賈勇 崔志海 趙金秀

(1.廊坊市中醫(yī)院制劑室， 河北 廊坊 065000；2.廊坊市藥檢所， 河北 廊坊 065000;3.廊坊市中醫(yī)院中藥房， 河北 廊坊 065000)

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·論著·

慢粒靈膠囊藥用成分質(zhì)量控制研究*

賈勇1崔志海2趙金秀3

(1.廊坊市中醫(yī)院制劑室， 河北 廊坊 065000；2.廊坊市藥檢所， 河北 廊坊 065000;3.廊坊市中醫(yī)院中藥房， 河北 廊坊 065000)

目的 建立慢粒靈膠囊的青黛、山豆根、紅花薄層色譜鑒別及高效液相色譜法測定該制劑中的靛玉紅含量。方法 青黛、山豆根、紅花采用薄層色譜法(TLC)硅膠G層析板進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜(HPLC)法測定該制劑中的靛玉紅含量。色譜柱Inertsil ODS-SP 5 μm 4.6×250 mm，流動(dòng)相甲醇-水(70∶30)，檢測波長為292 nm，流速1.0 ml/min,柱溫35 ℃；結(jié)果 TLC色譜中斑點(diǎn)清晰，易于識別。靛玉紅在0.051～0.51 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.9999)，平均回收率為98.6%，RSD=1.9%(n=6)。結(jié)論 青黛、山豆根、紅花薄層色譜及高效液相色譜法測定靛玉紅含量。該方法簡單，準(zhǔn)確，專屬性好、重現(xiàn)性穩(wěn)定，靈敏度高，對慢粒靈膠囊制劑的制備與檢測提供科學(xué)依據(jù)。

慢粒靈膠囊； 靛玉紅； TLC； HPLC

慢粒靈膠囊為老院長驗(yàn)方，由廊坊市中醫(yī)院制劑室生產(chǎn)。慢粒靈膠囊由青黛、山豆根、三棱、莪術(shù)、紅花等藥味組成，具有活血化瘀，消癥散結(jié)，用于慢性粒細(xì)胞白血病治療。為了有效的控制產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量，采用高效液相色譜法HPLC對其主要藥味青黛中的有效成分靛玉紅進(jìn)行了定量檢測，制定了山豆根、紅花、青黛的定性鑒別，對該制劑的制備與檢測提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Shimadzu 2010-AHT 高效液相色譜儀(日本島津公司，DAD檢測器)，電子天平(日本島津Auw120d)；KQ2200B型超聲波清洗器(功率100 W,頻率40 Hz，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑 靛玉紅對照品 來源于中國食品藥品檢定研究院(批號 110717-200204，供含量測定用)；苦參堿對照品來源于中國食品藥品檢定研究院(110805-200508，國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))；紅花對照藥材 中國食品藥品檢定研究院(120907-201412，國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))。甲醇為HPLC級，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純試劑。慢粒靈膠囊及缺有相關(guān)藥味的陰性對照樣品均由廊坊市中醫(yī)院制劑室提供，慢粒靈膠囊暫時(shí)沒有批號。

2 方法與測定結(jié)果

2.1 青黛的鑒別 取慢粒靈膠囊10粒,混勻，稱量4 g, 加甲醇溶劑50 ml水浴回流處理30分鐘，濾過后，濾液蒸干處理；加30 ml水使溶解，置于分液漏斗中，采用水飽和后的正丁醇溶液萃取2次，每次為30 ml； 合并正丁醇提取溶液，采用100 ℃水浴蒸干，蒸干后用1 ml甲醇溶解，作為樣品溶液[1]。另取購自中檢院靛玉紅對照品1 mg，加甲醇1 ml，混勻，作為對照品溶液。再取處方中不含青黛藥材的制劑同法制成陰性對照溶液。參照中國藥典2015年版四部 0502試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 μL，以甲苯-三氯甲烷-丙酮(5∶4∶1)為展開劑，點(diǎn)與薄層層析用的硅膠G板上，薄層展開，取出，晾干。供試品與對照品相應(yīng)位置顯相同顏色斑點(diǎn)，而陰性樣品再相應(yīng)位置未顯斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 青黛TLC圖

Figure 1 TLC of indigo naturalis

注：1.慢粒靈膠囊(20151101); 2.慢粒靈膠囊(20151120);3.慢粒靈膠囊(20160104); 4.靛玉紅對照品;5.陰性供試品

2.2 山豆根的鑒別 取慢粒靈膠囊10粒，置于錐形瓶中，加入甲醇60 ml加熱回流30分鐘處理，冷卻后過濾，濾液水浴蒸干；蒸干后殘?jiān)铀?0 ml溶解，加鹽酸調(diào)節(jié)PH為3～4，用乙醚50 ml,分兩次萃取，棄去乙醚液，分取水層，加10%氫氧化鈉溶液調(diào)PH值為13，置于分液漏斗中，用氯仿液30 ml提取3次；合并氯仿提取液，蒸干，蒸干后用甲醇1 ml使溶解，制成樣品溶液[2]。另取購自中檢院苦參堿對照品1 mg，加甲醇1 ml，混勻，作為對照品溶液。作為對照品溶液。再取去除處方中山豆根藥材同法制成陰性對照溶液。參照中國藥典2015年版四部 0502試驗(yàn)，吸取上述制備的樣品溶液、陰性樣品溶液分別為10 μL，苦參堿溶液5 μL，以氯仿-甲醇-濃氨試液(4∶1∶0.1)為展開劑，點(diǎn)與薄層層析用的硅膠G板上，薄層展開，取出，晾干。噴以稀碘化鉍鉀試液[3]。供試品與對照品相應(yīng)位置顯相同顏色斑點(diǎn)，而陰性樣品再相應(yīng)位置未顯斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。結(jié)果見圖2。

圖2 山豆根TLC圖

Figure 2 TLC of Radix Sophorae Subprostratae

注：1.慢粒靈膠囊(20151101); 2.慢粒靈膠囊(20151120); 3.慢粒靈膠囊(20160104); 4.苦參堿對照品; 5.陰性供試品

2.3 紅花的鑒別 取慢粒靈膠囊10粒, 混勻，稱量4 g, 加入50 ml甲醇試劑水浴回流加熱30分鐘，濾過，濾液蒸干;加30 ml水使溶解，置于分液漏斗中，采用水飽和后的正丁醇溶液萃取2次，每次為30 ml;合并正丁醇提取溶液，采用100 ℃水浴蒸干，蒸干后殘?jiān)? ml甲醇溶解，作為樣品溶液。另取購自中檢院紅花對照藥材1 g，加水200 ml，煎煮1小時(shí)，快速濾過，濾液采用減壓濃縮至約10 ml,用水飽和的正丁醇萃取2次，每次為30 ml，合并正丁醇提取溶液，采用100 ℃水浴蒸干，蒸干后用1 ml甲醇溶解，作為對照藥材溶液，再取去除處方中紅花藥材，采用同樣方法，制成陰性對照溶液。參照中國藥典2015年版四部 0502試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5 μL，以乙醚-三氯甲烷(2∶3)為展開劑，點(diǎn)與薄層層析用的硅膠G板上，薄層展開，置于預(yù)先用展開劑飽和15分鐘處理的展開缸內(nèi)，展開處理，取出，揮干溶劑，在氨蒸氣中熏15分鐘，置于365 nm紫外燈下檢視[4]。供試品色譜中在陰性對照無干擾，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)，結(jié)果見圖 3。

2.4 靛玉紅的含量測定2.4.1 色譜條件 色譜柱Inertsil ODS-SP 5 μm 4.6×250 mm C/N.5020-01732；流動(dòng)相 甲醇-水(70∶30)；流速1.0 ml/min,柱溫35 ℃；檢測波長為292 nm[5]。

圖3 紅花TLC圖

Figure 3 TLC of carthamus tinctorious

注：1.慢粒靈膠囊(20151101)； 2.慢粒靈膠囊(20151120); 3.慢粒靈膠囊(20160104);4.紅花對照藥材; 5.陰性供試品

2.4.2 對照品溶液制備 精密稱取國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的靛玉紅對照品12.68 mg，置250 ml量瓶中, 加三氯甲烷-甲醇(1∶9)稀釋至刻度，混勻后，即得(制成1 ml含50.72 μg的對照品溶液)。

2.4.3 供試品溶液制備 取慢粒靈膠囊20粒內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱取2 g，置錐形瓶中，加入乙醚40 ml，超聲處理30分鐘，用乙醚洗滌濾渣和濾器；用10%氫氧化鈉10 ml洗滌，分取乙醚層，揮干，殘?jiān)尤燃淄?甲醇(1∶9)溶解，定溶于10 ml量瓶中，采用三氯甲烷-甲醇(1∶9)稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過即得[6]。

2.4.4 陰性對照樣品溶液的制備 取去除青黛藥材處方，制成陰性對照的制劑樣品。按照“2.4.3供試品溶液制備”方法制備成待測的陰性樣品溶液[7]。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 靛玉紅空白圖譜、靛玉紅圖譜與陰性供試品(C)的HPLC圖譜

2.4.6 專屬性檢測，注入HPLC儀器中陰性對照品溶液、對照品溶液與供試品溶液各10 μL，供試品溶液呈現(xiàn)出于靛玉紅對照品溶液相同的色譜峰，陰性樣品未出現(xiàn)相同的色譜圖形，結(jié)果表示陰性對照樣品無干擾[8]，見圖4。

2.4.7 線性范圍 精密量取2.4.2項(xiàng)下對照品溶液1、2、4、6、8、10 μL，按照“2.4.1色譜條件”注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以靛玉紅濃度為橫坐標(biāo)，靛玉紅峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸方程，得線性回歸方程 Y=108484.1x+7906.495,r=0.9999 得到結(jié)果，靛玉紅在0.051～0.51 μg，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系[9-10]。

2.4.8 精密度檢測 取靛玉紅對照品溶液濃度為50.72 μg/mL的溶液，采用上述“2.4.1”色譜條件，進(jìn)樣量為10 μL，6次連續(xù)進(jìn)樣，采用6次測定峰面積值[11-13]，計(jì)算RSD為 0.14%。

2.4.9 重復(fù)性試驗(yàn) 采用批號為20151120供試品6份， 進(jìn)樣量為10 μL，注入HPLC儀器中，計(jì)算6份樣品的靛玉紅含量為0.209 mg/g，6份樣品的RSD值為1.63%。

2.4.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(批號20151120)，按“2.4.1”色譜條件進(jìn)行3小時(shí)測定一次，共測定6次，進(jìn)樣量為10 μL。6次得到靛玉紅峰面積RSD為1.0%，結(jié)果說明測定的靛玉紅在15小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定[14-17]。

2.4.11 回收率測定 取已測定含有量的樣品(批號20151120，靛玉紅的含量為0.209 mg/g)，取約0.5 g，共計(jì)6份，精密稱定重量，分別置與錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶中精密加入濃度為0.01024 mg/mL靛玉紅對照品溶液10 ml,按2.4.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定靛玉紅含量，進(jìn)行回收率計(jì)算[18-19]，見表1。

表1 靛玉紅回收率試驗(yàn)

2.4.12 樣品測定 取批號為20151101、20151120、20160104的樣品，進(jìn)行檢測，進(jìn)樣量為10 μL。測得含量值[20]，結(jié)果見圖2、表2。

表2 樣品測定結(jié)果

3 討論

3.1 青黛鑒別 溶劑考察中采用甲醇、乙醇分別提取、超聲處理10分鐘,水浴回流10、20、30分鐘，結(jié)果采用甲醇提取，加熱回流30分鐘效果好。采用不經(jīng)過水飽和后的正丁醇、與經(jīng)過水飽和后的正丁醇溶液萃取比對，結(jié)果經(jīng)過萃取后的供試品斑點(diǎn)清晰干擾少。展開劑的選擇，采用甲苯-三氯甲烷(5∶4)；三氯甲烷-丙酮(4∶0.5)；甲苯-三氯甲烷-丙酮(5∶4∶1)，結(jié)果甲苯-三氯甲烷-丙酮(5∶4∶1)展開系統(tǒng)好，比移值適中。

3.2 山豆根鑒別 溶劑選擇時(shí)采用乙醚兩次萃取，棄去乙醚液，分取水層，再用氯仿液30ml提取效果好，優(yōu)于甲醇直接回流后進(jìn)行薄層分析。采用分別兩次PH調(diào)節(jié)后，雜質(zhì)干擾少，斑點(diǎn)清晰。展開劑的選擇時(shí)采用氯仿-甲醇(4∶1)；乙酸乙酯-甲醇(4∶1)；氯仿-甲醇-濃氨試液(4∶1∶0.1)展開系統(tǒng)好，比移值適中。

3.3 紅花鑒別 采用顯色時(shí)置于預(yù)先用展開劑飽和15分鐘處理的展開缸內(nèi)，展開處理，取出，揮干溶劑，在氨蒸氣中熏15分鐘后，置于365 nm、254 nm紫外燈下與日光下對比檢視，結(jié)果置于365 nm紫外燈下斑點(diǎn)清晰。

3.4 靛玉紅含量測定 通過實(shí)驗(yàn)，靛玉紅含量測定中，樣品用乙酸乙酯水浴，乙醚超聲，乙酸乙酯超聲，結(jié)果證明乙醚超聲提取率最高，另外還進(jìn)行了超聲時(shí)間條件摸索，20 min，30 min，40 min，結(jié)果證明采用30 min提取最佳。靛玉紅含量測定色譜條件的優(yōu)化選擇，按《中國藥典2015版一部》199頁，青黛中靛玉紅含量測定色譜條件，波長選擇為292 nm。流動(dòng)相曾選擇甲醇∶水=60∶40、甲醇∶水=70∶30、甲醇∶水=80∶20，按照該色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果甲醇∶水=70∶30，分離效果好，靛玉紅分離度大于1.5、理論板數(shù)高。在保證該方法專屬性的同時(shí)，大大縮短了樣品測定時(shí)間，節(jié)省了流動(dòng)相溶劑的使用。

含量測定中曾選擇青黛中另一主成分靛藍(lán)的測定。按《中國藥典2015版一部》199頁，青黛中靛藍(lán)含量測定色譜條件，采用色譜條件為十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，以甲醇-水(75∶25)為流動(dòng)相，檢測波長為606 nm。對照品溶液的制備：取靛藍(lán)對照品2.5 mg，精密稱定，置250 ml量瓶中，加2%水合氯醛的三氯甲烷溶液(取水合氯醛，置硅膠干燥器中放置24小時(shí)，稱取2.0 g，加三氯甲烷至100 ml，放置，出現(xiàn)渾濁，以無水硫酸鈉脫水，濾過，即得)約220 ml，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)1.5小時(shí)，放冷，加2%水合氯醛的三氯甲烷溶液至刻度，搖勻，即得(每1 ml中含靛藍(lán)10 μg)。供試品溶液的制備 取慢粒靈膠囊20粒內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱取1 g，精密稱定，置250 ml量瓶中，加2%水合氯醛的三氯甲烷溶液約220 ml，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30分鐘，放冷，加2%水合氯醛的三氯甲烷溶液至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定即得。結(jié)果分離效果不好，樣品中靛藍(lán)理論板數(shù)不足500，色譜峰形不對稱，分離度小于1.5，故未列入正文。

4 結(jié)論

本研究對慢粒靈膠囊的青黛、山豆根、紅花薄層色譜鑒別及高效液相色譜法測定靛玉紅含量的方法簡單，準(zhǔn)確，專屬性好、重現(xiàn)性穩(wěn)定，靈敏度高，為慢粒靈膠囊制劑的制備與檢測提供了科學(xué)依據(jù)。

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Control of quality standards for Manliling Capsule

JIA Yong1, CUI Zhihai2, ZhAO Jinxiu3

(1.DispensingRoom,LangfangTCMHospital,Langfang065000,Hebei,China;2.LangfangInstituteforDrugControl,Langfang065000,Hebei,China;3.TCMPharmacy,LangfangTCMHospital,Langfang065000,Hebei,China;)

Objective To establish the quality standard for Manliling Capsule. Methods Naturalis Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma and Carthami Flos were identified by TLC. Indirubin was determined by HPLC. Indigo Naturalis Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma and Carthami Flos were identified by thin-layer chromatography (TLC) silica gel G.. Indirubin was determined by HPLC. The sample was separated by Inertsil ODS-SP 5μm 4.6×250 mm with methanol -water (70:30)in gradient elution. The detection wavelength was 292 nm. The flow rate was 1.0 ml/min, and the column temperature was 35℃. Results Indigo Naturalis, Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma and Carthami Flos could be detected by TLC. Indirubin showed a good linear relationship in a range of 0.051～0.51μg and the average recovery was 98.6%, RSD was 1.9%n=6). Conclusion The quality standard for Manliling Capsule. Naturalis Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma and Carthami Flos were identified by TLC. Indirubin was determined by HPLC. The methods are simple, sensitive and accurate with good reproducibility, methods may be used for the quality control of Manlilng Capsule.

Manliling Capsule; Indirubin; TLC; HPLC

HPLC of Indirubin

ubstance (A), sample (B)and negative sample(C)

河北省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(2013276163)

R 914

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.11.029

2016-05-23； 編輯： 張文秀)