馮雪++于澤娟++劉艷雙++張召++張一名++孫艷香

摘要：在冬季溫室條件下，分別對種子萌發(fā)期、幼苗期和快速生長期的芹菜（Apium graveolens L.）噴施0、20、50、100、200 μmol/L的外源一氧化氮（NO）供體硝普鈉（SNP）溶液，測定種子萌發(fā)率、單株株高和重量、根系發(fā)育以及葉片中葉綠素、硝酸鹽和亞硝酸鹽含量等指標。結果表明，噴施SNP 100 μmol/L處理可促進芹菜種子萌發(fā)，加快幼苗期植株生長，提高幼苗生長量和葉片葉綠素含量；在快速生長期噴施SNP，除200 μmol/L處理顯著降低了植株株高和葉綠素含量外，其他濃度處理對生長量和葉綠素含量未產生顯著影響；低濃度SNP增加了芹菜的側根數(shù)目，改變了根系結構；利用HLPC法測定芹菜葉片中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的結果顯示，外源SNP不會對芹菜葉片中硝酸鹽和亞硝酸鹽的累積產生顯著影響。NO對芹菜生長發(fā)育的影響具有階段特異性和組織特異性，適合于在其形態(tài)建成的早期應用；NO作為一種含氮的信號分子，不會改變芹菜與硝酸鹽含量相關的食用品質。

關鍵詞：芹菜（Apium graveolens L.）；一氧化氮（NO）；生長量；硝酸鹽；亞硝酸鹽

中圖分類號：S636.3+8 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）18-4717-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.18.023

芹菜（Apium graveolens L.）是傘形科（Umbelliferae）芹屬（Apium L.）一、二年生草本植物，因其具有重要的保健作用和藥理功效而在蔬菜產業(yè)中被廣泛周年種植。北方冬季芹菜生產需在相對密閉的溫室中完成，而溫室中濕度大、溫度高、光照弱、通風不良的生長條件通常會減緩芹菜的生長，影響產量和生長周期，進而降低生產效益。為此，采取有效的農藝措施提高溫室栽培條件下芹菜的產量是其生產中的重要研究內容。一氧化氮（NO）是廣泛存在于生物體內的一種易擴散的生物活性分子，也是一種重要的氧化還原信號分子，在植物體內調控種子的萌發(fā)、根系形態(tài)建成和花器官發(fā)生等諸多生長發(fā)育過程，同時也調節(jié)氣孔運動，參與植物對多種生物脅迫和非生物脅迫的應答響應[1]。Leshem等[2]最早報道了NO可調控豌豆的生長和發(fā)育；Uchida等[3]發(fā)現(xiàn)用NO預處理可提高水稻幼苗在高熱和高鹽脅迫下的存活能力；馬向麗等[4]檢測到外源NO供體硝普鈉（Sodium nitroprusside，簡稱SNP）可通過增加黑麥草體內多種過氧化物酶的含量，減緩細胞質膜相對透性的增加，從而減少低溫對黑麥草的損傷，其中SNP用量在0.5 mmol/L時效果最顯著；此外，Esim等[5]指出外源NO也可通過激活小麥的抗氧化系統(tǒng)而提高小麥的耐低溫脅迫能力。在蔬菜生產中，王文等[6]利用外源NO來緩解因連作而導致的苯丙烯酸脅迫對黃瓜植株的傷害。然而，外源NO對綠色莖葉類蔬菜生長發(fā)育的影響還鮮有報道。

硝酸鹽及亞硝酸鹽對生態(tài)環(huán)境和人體健康的影響已引起人們的普遍關注，人體攝入的硝酸鹽有81.2%來自蔬菜，綠色莖葉類蔬菜屬易富集硝酸鹽的作物[7]，因此硝酸鹽、亞硝酸鹽含量的控制是蔬菜生產中的重要課題。NO作為植物體內重要的含氮類氣體信號分子，除主要通過精氨酸依賴的NO合成酶（Nitric oxide synthases，NOS）途徑進行合成外，亞硝酸鹽依賴的硝酸還原酶（Nitrate reductase，NR）途徑也是主要來源[8]，由此可見，植物體中內源NO的合成與其體內硝酸鹽、亞硝酸鹽含量存在密切關系。外源施加NO是否會對植物體內硝酸鹽、亞硝酸鹽含量產生影響這在國內尚未見報道。為此，試驗于溫室栽培條件下，分別在芹菜種子萌發(fā)期、幼苗期和快速生長期噴施外源NO供體SNP，并測定芹菜生長發(fā)育以及收獲時植株體內的硝酸鹽、亞硝鹽含量，以此為NO在芹菜生產中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

芹菜品種為西雅圖（A. graveolens cv. Seattle），由天津市農業(yè)科學院蔬菜研究所提供。亞鐵氰化鉀、乙酸鋅等常規(guī)化學試劑均為分析純。硝酸鹽氮標準溶液、亞硝酸鹽氮標準溶液均為優(yōu)級純、SNP購自美國Sigma公司。

1.2 試驗設計

試驗于2014年冬季在天津市農業(yè)科學研究院科潤蔬菜研究所溫室中進行，溫室溫度在10～25 ℃，日照時間約8 h。試驗分芹菜種子萌發(fā)期、幼苗期和快速生長期3個階段進行。

1.2.1 種子萌發(fā)期 挑選整齊干凈、均勻一致的種子，75%乙醇浸泡種子5 min，無菌水清洗，再用次氯酸鈉浸泡5 min，無菌水清洗后，分別用不同濃度的SNP溶液浸泡種子12 h，各處理SNP溶液濃度分別為0（CK）、20、50、100、200 μmol/L，然后種植于泥炭盆中。每處理50粒種子、3個重復，以種子長出地面作為萌發(fā)標志，自萌發(fā)日起10 d后計算種子的發(fā)芽勢，15 d后計算發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)。處理15 d后，將每個處理發(fā)芽的種苗取出，去土，放入烘箱中，在70 ℃烘干5 min，取出后待涼至室溫，用電子天平稱量干重，計算活力指數(shù)，具體測定方法參考文獻[9]。

1.2.2 幼苗期 將田間芹菜每5行（行長1 m）為一個試驗小區(qū)進行種植，待芹菜幼苗生長到2片真葉后，用0、20、50、100、200 μmol/L的SNP溶液分別噴施幼苗，隔7 d再噴施1次，共噴施2次，最后1次噴施后于第八天時將芹菜幼苗小心挖出，去土留根，測量株高（莖基部到生長點）[10]，用電子天平稱量每行芹菜總鮮重、地上部鮮重，計算單株鮮重和平均株高。小區(qū)內各處理間隨機分布。重復3次。

1.2.3 快速生長期 正常生長的芹菜在真葉5～6片、苗高15～20 cm時定植，按常規(guī)進行管理。定植30 d后，對其噴施2次SNP，2次間隔6 d，濃度同上，噴施程度以噴至葉片滴水為止。第二次噴施后20 d收獲芹菜，小心去土留根，測量株高（莖基部到生長點），稱量每組總鮮重及去根后地上部鮮重，計算單株鮮重及平均株高。試驗設計為隨機區(qū)組，5次重復，每組30～40株。

1.3 生理指標測定

采用乙醇提取法[11]測定芹菜葉片葉綠素含量，在田間摘取頂葉三輪葉片上的第一片葉，帶回實驗室，用分光光度計在665 nm處測葉綠素a吸光度OD665 nm，在649 nm處測葉綠素b吸光度OD649 nm，計算葉綠素總量。

采用高效液相色譜法測定芹菜葉片亞硝酸鹽、硝酸鹽含量，在芹菜成熟后，取頂葉三輪葉片上的第一片葉檢測，具體測定方法參考余海蘭等[12]所述方法，并略作修改。測定條件為Agilent ZORBAX SB-C18 Stable Bond Analytical 4.6×150 mm 5-Micron色譜柱，0.03 mol/L的KH2PO4-H3PO4緩沖液流動相，流速1 mL/min，二極管陣列檢測器（Agilent G1315D），檢測波長204 nm，柱溫為室溫。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2003軟件處理，并用其制表和繪圖，運用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進行分析，采用LSD法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 外源NO對種子萌發(fā)的影響

發(fā)芽率反映種子發(fā)芽數(shù)量，發(fā)芽勢反映種子發(fā)芽的整齊度和速度[13]；活力指數(shù)既能反映發(fā)芽率、發(fā)芽速度，又能代表生長勢及生長活力；而發(fā)芽指數(shù)則能反映種子的綜合活力[14]。外源NO對芹菜種子萌發(fā)的影響情況見表1。由表1可知，與對照相比，SNP 100 μmol/L處理后，芹菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)比對照分別提高了0.75、1.02、0.92、4.06倍，說明SNP100 μmol/L處理對芹菜種子萌發(fā)具有顯著的促進作用（P<0.05），而SNP 20、50 μmol/L處理后，芹菜種子活力指數(shù)分別比對照提高了2.19、1.28倍。由此可見，SNP 100 μmol/L處理過的芹菜種子最易萌發(fā)。

2.2 外源NO對芹菜生長量的影響

2.2.1 外源NO對芹菜幼苗期生長量的影響 外源NO對芹菜幼苗期生長量的影響情況分別見表2、圖1。由表2、圖1可知，外源NO對芹菜幼苗生長的影響表現(xiàn)出了不同的差異性，如噴施SNP 50 μmol/L后，芹菜幼苗株高和葉綠素含量分別比對照提高了7.52%和11.73%，差異都達到了顯著水平（P<0.05），但其對鮮重2個指標無顯著影響（P>0.05）；噴施SNP 100 μmol/L的芹菜幼苗在株高、單株鮮重、地上部鮮重和葉綠素含量都較對照大大提高，分別提高了17.89%、27.06%、22.67%、21.60%，差異都達到了顯著水平（P<0.05）；而噴施SNP 200 μmol/L的處理使芹菜幼苗的單株鮮重、地上部鮮重、葉綠素含量分別降低了43.70%、43.97%、14.81%，差異都達到了顯著水平（P<0.05）。這說明SNP 100 μmol/L處理能有效提高芹菜幼苗的生長指標，可促進芹菜器官的生長和葉綠素的增加，從而提高植物的光合作用效率，而200 μmol/L處理對芹菜幼苗的生長起抑制作用。

2.2.2 外源NO對芹菜快速生長期生長量的影響 外源NO對芹菜快速生長期生長量的影響情況分別見表3、圖1。由表3、圖1可知，在快速生長期噴施不同濃度的SNP后，芹菜的生長量又表現(xiàn)出不同的差異。與對照相比，噴施SNP 20～100 μmol/L濃度的處理對快速生長期芹菜的株高、單株鮮重、地上部鮮重和葉綠素含量沒有顯著影響（P>0.05）；而200 μmol/L處理則使快速生長期芹菜的株高降低了2.60%，葉綠素含量降低了30.38%，差異都達到了顯著水平（P<0.05）。這表明，噴施SNP 200 μmol/L對快速生長期芹菜的生長產生了抑制作用。但此濃度下芹菜植株的總鮮重和地上部鮮重與對照相比并未發(fā)生顯著變化，說明SNP 200 μmol/L對芹菜生長的抑制可能只表現(xiàn)在抑制植株的縱向生長方面。

2.3 外源NO對芹菜根系發(fā)育的影響

根系是植物吸收養(yǎng)分的主要器官，其發(fā)育受遺傳因子、非生物因素以及外部生物的影響。Eghball等[15]發(fā)現(xiàn)根系發(fā)育與作物氮素形態(tài)和利用效率的高低有著密切的關系；還有研究[16]表明，硝態(tài)氮使根系韌性增強，根質變硬，長度增加；氨態(tài)氮抑制側根生成，使根系柔弱，明顯變短、加粗。外源NO對芹菜根系發(fā)育的影響情況分別見表4、圖1。由表4可知，在幼苗期和快速生長期分別噴施SNP后，不同濃度間對根重的影響差異都不顯著（P>0.05）。但由圖1-A可以看出，幼苗在噴施SNP 100 μmol/L后，與對照相比，主根長度最長，側根數(shù)目最多；同樣，由圖1-B也可以看出類似現(xiàn)象，噴施SNP 100 μmol/L后，快速生長期的芹菜側根數(shù)目最多，根密度最大，這都有利于芹菜增強對水分和營養(yǎng)的吸收能力。不過實際觀察發(fā)現(xiàn)，低濃度SNP處理（20、50 μmol/L）增加了芹菜的側根數(shù)目，改變了根系結構，單株根重增加也非常明顯。

2.4 外源NO對芹菜葉片硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的影響

硝酸鹽和亞硝酸鹽含量是食品檢測的重要理化指標，外源NO對芹菜葉片硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的影響情況見圖2。從圖2可見，噴施SNP后，收獲的芹菜葉片硝酸鹽和亞硝酸鹽含量變化不大，各處理基本處于同一水平。其中SNP 100 μmol/L處理的芹菜葉片硝酸鹽含量最低；50 μmol/L處理的亞硝酸鹽含量有所增加，但各處理間的差異均未達到顯著水平（P>0.05）。這表明噴施SNP后，芹菜硝酸鹽和亞硝酸鹽含量相對穩(wěn)定，處在安全水平之內，不會影響食用品質。

3 討論

對于綠色植物而言，光合作用非常重要，植物通過利用陽光的能量進行光合作用來獲得生長發(fā)育必需的養(yǎng)分；而葉綠素含量則是反映光合作用的重要指標。研究表明，施加外源NO可提高NaCl脅迫下番茄幼苗葉片的葉綠素含量[17，18]。本試驗通過噴施SNP提供外源NO，研究NO對芹菜生長的影響，結果表明，SNP 100 μmol/L不僅能提高芹菜葉片葉綠素含量，促進其光合作用，保證其獲得充足的營養(yǎng)，還能增加芹菜幼苗的生長量，明顯促進其株高、株重的增長。株高、株重可反映芹菜的質量和品質，是提高產量的體現(xiàn)。而SNP 200 μmol/L顯著降低了芹菜葉綠素含量，使其株高、株重等增長降低，抑制了生長，不利于芹菜的增產。

NO作為氣體信號分子，能參與植物許多生長發(fā)育過程的調控，包括促進種子萌發(fā)和側根形成[19]，有試驗表明，SNP能促進綠豆側根發(fā)生[20]，顯著促進番茄側根的生長[21]。本試驗結果表明，SNP具有明顯的雙重效應，200 μmol/L高濃度SNP具有明顯抑制根生長的作用，該處理的芹菜側根少，且根較短，扎根不深；而100 μmol/L明顯促進芹菜根的生長，增加側根的數(shù)目，有利于芹菜吸收的水分和營養(yǎng)向上運輸，而且根明顯伸長，扎根深，有利于對芹菜的支撐和固定，更多地吸收水分和營養(yǎng)。

NO也參與種子休眠和萌發(fā)調節(jié)，如外源NO可提高黑麥草種子的萌發(fā)率[22]。芹菜從播種到出苗時間相對較長，常因不良天氣等原因造成種子出苗率偏低；因此對芹菜種子進行農藝處理以提高其發(fā)芽率和發(fā)芽勢在生產中十分必要[23]。試驗用NO供體SNP處理芹菜種子，通過發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等指標來研究NO對芹菜種子萌發(fā)的影響。結果表明，用SNP 100 μmol/L浸泡種子有利于促進芹菜種子的萌發(fā)，提高萌發(fā)率，增加種子有效利用率，降低生產成本。

人體攝入的硝酸鹽80%來自于蔬菜[24]，硝酸鹽對人的直接毒害不大，但是蔬菜中的硝酸鹽在貯藏、加工、運輸、烹飪的過程中會在硝酸還原酶和微生物的作用下轉變成亞硝酸鹽，導致人畜患高鐵血紅蛋白癥；而且亞硝酸鹽還可在人和動物體內與攝入的次級胺等含氮物結合，轉化形成公認的強致癌物亞硝胺，從而誘發(fā)消化系統(tǒng)癌變[25，26]。因此，蔬菜中硝酸鹽、亞硝酸鹽含量的調控是蔬菜生產中的重要課題。試驗結果表明，外源SNP處理并未顯著影響芹菜體內硝酸鹽及亞硝酸鹽的含量，說明NO不參與芹菜體內硝酸鹽及亞硝酸鹽的調控和積累，外源SNP不會對芹菜的食用品質產生顯著影響，加之NO供體SNP本身具有穩(wěn)定性差、見光易分解等特性，因而是一種安全型的生長調節(jié)物質，可用于綠色莖葉類蔬菜的早期生產調控。

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