文瑤++周瑋++付相敏++趙筱++王金華++王永澤

摘要：以前期構(gòu)建的D-乳酸大腸桿菌（Escherichia coli）工程菌LHY02為出發(fā)菌株，通過(guò)在乳酸鹽中對(duì)菌株進(jìn)行馴化的方式來(lái)解除乳酸根對(duì)菌體的抑制作用；采用葡萄糖分批補(bǔ)加方式緩解高含量葡萄糖的阻遏效應(yīng)，擬進(jìn)一步提高大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的產(chǎn)量、生產(chǎn)強(qiáng)度和糖酸轉(zhuǎn)化率。結(jié)果表明，馴化后的菌株LHY201在16%的葡萄糖發(fā)酵中D-乳酸產(chǎn)量比馴化前提高了36.7%。LHY201結(jié)合葡萄糖進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵（補(bǔ)料方式為8%+8%+4%），乳酸產(chǎn)量、發(fā)酵時(shí)間、糖酸轉(zhuǎn)化率以及生產(chǎn)強(qiáng)度分別為185.7 g/L、48 h、93.8%、3.87 g/L/h，D-乳酸光學(xué)純度達(dá)到99.6%，相比一次性添加20%葡萄糖的分批發(fā)酵，乳酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率分別提高了21.1%和21.2%，發(fā)酵周期縮短了一半。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌工程菌；D-乳酸；馴化；補(bǔ)料發(fā)酵

中圖分類(lèi)號(hào)：Q533+.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）18-4771-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.18.035

D-乳酸作為一種重要的手性中間體，是合成多種手性物質(zhì)的前體，在醫(yī)藥、農(nóng)藥、化工及耐熱型聚乳酸合成材料等方面的應(yīng)用十分廣泛，其生產(chǎn)具有重要的實(shí)用價(jià)值。但相對(duì)于L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)而言，D-乳酸尚未實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)和應(yīng)用[1]。目前已有一些菌株能較高產(chǎn)量生產(chǎn)D-乳酸，如芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus sp. CASD）經(jīng)過(guò)發(fā)酵花生粕，D-乳酸產(chǎn)量高達(dá)207 g/L[2]；經(jīng)過(guò)工程改造的肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）能利用甘油產(chǎn)142.1 g/L的D-乳酸，原料轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.82 g/g[3]；同樣經(jīng)過(guò)工程改造的嗜堿芽孢桿菌產(chǎn)量可達(dá)143.99 g/L且生產(chǎn)強(qiáng)度可達(dá)3.04 g/L/h[4]；棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis）配合同步糖化工藝發(fā)酵新鮮的甜土豆，產(chǎn)量達(dá)到186.40 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度保持在 2.55～3.11 g/L/h[5]。

大腸桿菌具有遺傳背景清楚、營(yíng)養(yǎng)要求低等優(yōu)點(diǎn)，在D-乳酸發(fā)酵中也引起了越來(lái)越多學(xué)者的重視。借助基因敲除手段配合兩階段發(fā)酵工藝，大腸桿菌Escherichia coli B0013-050B能產(chǎn)111.9 g/L高純度的D-乳酸[6]；選用為Ca（OH）2為發(fā)酵中和劑，大腸桿菌Escherichia coli ALS974能產(chǎn)138 g/L 的D-乳酸，生產(chǎn)強(qiáng)度高達(dá)6.3 g/L/h[7]；而課題組前期構(gòu)建的一株出發(fā)菌株為Escherichia coli W的工程菌Escherichia coli HBUT-D，在6 t的發(fā)酵規(guī)模下，采用中途一次補(bǔ)料的方式，能產(chǎn)126 g/L D-乳酸，生產(chǎn)強(qiáng)度高達(dá)6 g/L/h[1]。總體來(lái)看，這些菌株發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度都較高，但大腸桿菌發(fā)酵D-乳酸的產(chǎn)量仍相對(duì)較低。

進(jìn)一步提高大腸桿菌D-乳酸發(fā)酵產(chǎn)量，需更多的發(fā)酵原料，但微生物在發(fā)酵過(guò)程往往受到發(fā)酵原料中葡萄糖的阻遏及產(chǎn)物的抑制，繼續(xù)提高發(fā)酵原料中的葡萄糖含量會(huì)造成發(fā)酵殘?zhí)沁^(guò)高，限制了D-乳酸產(chǎn)量的提升[1]；而且從前期的研究中還意識(shí)到，隨著乳酸產(chǎn)物在發(fā)酵過(guò)程中的不斷增加，產(chǎn)物乳酸根對(duì)發(fā)酵的抑制現(xiàn)象將會(huì)更明顯[8]。

因此本研究擬以前期構(gòu)建的工程菌Escherichia coli LHY02為研究出發(fā)菌株，通過(guò)在不同濃度的乳酸鹽對(duì)菌株進(jìn)行馴化，提高其對(duì)乳酸鹽的耐受性，同時(shí)通過(guò)分批補(bǔ)料的發(fā)酵方式緩解高濃度葡萄糖的阻遏效應(yīng)，最終達(dá)到進(jìn)一步提高大腸桿菌D-乳酸的發(fā)酵產(chǎn)量、生產(chǎn)強(qiáng)度及糖酸轉(zhuǎn)化率的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 試驗(yàn)所采用大腸桿菌E.coli LHY02（ΔfocA-pflB ΔfrdABCD ΔadhE ΔackA：pflBp6-acEF-lpd）由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，能高效利用葡萄糖或木糖發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸，在無(wú)氧條件下生長(zhǎng)良好，保存在-80 ℃甘油管中。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）LB平板培養(yǎng)基（g/L）。蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉5，瓊脂20，121 ℃滅菌20 min。

2）乳酸鈉馴化培養(yǎng)基。參照文獻(xiàn)[9]配置NBS培養(yǎng)基，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)添加0～14%的乳酸鈉和20 g/L的葡萄糖（單獨(dú)滅菌，滅菌條件為115 ℃滅菌30 min）。

3）發(fā)酵種子培養(yǎng)基。配置NBS培養(yǎng)基并滅菌，葡萄糖（20 g/L）單獨(dú)滅菌后加入NBS培養(yǎng)基。

4）發(fā)酵培養(yǎng)基。3 L NBS培養(yǎng)基，按試驗(yàn)需求分別添加一定量的葡萄糖。

1.2 方法

1.2.1 LHY02的耐乳酸鹽馴化 將平板上生長(zhǎng)良好的單菌落挑取4～6個(gè)接種至100 mL含有2%乳酸鈉的馴化培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基中加入20 mg左右已滅菌的CaCO3粉末），37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)代培養(yǎng)，每代測(cè)菌體生物量（OD600），當(dāng)連續(xù)數(shù)代OD600值變化較小時(shí)，按2%的接種量轉(zhuǎn)接至100 mL含4%乳酸鈉的新鮮馴化培養(yǎng)基中，繼續(xù)轉(zhuǎn)代培養(yǎng)，依此類(lèi)推，逐漸將乳酸鈉添加量提高到12%，并在此濃度下反復(fù)馴化培養(yǎng)直至OD600值趨于平穩(wěn)，對(duì)馴化后的菌株命名為L(zhǎng)HY201。

1.2.2 馴化后菌株的分批發(fā)酵 馴化前的菌株LHY02和馴化后的菌株LHY201分批發(fā)酵的操作和條件為：挑選LB平板上活化好的4～6個(gè)單菌落接發(fā)酵種子培養(yǎng)基中，150 r/min、37 ℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到1.2～1.5左右。按10%的接種量接種至裝有3 L的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵條件為：150 r/min、37 ℃，通過(guò)流加4 mol/L Ca（OH）2控制發(fā)酵液pH為7。定時(shí)取樣，檢測(cè)樣品中菌體生物量（OD600值）、殘留葡萄糖濃度、D-乳酸含量及其光學(xué)純度、副產(chǎn)物琥珀酸和乙酸等雜酸的含量。計(jì)算時(shí)，選取3次平行發(fā)酵結(jié)果作為最終發(fā)酵數(shù)據(jù)。

1.2.3 LHY201補(bǔ)料分批發(fā)酵 補(bǔ)料分批發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵參數(shù)與分批發(fā)酵一致，差異為葡萄糖的補(bǔ)加方式。采用兩種葡萄糖補(bǔ)加方式：①發(fā)酵培養(yǎng)基初始葡萄糖濃度80 g/L，當(dāng)葡萄糖濃度降至約10 g/L時(shí)，通過(guò)一次性補(bǔ)加高濃度的葡萄糖（800 g/L）； ②發(fā)酵過(guò)程中分兩次補(bǔ)加葡萄糖。發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)葡萄糖（底糖）濃度為80 g/L，當(dāng)葡萄糖濃度降至10 g/L左右時(shí)進(jìn)行補(bǔ)加，第一次補(bǔ)加高濃度葡萄糖（800 g/L）；當(dāng)葡萄糖濃度再次約降為10 g/L時(shí)補(bǔ)充至葡萄糖40 g/L。定時(shí)取樣，檢測(cè)樣品中菌體生物量（OD600值）、殘留葡萄糖濃度、D-乳酸含量及其光學(xué)純度、副產(chǎn)物琥珀酸和乙酸等雜酸的含量。計(jì)算時(shí)，選取3次平行發(fā)酵結(jié)果作為最終發(fā)酵數(shù)據(jù)。

1.2.4 發(fā)酵液的檢測(cè)

1）OD值的測(cè)定。如發(fā)酵液中無(wú)Ca（OH）2，可直接用分光光度計(jì)測(cè)量600 nm條件下的吸光度；如發(fā)酵過(guò)程中使用了Ca（OH）2中和劑，可取1 mL發(fā)酵液用3 mol/L鹽酸進(jìn)行定量稀釋后于600 nm處測(cè)吸光度（以同等稀釋的鹽酸為空白對(duì)照）。

2）發(fā)酵液中葡萄糖的測(cè)定。葡萄糖濃度采用生物傳感器進(jìn)行檢測(cè)。取1 mL發(fā)酵液，離心5 min（4 000 r/min），上清液經(jīng)去離子水稀釋100倍后測(cè)定。用 1 g/L的葡萄糖標(biāo)樣對(duì)傳感器進(jìn)行定標(biāo)后即可測(cè)定。

3）發(fā)酵液中乳酸及有機(jī)酸副產(chǎn)物乙酸、琥珀酸的測(cè)定。取1 mL發(fā)酵液經(jīng)過(guò)9 mL 2%的H2SO4處理，充分反應(yīng)后經(jīng)10 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm微濾膜過(guò)濾處理后，用液相色譜法測(cè)定乳酸及副產(chǎn)物乙酸和琥珀酸。液相色譜條件依照文獻(xiàn)[10]所描述的方法。

4）D-乳酸光學(xué)純度的測(cè)定。參照文獻(xiàn)[10]中的檢測(cè)方法檢測(cè)L-乳酸和D-乳酸含量及光學(xué)純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 LHY02耐乳酸鹽馴化的結(jié)果

大腸桿菌發(fā)酵D-乳酸的產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度往往受到如下幾個(gè)方面的影響：①大多乳酸發(fā)酵過(guò)程中容易產(chǎn)生有機(jī)酸副產(chǎn)物（如乙酸、琥珀酸），影響了產(chǎn)量和光學(xué)純度[11]；②在乳酸發(fā)酵中，代謝產(chǎn)物積累到一定濃度也會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)，表明乳酸根是抑制菌體生長(zhǎng)的主要代謝產(chǎn)物，當(dāng)乳酸達(dá)到一定濃度時(shí)，就對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用[12]。

為了解決大腸桿菌發(fā)酵D-乳酸中面臨的這些問(wèn)題，研究者們從菌種的構(gòu)建和馴化等方面著手研究，并取得了一定的成效。由于大腸桿菌遺傳背景清晰，因此借助于基因敲除技術(shù)，阻斷雜酸代謝途徑，使主產(chǎn)物D-乳酸的產(chǎn)量有了較大的提升，同時(shí)還大大提高了D-乳酸產(chǎn)物的化學(xué)純度及光學(xué)純度，目前已成功構(gòu)建一批大腸桿菌工程菌用于D-乳酸的發(fā)酵[6，7，13]。本實(shí)驗(yàn)室前期以大腸桿菌B為出發(fā)菌株，通過(guò)染色體基因敲除技術(shù)結(jié)合無(wú)氧啟動(dòng)子融合表達(dá)技術(shù)，使菌株能夠在微氧條件下良好生長(zhǎng)，從而能促進(jìn)乳酸產(chǎn)量提高。所構(gòu)建的菌株LHY02表現(xiàn)出良好的D-乳酸發(fā)酵性能[8]。但是，從前期的研究中意識(shí)到，隨著乳酸產(chǎn)物在發(fā)酵過(guò)程中的不斷增加，產(chǎn)物乳酸根對(duì)發(fā)酵的抑制現(xiàn)象將會(huì)更明顯[11]。

面對(duì)這個(gè)問(wèn)題，首先采用了馴化手段來(lái)進(jìn)一步提高大腸桿菌工程菌對(duì)乳酸的發(fā)酵能力。馴化是提高微生物對(duì)不良環(huán)境因子耐受性的一種重要手段，已有研究表明，產(chǎn)乳酸菌經(jīng)過(guò)馴化，菌株對(duì)產(chǎn)物乳酸的耐受性顯著提高，經(jīng)過(guò)馴化的菌株生物量提升了18%[14]。

因此在大腸桿菌傳代時(shí)，逐步提高乳酸鈉的含量，來(lái)改善大腸桿菌LHY02對(duì)乳酸根的耐受性。從表1的結(jié)果來(lái)看，經(jīng)過(guò)22代馴化后得到的菌株LHY201，其在12%乳酸鹽條件下培養(yǎng)所得OD600 nm為0.37，較馴化前數(shù)值有較大的降低。但相對(duì)一些在乳酸根含量超過(guò)10%就完全不能生長(zhǎng)的產(chǎn)乳酸的菌株[15]，LHY201仍表現(xiàn)出較好的生長(zhǎng)性能。

2.2 馴化后菌株分批發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的效果

為了進(jìn)一步考察乳酸根對(duì)菌株的馴化效果，以馴化前的菌株LHY02為對(duì)照，考察了LHY201在含16%高濃度葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中的發(fā)酵效果。發(fā)酵罐中菌體生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖1。由圖1可知，菌株LHY02和LHY201最大OD600 nm分別達(dá)到2.84和5.04。經(jīng)過(guò)馴化，菌體OD600 nm提高了77.5%，表明馴化后菌株LHY201在發(fā)酵時(shí)擁有較好的生長(zhǎng)性能。

乳酸的產(chǎn)量與發(fā)酵菌體的生長(zhǎng)有著密切的關(guān)系[15]。馴化后的生物量提高，會(huì)反映到產(chǎn)物生成和底物的消耗上。從圖1可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵到56 h， LHY201乳酸產(chǎn)量達(dá)到138.1 g/L，相對(duì)于出發(fā)菌株LHY02產(chǎn)量（101.0 g/L）提高了36.7%。同時(shí)葡萄糖的消耗也隨之增加，殘?zhí)橇恳灿兴档?，馴化前菌株發(fā)酵殘?zhí)菫?1.2 g/L，馴化后的菌株發(fā)酵時(shí)殘?zhí)墙禐?3.3 g/L。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證LHY201的發(fā)酵性能，對(duì)其在不同濃度的葡萄糖（8%、16%、20%）條件下進(jìn)行了分批發(fā)酵（表2）。LHY201利用8%的葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)98.3%，發(fā)酵在26 h結(jié)束，未檢測(cè)到殘?zhí)?。初糖濃度提高?6%時(shí)，由于添加Ca（OH）2的原因，發(fā)酵液終體積達(dá)到3.51 L，測(cè)得乳酸118.0 g/L，按稀釋率換算乳酸產(chǎn)量138.1 g/L；葡萄糖濃度進(jìn)一步提高到20%時(shí)，發(fā)酵液體積達(dá)到3.62 L，測(cè)得乳酸為127.0 g/L，按稀釋率最終換算得乳酸產(chǎn)量為153.3 g/L。相比8%的初糖，葡萄糖提高到16%和20%時(shí)，乳酸產(chǎn)量明顯增加，但是糖酸轉(zhuǎn)化率有所下降，分別為86.4%和77.4%，發(fā)酵周期長(zhǎng)且均有一定量的殘?zhí)钱a(chǎn)生。

2.3 馴化后的菌株LHY201的補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸

進(jìn)一步提高大腸桿菌D-乳酸發(fā)酵產(chǎn)量，需要高濃度的葡萄糖原料，但是，發(fā)酵過(guò)程中，高濃度的葡萄糖會(huì)產(chǎn)生阻遏效應(yīng)，使菌體無(wú)法利用碳源而導(dǎo)致發(fā)酵停滯[16]。同時(shí)，高濃度的葡萄糖會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液滲透壓過(guò)高而影響菌體生長(zhǎng)，如在培養(yǎng)基中一次性添加10%的葡萄糖，就發(fā)現(xiàn)菌體的生長(zhǎng)和乳酸發(fā)酵能力受到明顯地抑制[9]。

補(bǔ)料發(fā)酵能部分解除葡萄糖阻遏效應(yīng)，更是一種常用的提高微生物發(fā)酵產(chǎn)量及生產(chǎn)強(qiáng)度的手段[17]。目前D-乳酸發(fā)酵產(chǎn)量較高的報(bào)道中，幾乎都采用了補(bǔ)料發(fā)酵的辦法。如芽孢乳桿菌Sporolactobacillus sp. CASD經(jīng)過(guò)發(fā)酵花生粕，D-乳酸產(chǎn)量高達(dá)207 g/L[2]，研究者探索了多次補(bǔ)料和單次補(bǔ)料產(chǎn)D-乳酸效果，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程中多次補(bǔ)料相對(duì)于單次補(bǔ)料，D-乳酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度較高而糖酸轉(zhuǎn)化率較低；同樣經(jīng)過(guò)工程改造的嗜堿芽孢桿菌發(fā)酵D-乳酸時(shí)，其主要補(bǔ)料方式為加入8%的葡萄糖作為底糖，然后當(dāng)發(fā)酵液殘?zhí)堑陀?0 g/L時(shí)流加高濃度的葡萄糖，產(chǎn)量可達(dá)143.99 g/L且生產(chǎn)強(qiáng)度可達(dá)3.04 g/L/h[4]。課題組前期構(gòu)建的大腸桿菌工程菌在6 t的發(fā)酵規(guī)模下，采用中途一次補(bǔ)料的方式（8%的葡萄糖作為底糖，補(bǔ)加5%的葡萄糖），能產(chǎn)126 g/L D-乳酸，生產(chǎn)強(qiáng)度高達(dá)6 g/L/h[1]。

在馴化菌株的基礎(chǔ)上，嘗試用補(bǔ)料分批發(fā)酵的方法來(lái)進(jìn)一步提高乳酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率，并對(duì)分批發(fā)酵及補(bǔ)料分批發(fā)酵進(jìn)行了對(duì)比。補(bǔ)料發(fā)酵中采用較低的初糖濃度（80 g/L），菌體能很快適應(yīng)環(huán)境，提前進(jìn)入產(chǎn)酸期；發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛认陆抵?0 g/L左右時(shí)進(jìn)行補(bǔ)加葡萄糖。具體補(bǔ)加葡萄糖方式為：8%+8%和8%+8%+4%。

采用8%+8%的葡萄糖添加方式進(jìn)行發(fā)酵（圖2），發(fā)酵到24 h還剩殘?zhí)?.21 g/L，此時(shí)補(bǔ)加葡萄糖80 g/L。發(fā)酵到38 h葡萄糖完全耗盡，最終發(fā)酵液體積達(dá)3.97 L，此時(shí)測(cè)得乳酸產(chǎn)量為115.3 g/L，折算稀釋率，換算得乳酸最終產(chǎn)量為152.6 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)95.4%，生產(chǎn)強(qiáng)度4.02 g/L/h。從圖2中還可以看到發(fā)酵副產(chǎn)物琥珀酸和乙酸分別為1.49 g/L、3.06 g/L，含量相對(duì)較小。

采用8%+8%+4%的葡萄糖添加方式（圖3），分兩次補(bǔ)加葡萄糖，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程歷時(shí)48 h，糖酸轉(zhuǎn)化率為93.8%，導(dǎo)致的發(fā)酵液最終體積達(dá)到4.35 L，測(cè)得乳酸產(chǎn)量為128.1 g/L，根據(jù)稀釋率換算得乳酸最終產(chǎn)量為185.7 g/L。發(fā)酵副產(chǎn)物乙酸和琥珀酸分別為5.41 g/L和3.76 g/L。

從表3可以看出，相比分批發(fā)酵，補(bǔ)料分批發(fā)酵縮短了發(fā)酵時(shí)間，發(fā)酵結(jié)束后未檢測(cè)到殘?zhí)恰２捎醚a(bǔ)料方式為8%+8%進(jìn)行葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵，發(fā)酵38 h，產(chǎn)乳酸152.6 g/L，相比一次性添加16%的葡萄糖，乳酸產(chǎn)量提高了10.5%，發(fā)酵周期縮短了18 h，糖酸轉(zhuǎn)化率增加了10.4%。采用補(bǔ)料方式為8%+8%+4%進(jìn)行葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵，乳酸產(chǎn)量為185.7 g/L，相比一次性添加20%葡萄糖的分批發(fā)酵，乳酸產(chǎn)量提高了21.1%，發(fā)酵周期縮短了一半，糖酸轉(zhuǎn)化率增加了21.2%?？梢?jiàn)，通過(guò)補(bǔ)料發(fā)酵不但D-乳酸發(fā)酵產(chǎn)量提高，還可解決分批發(fā)酵中殘?zhí)嵌嗉疤撬徂D(zhuǎn)化率不高的問(wèn)題。

3 小結(jié)

經(jīng)過(guò)高含量（12%）乳酸鈉的馴化，可獲得對(duì)乳酸鹽有較好耐性的菌株（LHY201），其生物量相對(duì)于出發(fā)菌株（LHY02）提高了77.5%。作為生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成同步的發(fā)酵類(lèi)型，馴化菌株LHY201表現(xiàn)出了較好產(chǎn)D-乳酸性能。利用16%葡萄糖進(jìn)行分批發(fā)酵時(shí)，乳酸產(chǎn)量達(dá)到138.1 g/L，相對(duì)于出發(fā)菌株LHY02產(chǎn)量提高了36.7%。

相比分批發(fā)酵，補(bǔ)料分批發(fā)酵大大縮短了發(fā)酵時(shí)間，且D-乳酸發(fā)酵產(chǎn)量、生產(chǎn)強(qiáng)度及糖酸轉(zhuǎn)化率都相應(yīng)提高。采用補(bǔ)料方式為8%+8%進(jìn)行葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵，發(fā)酵38 h，產(chǎn)乳酸152.6 g/L，相比一次性添加16%的葡萄糖，乳酸產(chǎn)量提高了10.5%，發(fā)酵周期縮短了18 h，糖酸轉(zhuǎn)化率增加了10.4%。采用補(bǔ)料方式為8%+8%+4%進(jìn)行葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵，乳酸產(chǎn)量為185.7 g/L，相比一次性添加20%葡萄糖的分批發(fā)酵，乳酸產(chǎn)量提高了21.1%，發(fā)酵周期縮短了一半，糖酸轉(zhuǎn)化率增加了21.2%。

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