYVV-F: 5′-AATAATAATCCATggACAAAgAgAAgTTgA-ATgTTg-3′;下游引物分別為PVY-R:5′-AATAATAATggATCCATgTTCTTCACTCCAAgTAgAg-3′、SMV-R:5′-AATAATAATggATCCTgCTgTgggCCCATgCC-3′、CLYVV-R:5′-AATAATAAT-ggATCCAATCgTgCTCCAgCAATgTg-3′。

以TRIzol法抽提感染病毒的樣品葉片總RNA,用1st strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA體外第一條鏈,以此為模板用La-TaqDNA 聚合酶擴(kuò)增CP基因。反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性1 min;98℃變性10 s,53℃退火45 s,72℃延伸1.5 min,進(jìn)行30個循環(huán);72℃再延伸10 min,反應(yīng)完成后4℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下切膠,按SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物,-20℃保存?zhèn)溆?。回收后的PCR產(chǎn)物,與pMD18-T 載體16℃作用連接1 h,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建重組載體pMD-PVY CP、pMD-SMV CP、pMD-CLYVV CP。

1.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

利用NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切重組pMD-PVY CP、pMD-SMV CP、pMD-CLYVV CP和原核表達(dá)載體pET-28a(+),凝膠純化回收目的片段,將PVY CP、SMV CP、CLYVV CP基因與pET-28a(+)連接,構(gòu)建重組載體pET28a-PVY CP、pET28a-SMV CP、pET28a-CLYVV CP,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)雙酶切和PCR鑒定鑒定后,送往測序公司進(jìn)行測序。

1.4 重組蛋白的表達(dá)與鑒定

重組pET28a-PVY CP、pET28a-SMV CP、pET28a-CLYVV CP轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta Ⅱ,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE電泳分析,考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后觀察表達(dá)產(chǎn)物[15]。

1.5 重組蛋白的純化

將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液于4℃ 10 000 r/min 離心10 min,收集菌體。超聲波400 W,3 s工作時間,3 s間隔時間,重復(fù)5 min破碎菌體后收集包涵體表達(dá)的重組PVY CP、SMV CP、CLYVV CP,重組蛋白的純化參照文獻(xiàn)[10],包涵體蛋白經(jīng)高濃度變形劑充分溶解,利用鎳離子親和層析柱純化,SDS-PAGE電泳分析純化結(jié)果,考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后觀察純化產(chǎn)物。

1.6 PVY、SMV、CLYVV的抗體特異性鑒定

通過實驗室制備的9株單克隆抗體,分別對感染SMV、PVY、CLYVV的病毒葉片制備的病毒汁液以及純化后的CP蛋白進(jìn)行ELISA鑒定。ELISA鑒定參照文獻(xiàn)[16],并采用優(yōu)化的最佳參數(shù):包被原按照每孔2 μL/mL濃度包被96孔板,4℃過夜,PBST洗脫3遍;5%脫脂奶300 μL/孔37℃封閉1 h,PBST洗脫3遍;一抗1 000倍稀釋于封閉液中,100 μL/孔37℃作用1 h,PBST洗脫3遍;酶標(biāo)抗體5 000倍稀釋于封閉液中,100 μL/孔37℃作用1 h,PBST洗脫6遍,拍干;室溫避光條件下單組分TMB顯色液顯色30 min后,2 mol/L H2SO450 μL/孔終止反應(yīng),酶標(biāo)儀測定A490。記錄反應(yīng)結(jié)果,用P/N值即檢測A490值與陰性A490值對比,根據(jù)數(shù)值大小以-、+、++、+++分級記載,+以上均為陽性反應(yīng)[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PVY CP、SMV CP、CLYVV CP基因的克隆

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果表明,在900 bp左右有1條特異性條帶,與PVY CP、SMV CP、CLYVV CP基因大小(900 bp)相吻合,回收后連入pMD-18T載體中,經(jīng)雙酶切鑒定,產(chǎn)生大小約為2 700 bp和900 bp兩條帶。測序結(jié)果表明所克隆基因為PVY CP、SMV CP、CLYVV CP基因。

2.2 衣殼蛋白的表達(dá)與純化

PVY CP、SMV CP、CLYVV CP基因與pET-28a(+)連接,構(gòu)建重組pET28a-PVY CP、pET28a-SMV CP、pET28a-CLYVV CP,經(jīng)雙酶切鑒定產(chǎn)生大小約為5 300 bp和900 bp兩條帶,經(jīng)PCR鑒定產(chǎn)生900 bp一條帶,表明所表達(dá)基因為PVY CP、SMV CP、CLYVV CP基因。 轉(zhuǎn)化pET28a-PVY CP、pET28a-SMV CP、pET28a-CLYVV CP的RosettaII菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn),在相對分子量33 kDa處,沉淀中有1條特異性條帶(圖1)。 以融合的包涵體形式表達(dá)的PVY CP、SMV CP、CLYVV CP重組蛋白經(jīng)鎳離子親和層析純化(圖1),得到清晰的單一條帶,分子量大小與PVY CP、SMV CP、CLYVV CP重組蛋白相符,說明經(jīng)過純化后獲得了高純度的PVY CP、SMV CP、CLYVV CP重組蛋白。

圖1 馬鈴薯Y病毒、大豆花葉病毒、三葉草黃脈病毒衣殼蛋白的誘導(dǎo)及純化Fig.1 Induction and purification of PVY, SMV and CLYVV coat proteins

2.3 PVY、SMV、CLYVV的抗體鑒定

將3種病毒葉片粗研磨上清和純化后的CP蛋白分別與9株SMV單克隆抗體進(jìn)行ELISA分析,3次重復(fù),如表1顯示,對于含PVY、SMV和CLYVV的葉片粗研磨上清液,SMV結(jié)合抗體的能力高于PVY和CLYVV,其與9株單克隆抗體均可反應(yīng); PVY能與抗體2D3、4F9、4G12和6E7結(jié)合,但是親和力不如SMV;CLYVV與4F9和4G12反應(yīng)較強(qiáng);對于已純化的衣殼蛋白:SMV、CLYVV與抗體2D3、4F9、4G12和6E7反應(yīng)強(qiáng)烈,PVY能與抗體4F9和4G12反應(yīng)。抗體4F9和4G12(表1加粗所示)能特異性識別所有這3株病毒和重組衣殼蛋白。

表1 病毒汁液、重組表達(dá)CP蛋白分別對9株單克隆抗體的ELISA分析1)

1) PVY:馬鈴薯Y病毒扎蘭屯分離株;SMV:大豆花葉病毒東北3號株系;CLYVV:白三葉黃脈病毒;PVY CP:重組表達(dá)的馬鈴薯Y病毒衣殼蛋白;SMV CP:重組表達(dá)的大豆花葉病毒衣殼蛋白;CLYVV CP: 重組表達(dá)的白三葉黃脈病毒衣殼蛋白。-: P/N<2.1; +: 2.1≤P/N<5;++: 5≤P/N<10;+++: P/N≥10。

PVY:PotatovirusYZalantun strain; SMV:SoybeanmosaicvirusNortheast No.3 strain; CLYVV:Cloveryellowveinvirusstrain; PVY CP: Recombinant expressedPotatovirusYcoat protein; SMV CP: Recombinant expressedSoybeanmosaicviruscoat protein; CLYVV CP: Recombinant expressedCloveryellowveinviruscoat protein. -: P/N<2.1; +: 2.1≤P/N<5;++: 5≤P/N<10;+++: P/N≥10.

3 討論

馬鈴薯Y病毒屬的整個基因組編碼一個多聚蛋白,通過自身蛋白酶切割后形成至少10個功能不同的成熟蛋白,其中衣殼蛋白是結(jié)構(gòu)蛋白。完整病毒粒子的衣殼蛋白質(zhì)有四級結(jié)構(gòu)。病毒的CP起著保護(hù)核酸的作用,并決定著病毒的不同形態(tài)。CP在病毒的侵染過程中對寄主細(xì)胞還具有識別作用。病毒CP還含有抗原決定簇,決定著病毒的抗原特異性。

有利用相同單克隆抗體鑒別PVY不同血清型的研究[18-19]。本研究采用ELISA方法,用實驗室制備的9株抗SMV蛋白的單克隆抗體對馬鈴薯Y病毒屬的PVY、SMV和CLYVV進(jìn)行檢測。結(jié)果證明,這9株抗體都能不同程度地與同屬不同種的病毒抗原結(jié)合,其中一些抗體可識別所有測試毒株,說明PVY、SMV、CLYVV衣殼蛋白有抗原的交叉性,即存在共同的抗原表位,且該抗原表位在馬鈴薯Y病毒屬3種病毒中是高度保守的;進(jìn)一步對抗原表位的定位研究將有助于對馬鈴薯Y病毒屬衣殼蛋白結(jié)構(gòu)和功能的理解。

同種病毒的兩種抗原狀態(tài),即天然病毒分子和重組表達(dá)的衣殼蛋白針對同一株抗體反應(yīng)有差別,感病葉片組織的研磨上清為天然構(gòu)象分子,但在大腸桿菌中表達(dá)的衣殼蛋白缺少真核生物的蛋白折疊,與病毒蛋白結(jié)構(gòu)不一致,這導(dǎo)致了同一抗體與同一病毒衣殼蛋白的不同結(jié)構(gòu)形式的親和力不一致。

前期研究表明,9株抗體與大豆花葉病毒結(jié)合后能阻斷病毒侵染大豆植株,即具有中和活性,屬于中和抗體,病毒編碼基因可以作為抗病基因進(jìn)行抗病育種,即利用植物抗體技術(shù)進(jìn)行抗病分子育種。本研究表明,4F9和4G12這兩株單克隆抗體能夠識別馬鈴薯Y病毒屬的多個成員,因此,該抗體的應(yīng)用范圍更廣,該抗體所識別的抗原表位具有保守性,可作為抗病研究的理想靶點。

本研究鑒定的馬鈴薯Y病毒屬通用型單克隆抗體，為病毒檢測方法研究、致病機(jī)理研究和抗病研究提供了基礎(chǔ)材料。

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(責(zé)任編輯:田 喆)

Identification of universal monoclonal antibodies against three viruses ofPotyvirus

You Qing1,2, Li Xiaoyu2, Zhang Chunyu2, Zhang Linlin3, Song Jingrong4, Wang Yongzhi2, Li Qiyun2

(1. Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Institute of Plant Protection, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northeast, Ministry of Agriculture;Jilin Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Gongzhuling 136100, China; 3. Northeast Agricultural University,Harbin 150030, China; 4. Hulunbuir Institute of Agricultural Sciences, Zhalantun 162652, China)

Prokaryotic expression vectors pET28-SMV CP, pET28-PVY CP and pET28-CLYVV CP of threePotyvirusviruses (Soybeanmosaicvirus, SMV;PotatovirusY, PVY; andCloveryellowveinvirus, CLYVV) were constructed. Through IPTG induction, expression and purification, we obtained the CP proteins of SMV, PVY and CLYVV.The monoclonal antibodies of 9 strains prepared before were used to detect SMV, PVY and CLYVV viral suspensions and purified CP proteins. The ELISA results showed that the 9 monoclonal antibodies recognized SMV virus; the antibodies 2D3, 4F9, 4G12 and 6E7 reacted with PVY; CLYVV was recognized by the antibodies 4F9 and 4G12, but the appetency between PVY or CLYVV and antibodies was lower than that of SMV.As for the recombinant expressed CP proteins, SMV and CLYVV CPs reacted with 2D3, 4F9, 4G12 and 6E7 strongly; PVY CP reacted with 4F9 and 4G12. In general, monoclonal antibodies 4F9 and 4G12 could recognize SMV, CLYVV and PVY universally. This study provided two universal antibodies againstPotyvirus.

Soybeanmosaicvirus;PotatovirusY;Cloveryellowveinvirus; coat protein; identification

2015-12-13

2016-01-27

吉林省自然科學(xué)基金(130101089JC); 吉林省農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室平臺建設(shè)項目(20122105)

S 435.32

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.06.012

* 通信作者 E-mail: yzwang@126.com; qyli1225@126.com