李萍 李延海

1西安體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)教研室（西安 710068）2西安交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)信息工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，康復(fù)科學(xué)與技術(shù)研究中心（西安 710049）

大鼠紋狀體內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征的研究

李萍1李延海2

1西安體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)教研室（西安 710068）2西安交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)信息工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，康復(fù)科學(xué)與技術(shù)研究中心（西安 710049）

目的：探討大鼠紋狀體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征。方法：應(yīng)用膽堿酯酶組織化學(xué)染色方法，研究紋狀體從嘴側(cè)到尾側(cè)不同冠狀切面的細(xì)胞組織形態(tài)特性。結(jié)果：在整個(gè)紋狀體內(nèi)的任一冠狀切面上，均存在邊界較清楚、大小不同的斑塊狀淡染色區(qū)紋狀小體（patch）和其周圍面積較大的深染色區(qū)基質(zhì)（matrix），二者相間分布；從嘴側(cè)到尾側(cè)，紋狀體呈現(xiàn)深染區(qū)域逐漸增多的變化趨勢，即靠近嘴側(cè)的紋狀體以patch為主，而靠近尾側(cè)的紋狀體則以matrix為主；從內(nèi)側(cè)向外側(cè)，紋狀體也呈現(xiàn)出matrix逐漸增多的變化趨勢；膽堿酯酶染色陽性神經(jīng)元主要分布在matrix區(qū)域。結(jié)論：紋狀體內(nèi)部具有patch鑲嵌在matrix中的細(xì)胞構(gòu)筑特征，并存在著matrix所占比例從嘴側(cè)到尾側(cè)及從內(nèi)側(cè)向外側(cè)逐漸增大的分布趨勢，這種內(nèi)部細(xì)胞構(gòu)筑的復(fù)雜性與不均一性可能是紋狀體對運(yùn)動(dòng)具有學(xué)習(xí)與記憶能力等多種生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步探討紋狀體內(nèi)的不同區(qū)域在運(yùn)動(dòng)中的作用奠定了基礎(chǔ)。

紋狀體；紋狀小體；基質(zhì)

紋狀體是大腦皮層下的高級運(yùn)動(dòng)中樞，與機(jī)體隨意運(yùn)動(dòng)的穩(wěn)定、肌張力的調(diào)節(jié)和軀體運(yùn)動(dòng)的協(xié)調(diào)密切相關(guān)，對控制和執(zhí)行各種運(yùn)動(dòng)行為具有關(guān)鍵作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，它不僅在觸發(fā)和計(jì)劃多種行為方式中

具有重要作用，而且還是習(xí)慣形成以及復(fù)合運(yùn)動(dòng)方式信息儲(chǔ)存的中心[1-3]。乙酰膽堿是紋狀體內(nèi)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，主要由膽堿能中間神經(jīng)元軸突末梢釋放產(chǎn)生。而膽堿能中間神經(jīng)元，作為紋狀體中間神經(jīng)元的一種，不僅對紋狀體主神經(jīng)元具有調(diào)節(jié)作用，而且是紋狀體神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，通過調(diào)節(jié)主神經(jīng)元的正常突觸傳遞和突觸可塑性，進(jìn)而調(diào)節(jié)了自主運(yùn)動(dòng)及情景依賴性行為等[4]。以往的神經(jīng)解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，紋狀體內(nèi)部呈淡染色區(qū)紋狀小體（patch）和其周圍面積較大的深染色區(qū)基質(zhì)（matrix）兩種邊界清楚的區(qū)域間隔性分布，二者在形態(tài)結(jié)構(gòu)上具有不同的組織學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；在功能上具有調(diào)節(jié)軀體運(yùn)動(dòng)以及習(xí)慣行為兩種完全不同的功能特征[5-7]。因此，區(qū)分這兩種組織學(xué)結(jié)構(gòu)將為揭示紋狀體完成不同功能的細(xì)胞與分子機(jī)制提供重要資料。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用膽堿酯酶組織化學(xué)染色方法，顯示紋狀體從嘴側(cè)到尾側(cè)不同冠狀切面的形態(tài)，尋找patch和matrix在不同冠狀切面的分布特點(diǎn)及其在整個(gè)紋狀體內(nèi)的分布規(guī)律，為進(jìn)一步研究紋狀體內(nèi)部不同區(qū)域在運(yùn)動(dòng)調(diào)控中的生理功能提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)選用體重為140~180 g的健康Sprague-Dawley大鼠，雌雄不拘，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠在12/12 h明/暗交替的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由取食及飲水。

1.2 組織制備

1.2.1 灌流、取材和固定

成年SD大鼠給予2%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射。動(dòng)物麻醉后取仰臥位，打開胸腔，從左心室插入鈍針頭至升主動(dòng)脈，剪開右心耳，同時(shí)打開輸液器開關(guān)，快速灌注溫生理鹽水100 ml，然后用4°C的4%多聚甲醛（pH 7.4）500 mL灌注固定，先將250 ml固定液快速灌入，剩余的250 ml緩慢滴入，共持續(xù)2~3 h。灌注完畢，立即斷頭取全腦，置相同固定液后固定4~6 h后，浸入20%、30%的蔗糖的磷酸鹽緩沖鹽液（PBS）（4°C）中，直至沉底。

1.2.2 切片

腦塊在30%蔗糖中沉底后，立即取出，用刀片將其分為左右兩半球，分別將其用OCT包埋固定后，用冰凍切片機(jī)進(jìn)行冠狀連續(xù)切片，切片厚40 μm，并將含有紋狀體的大腦切片按前后次序收集于預(yù)先注入0.01 M的磷酸鹽緩沖鹽液（PBS）（pH 7.4）六孔板中，用于膽堿酯酶染色。

1.3 膽堿酯酶組織化學(xué)染色

對腦片進(jìn)行膽堿酯酶染色前30 min，配制孵育液。具體步驟如下：先稱取12.5 mg底物乙酰硫代膽堿碘化物，放入玻璃皿內(nèi)，然后依次加入以下各溶液：0.82%醋酸鈉15.8 ml、0.6%醋酸0.5 ml、2.94%檸檬酸鈉1.2 ml、0.75%硫酸銅2.5 ml、0.137%四異丙焦磷酰銨0.5 ml、0. 165%鐵氰化鉀2.5 ml，以1 M HCl或NaOH將pH調(diào)為5.6，孵育液呈亮綠色。將切片放入24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔一張切片，1 ml孵育液。37°C水浴箱孵育2~3 h，0.01 M PBS洗3次，每次5 min，然后裱片，陰干，脫水，透明，封片，光鏡下檢測結(jié)果。

1.4 顯微鏡觀察

光鏡下觀察紋狀體不同冠狀切面的形態(tài)以及膽堿酯酶染色結(jié)果。光鏡低倍鏡（×40）下對紋狀體進(jìn)行顯微數(shù)碼攝片；高倍鏡（×100）觀察patch和matrix間區(qū)的分布以及陽性神經(jīng)元的形態(tài)及分布特點(diǎn)。用Photoshop軟件測量patch和matrix間區(qū)的面積，并計(jì)算其百分比。

2 結(jié)果

2.1 紋狀體不同冠狀切面膽堿酯酶染色結(jié)果

實(shí)驗(yàn)將SD大鼠腦在連續(xù)冠狀切片后，選取從嘴側(cè)到尾側(cè)含有紋狀體的腦片進(jìn)行膽堿酯酶染色。結(jié)果如圖1所示，A、B、C、D、E、F六張圖片分別代表取自位于前囟2.2、1.6、1.0、0.2、－0.2、－1.0 mm的腦片染色結(jié)果。這些圖片中均包含了皮層、胼胝體和紋狀體等腦區(qū)。A圖中，紋狀體染色雖然與皮層和胼胝體相比呈陽性，但是與其它5張圖片相比，染色淡而且較均勻。而F圖中，紋狀體膽堿酯酶染色呈強(qiáng)陽性，染色深且較均一?？傮w趨勢是，在接近嘴側(cè)的切片中紋狀體以淺染區(qū)域?yàn)橹?，而接近尾?cè)的切片中紋狀體以深染區(qū)域?yàn)橹?；從嘴?cè)到尾側(cè)，紋狀體呈現(xiàn)深染區(qū)域逐漸增多的變化趨勢；而從內(nèi)側(cè)到外側(cè)，紋狀體的染色強(qiáng)度也呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的變化趨勢。以往的實(shí)驗(yàn)顯示，膽堿酯酶（AChE）主要分布于matrix間區(qū)[8]。因此這一染色結(jié)果表明，在靠近嘴側(cè)的紋狀體，patch間區(qū)所占比例較大，尤其是在前囟2.2 mm~1.6 mm的冠狀切片上，patch的面積占切片總面積的近50%；在靠近尾側(cè)的紋狀體，特別是在前囟0.2 mm~－1.0 mm的冠狀切片上，主要是matrix間區(qū)為主，所占比例大于80%，patch間區(qū)所占比例很小。

2.2 patch和matrix間區(qū)的形態(tài)觀察

取位置為前囟－0.1 mm的冠狀腦片，觀察patch和matrix間區(qū)的分布特點(diǎn)以及陽性神經(jīng)元的形態(tài)特征。染色結(jié)果顯示，在膽堿酯酶標(biāo)記的整個(gè)紋狀體內(nèi)，存在邊界較清楚、大小不等的斑塊狀淡染色區(qū)以及淡染區(qū)周圍的色區(qū)，分別為patch（淡染）間區(qū)和matrix（深染）間區(qū)。如圖2B所示，膽堿酯酶染色淡的patch間區(qū)呈不規(guī)則狀鑲嵌于染色深的matrix內(nèi)。而陽性神經(jīng)元在紋狀體內(nèi)散在分布，且數(shù)量較少，主要分布在膽堿酯酶深染的區(qū)域，即matrix區(qū)域。神經(jīng)元胞體較大，呈橢圓形

或梭形，細(xì)胞核不著色（圖2C）。

圖1 從嘴側(cè)到尾側(cè)冠狀切片中紋狀體膽堿酯酶染色結(jié)果

圖2 光鏡下觀察紋狀體patch和matrix間區(qū)分布及陽性神經(jīng)元

3 討論

膽堿酯酶陽性染色的神經(jīng)元主要是膽堿能中間神經(jīng)元。在新紋狀體，膽堿能中間神經(jīng)元是紋狀體內(nèi)最大的無棘突神經(jīng)元，其胞體直徑超過40 μm，數(shù)量少于神經(jīng)元總數(shù)的5%[9]。該神經(jīng)元的興奮性傳入來自于皮層和丘腦，同時(shí)也接受紋狀體中等有棘神經(jīng)元（MSNs）的GABA能抑制性傳入以及來自黑質(zhì)的多巴胺能傳入[10，11]。膽堿能中間神經(jīng)元主要分布于matrix，其作用靶點(diǎn)主要是MSNs，對MSNs的放電模式及突觸傳遞過程都具有重要的調(diào)制作用[4]。盡管這類中間神經(jīng)元數(shù)量很少，但與其它類型神經(jīng)元相比，它具有大且十分密集的軸突樹，因而具有較為廣泛的靶區(qū)，對MSNs的信息傳出具有較強(qiáng)的調(diào)制作用。由于該神經(jīng)元的軸突分布特征，致使紋狀體成為在整個(gè)大腦內(nèi)含乙酰膽堿和膽堿能受體濃度很高的腦區(qū)[12，13]。膽堿能中間神經(jīng)元通過其分布廣泛的軸突釋放乙酰膽堿，作用于靶細(xì)胞的膽堿能受體而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。研究顯示，紋狀體內(nèi)的膽堿能受體包括煙堿型（N）受體及毒蕈堿型（M）受體。煙堿型受體主要位于紋狀體內(nèi)的多巴胺能神經(jīng)末梢[14]（突觸前）；M1-like乙酰膽堿受體主要表達(dá)在有棘神經(jīng)元上（突觸后），而M2-like受體（和可能的M3-like受體）位于皮層—紋狀體谷氨酸能末梢及GABA能中間神經(jīng)元的紋狀體—膽堿能纖維末梢上（突觸前）[15，16]。因此，乙酰膽堿在紋狀體內(nèi)對突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放以及突觸后的信息傳遞均發(fā)揮了重要的調(diào)制作用[17]。紋狀體功能的正常還有賴于多種神經(jīng)遞質(zhì)與受體功能的協(xié)調(diào)與平衡，如乙酰膽堿與多巴胺的平衡是維持正常軀體運(yùn)動(dòng)所必須的。

以神經(jīng)化學(xué)解剖學(xué)為依據(jù)，紋狀體可以分為patch和matrix兩類邊界較清楚的間區(qū)，紋狀體的神經(jīng)元依此又被分為紋狀體－patch和紋狀體－matrix神經(jīng)元。patch和matrix的神經(jīng)元具有很多相似的特點(diǎn)，包括電學(xué)特性及軸突、樹突分布形[6]等。形態(tài)學(xué)研究證實(shí)紋狀體的patch和matrix間區(qū)神經(jīng)元通過不同的神經(jīng)通路執(zhí)行不同的機(jī)能。前者接受中間額葉皮層、邊緣皮層、黑質(zhì)致密部和腹側(cè)黑質(zhì)網(wǎng)狀部的傳入神經(jīng)纖維；而后者的傳入纖維主要來自感覺運(yùn)動(dòng)皮層、聯(lián)合皮層、大腦皮層輔助運(yùn)動(dòng)區(qū)、背側(cè)黑質(zhì)致密部、邊緣皮層、腹側(cè)被蓋區(qū)和丘腦髓板內(nèi)核群[6]。patch和matrix還有許多方面的不同，包括含有的神經(jīng)遞質(zhì)與受體、神經(jīng)元的發(fā)育過程與組織結(jié)構(gòu)以及參與的功能等。例如，patch的組織化學(xué)特征表現(xiàn)為鈣結(jié)合蛋白染色缺失，μ-阿片受體分布密集以及小清蛋白的染色缺失等，另外，patch還富含p物質(zhì)和腦啡肽。而matrix的組織化學(xué)特征主要是相對富含AChE、鈣結(jié)合蛋白、乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)體

（ChAT）以及酪氨酸羥化酶[18]。由于patch和matrix間區(qū)在很多方面存在著差異，它們對紋狀體生理功能可能發(fā)揮了不同的作用，因此對這兩個(gè)間區(qū)的研究必然成為探索紋狀體功能的關(guān)注點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，無論從嘴側(cè)到尾側(cè)或是從內(nèi)側(cè)到外側(cè)，紋狀體均呈現(xiàn)膽堿酯酶染色強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)的變化趨勢，即matrix所占面積逐漸增大；在前囟2.2 mm~1.6 mm區(qū)域內(nèi)，patch間區(qū)占接近50%的紋狀體面積；從前囟0.2 mm到紋狀體尾側(cè)主要是matrix間區(qū)為主，所占比例大于80%。該結(jié)果表明patch在matrix中的鑲嵌并不是均一的，而是存在部位差異，此結(jié)果補(bǔ)充并深化了對紋狀體內(nèi)部細(xì)胞構(gòu)筑特點(diǎn)的認(rèn)識(shí)。研究結(jié)果也提示，紋狀體內(nèi)部的功能差異可能是由其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的不均一性決定的，即靠嘴側(cè)的紋狀體可能較多地參與了習(xí)慣行為的調(diào)制和記憶，而靠尾側(cè)的紋狀體則主要參與對機(jī)體隨意運(yùn)動(dòng)的調(diào)制。

4 總結(jié)

本實(shí)驗(yàn)使用膽堿酯酶組織化學(xué)染色方法，觀察紋狀體從嘴側(cè)到尾側(cè)不同部位冠狀切片的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及膽堿酯酶的染色特點(diǎn)。結(jié)果顯示，紋狀體內(nèi)部結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)patch和matrix間區(qū)的鑲嵌分布特點(diǎn)，以及從嘴側(cè)到尾側(cè)、從內(nèi)側(cè)到外側(cè)matrix所占面積比例逐漸增大的不均一性分布，研究結(jié)果為進(jìn)一步研究patch和matrix功能提供了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。這種patch及matrix不均一分布特點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探討紋狀體在運(yùn)動(dòng)控制及調(diào)節(jié)中的作用提供了重要參考資料，為深入探討紋狀體內(nèi)部不同區(qū)域在運(yùn)動(dòng)技巧學(xué)習(xí)以及認(rèn)知中的作用提供了新思路。

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Research on Internal Structure Characteristics of Rats’Striatum

Li Ping1，Li Yanhai2
1 Department of Sports Medicine，Xi’an Physical Education University，Xi’an 710068，China 2 The Key Laboratory of Biomedical Information Engineering of Ministry of Education，and Research Center of Rehabilitation Science and Technology，School of Life Science and Technology，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710049，China Corresponding Author：Li Yanhai，Email：liyanhai@mail.xjtu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the internal structure characteristics of rats’striatum.MethodsThe morphological characteristics of the rostral-caudal striatum of rats were studied using the histochemical staining method of acetylcholinesterase（AChE）.ResultsIn the striatal coronal slices stained using AChE，there were many weakly labelled speckles（named patch）with different shape and size，and clear boundary surrounded by strongly labelled subregions（named matrix）.Moreover，the number of the matrix increased gradually from the rostral to the caudal striatum，and from the medial to lateral striatum.The AChE-positive neurons in oval or spindle shapemainly concentrated in the matrix.Conclusion Patches embedded in the matrix are very numerous in rostral striatum.In contrast，caudal striatum exhibits many matrixes.The cholinergic interneuron mainly distributes in matrix.These complicated and uneven characteristics of cytoarchitecture may be the structural basis for the striatum to have many physiologic functions including learning and memorizing ability.This study provides meaningful foundation for further exploring the role of patch and matrix in the movements.

striatum，patch，matrix

2016.03.31

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.31000480）和西安體育學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)經(jīng)費(fèi)共同資助

李延海，Email：liyanhai@mail.xjtu.edu.cn