申麗婕++于月華++劉娜++梁承娟++汪曉東++谷月好++崔雪++張振清++倪志勇

摘要：以擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組DNA為材料，根據(jù)GenBank中擬南芥rd29A啟動子序列設(shè)計引物，采用PCR克隆一段長度為951 bp的rd29A啟動子序列。采用PlantCARE啟動子在線預(yù)測工具分析表明，rd29A啟動子序列具有TATA-box、CAAT-box基本的順式作用元件和1個脫落酸應(yīng)答元件（ABRE）和2個脫水應(yīng)答調(diào)控元件（DRE）。將rd29A啟動子序列亞克隆到pcambia3301載體的多克隆位點，構(gòu)建了由rd29A啟動子驅(qū)動的植物表達(dá)載體。

關(guān)鍵詞：擬南芥（Arabidopsis thaliana）；rd29A；啟動子；植物表達(dá)載體

中圖分類號：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）18-4824-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.18.049

干旱、鹽堿和極端溫度等非生物脅迫嚴(yán)重影響植物的生長和發(fā)育，造成作物減產(chǎn)甚至絕收[1，2]。目前，利用基因工程方法改良植物的抗逆性是一種高效的方法[3-5]。許多基因參與植物對非生物脅迫的應(yīng)答，其中轉(zhuǎn)錄因子因其在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要的作用，成為抗逆轉(zhuǎn)基因育種的重要候選基因資源[6]。然而，在正常的條件下，某些非生物脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子的過量表達(dá)，有可能導(dǎo)致植株生長緩慢[7-10]。利用非生物逆境誘導(dǎo)啟動子驅(qū)動抗逆基因的表達(dá)是解決上述問題的一個方法。擬南芥（Arabidopsis thaliana） rd29A啟動子受干旱、高鹽和低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，在抗逆轉(zhuǎn)基因育種中應(yīng)用十分廣泛[11-13]。例如，rd29A啟動子驅(qū)動擬南芥AtNHX1基因轉(zhuǎn)化煙草，鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草相比野生型根發(fā)生能力和生長勢顯著提高且葉片丙二醛含量降低[14]。低溫脅迫下，轉(zhuǎn)rd29A-ICE1基因的水稻相比對照的脯氨酸含量和存活率明顯提高，丙二醛含量積累速率明顯下降，增強了對低溫脅迫的忍耐能力[15]。為了便于采用rd29A啟動子驅(qū)動抗逆基因的表達(dá)，本研究根據(jù)GenBank中擬南芥rd29A序列設(shè)計引物，從擬南芥葉片基因組DNA中克隆了rd29A啟動子序列，并亞克隆至植物表達(dá)載體pcambia3301的多克隆位點處，為進(jìn)一步利用誘導(dǎo)型啟動子rd29A奠定試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 擬南芥Col-0生態(tài)型種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所作物種質(zhì)資源中心抗逆研究課題組提供。

1.1.2 試劑與藥品 大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞、植物基因組DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；TransStartTM Taq DNA Polymerase購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；快速限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ，T4 DNA連接酶購于Fermentas公司；植物表達(dá)載體pcambia3301為新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室保存；其他化學(xué)藥品為國產(chǎn)分析純。引物和測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥葉片基因組DNA的提取 使用植物基因組試劑盒提取擬南芥葉片基因組DNA，采用1%的瓊脂糖凝膠檢測DNA的完整性。

1.2.2 rd29A啟動子克隆及載體構(gòu)建 根據(jù)GenBank中rd29A的啟動子序列（GenBank登錄號為：D13044）設(shè)計帶有酶切位點的引物nrd29A-F： 5′-TTTAAGCTTGATGGAGGAGCCATAGATGC-3′和

nrd29A-R：5′-ATAGGATCCTTTCCAAAGATTTTTTT

CTTTCCA-3′（下劃線分別表示Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切位點），以擬南芥葉片DNA作為模板，使用TransStartTM Taq DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴增，按照說明書中推薦的PCR體系和反應(yīng)程序進(jìn)行擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳檢測后，切膠回收，使用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切rd29A啟動子序列和pcambia3301載體，將rd29A啟動子序列亞克隆至pcambia3301載體的多克隆位點處，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將陽性克隆送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序鑒定。

1.2.3 rd29A啟動子序列分析 利用DNAMAN軟件比對測序序列與GenBank中rd29A的啟動子序列的一致性。在PlantCARE網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）在線分析rd29A啟動子區(qū)域存在的可能的基本啟動子元件和順式作用元件。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬南芥rd29A啟動子的克隆

根據(jù)GenBank中擬南芥rd29A啟動子序列設(shè)計引物，采用PCR方法從擬南芥葉片基因組DNA中擴增獲得大小為951 bp的片段（圖1）。測序結(jié)果表明，擴增得到的rd29A啟動子序列與GenBank中的序列一致性達(dá)到99.47%，說明克隆的序列為擬南芥rd29A啟動子序列。

2.2 擬南芥rd29A啟動子植物表達(dá)載體構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切獲得951 bp的rd29A啟動子序列，將其連接到植物表達(dá)載體pcambia3301的多克隆位點處，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，挑取陽性克隆，對重組質(zhì)粒菌液進(jìn)行PCR檢測，獲得大小為951 bp的擴增片段（圖2），經(jīng)測序驗證后，表明已經(jīng)成功地將擬南芥的rd29A啟動子亞克隆至植物表達(dá)載體pcambia3301。

2.3 rd29A啟動子序列分析

使用PlantCARE網(wǎng)站分析rd29A啟動子區(qū)域存在的順式作用元件，分析發(fā)現(xiàn)rd29A啟動子含有TATA-box和CAAT-box基本啟動子元件，1個脫落酸應(yīng)答元件（ABRE）和2個脫水應(yīng)答調(diào)控元件（DRE）（圖3），分析結(jié)果表明，克隆的擬南芥rd29A啟動子具有逆境誘導(dǎo)啟動子的特征。

3 小結(jié)與討論

本研究從擬南芥葉片基因組DNA中克隆了逆境誘導(dǎo)型啟動子rd29A，與GenBank中的擬南芥rd29A序列（D13044）比對發(fā)現(xiàn)兩者的一致性為99.47%，DRE和ABRE元件兩者完全一致。產(chǎn)生序列差異的原因有可能是由于使用的聚合酶保真性不高。李新玲等[12]克隆的rd29A片段與D13044有99%的一致性；楊春霞等[13]克隆的rd29A啟動子與NCBI上已報道rd29A的啟動子（AY973635）有99.64%的一致性。許多報道已經(jīng)表明位于DRE和ABRE元件之外的突變核苷酸并不影響rd29A啟動子的活性[12，13，16]，因此可以推斷本研究克隆的rd29A啟動子具有誘導(dǎo)活性。本研究將rd29A啟動子亞克隆至植物表達(dá)載體pcambia3301的多克隆位點處，為利用rd29A啟動子驅(qū)動抗逆基因的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] NI Z Y，HU Z，JIANG Q Y，et al. GmNFYA3， a target gene of miR169， is a positive regulator of plant tolerance to drought stress[J]. Plant Mol Biol，2013，82：113-129.

[2] 倪志勇，徐兆師，李連城，等.DREB轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境脅迫中的作用機理及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].麥類作物學(xué)報，2008，28（6）：1100-1106.

[3] NI Z Y，HU Z，JIANG Q Y，et al. Overexpression of gma-MIR394a confers tolerance to drought in transgenic Arabidopsis thaliana[J].Biochem Bioph Res Co，2012，427（2）：330-335.

[4] XU Z S，NI Z Y，LI Z Y，et al. Isolation and functional characterization of HvDREB1-a gene encoding a dehydration-responsive element binding protein in Hordeum vulgare[J].Journal of Plant Research，2009，122（1）：121-130.

[5] XU Z S，NI Z Y，LIU L， et al. Characterization of the TaAIDFa gene encoding a CRT/DRE-binding factor responsive to drought，high-salt，and cold stress in wheat[J].Molecular Genetics and Genomics，2008，280（6）：497-508.

[6] 于月華，張躍強，倪志勇，等.小麥DREB基因的克隆及植物表達(dá)載體構(gòu)建[J]，湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（12）：2925-2927.

[7] KASUGA M，LIU Q，MIURA S，et al. Improving plant drought， salt， and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor[J].Nat Biotechnol，1999，17：287-291.

[8] HSIEH T H，LEE J T，CHARNG Y Y，et al. Tomato plants ectopically expressing Arabidopsis CBF1 show enhanced resistance to water deficit stress[J].Plant Physiol，2002，130（2）： 618-626.

[9] LEE J T，PRASAD V，YANG P T， et al. Expression of Arabidopsis CBF1 regulated by an ABA/stress inducible promoter in transgenic tomato confers stress tolerance without affecting yield[J].Plant Cell Environ，2003，26（7）：1181-1190.

[10] NAKASHIMA K，TRAN L S，VAN NGUYEN D，et al. Functional analysis of a NAC-type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stress-responsive gene expression in rice[J]. Plant J，2007，51（4）：617-630.

[11] 李 雙，石 君，張秀海，等.逆境誘導(dǎo)型啟動子rd29A誘導(dǎo)ipt基因轉(zhuǎn)化煙草的研究[J].分子植物育種，2011，9（1）：51-56.

[12] 李新玲，楊傳平，曲 敏，等.rd29A啟動子的克隆及提高煙草抗逆性的研究[J].分子植物育種，2007，5（1）：37-42.

[13] 楊春霞，陳 英，黃敏仁，等.擬南芥逆境誘導(dǎo)型啟動子rd29A的克隆及活性檢測[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2008， 32（1）：6-10.

[14] 張俊蓮，王 麗，秦舒浩，等.利用擬南芥rd29A啟動子驅(qū)動AtNHX1基因提高煙草耐鹽性[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2011， 19（4）：669-676.

[15] 王北艷，殷奎德.轉(zhuǎn)rd29A-ICE1冷誘導(dǎo)基因水稻提高抗寒性研究[J].核農(nóng)學(xué)報，2013，27（6）：731-735.

[16] 齊恩芳，賈小霞，馬 勝，等.擬南芥誘導(dǎo)型啟動子rd29A的克隆及其功能鑒定[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2015，33（4）：286-290.