徐多麒+張蕾萍+王繼芬+黃健+郭震+林寬

摘要 建立了全血中扎來普隆及其代謝產(chǎn)物5-氧扎來普隆和脫乙基扎來普隆超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜（UPLC-TQ/MS）快速檢驗(yàn)方法。采用改良后的QuEChERS前處理方法，全血樣品用0.1%甲酸-乙腈提取，經(jīng)無水MgSO4脫水凈化，Waters BEH C18色譜柱分離，0.1%甲酸和0.1%甲酸-乙腈進(jìn)行梯度洗脫。采用電噴霧電離，正離子（ESI+）模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式檢測(cè)。扎來普隆及其代謝產(chǎn)物在0.5～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2≥0.997），回收率為92.0%～100.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～5.3%，方法檢出限（S/N=3）均為0.05 ng/mL，定量限（S/N=10）在0.1～0.5 ng/mL范圍內(nèi)。

關(guān)鍵詞 扎來普隆；5-氧扎來普?。幻撘一鷣砥章。籕uEChERS方法；超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

2016-01-13 收稿 ；2016-04-14接受

本文系公安部重點(diǎn)研究計(jì)劃項(xiàng)目（No.201302ZDYJ002）、公安技術(shù)交流培訓(xùn)計(jì)劃項(xiàng)目（No.B2014004A）和2015年北京市教委科學(xué)研究與研究生共建項(xiàng)目資助

E-mail：zlpbjft@sohu.com ，wangjifen58@126.com

1 引 言

扎來普?。╖aleplon）又名曲寧，化學(xué)名稱為3-[3-氰基吡唑（1，5-a）并嘧啶-7]-N-乙基乙酰苯胺，分子式為C17H15N5O。扎來普隆為新一代非苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥的代表，與苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥相比，具有高效、低毒、成癮性小等特點(diǎn)，并且半衰期短，不會(huì)產(chǎn)生次日的宿醉現(xiàn)象。該藥上市后得到廣泛認(rèn)可，目前已廣泛用于治療失眠癥。但與此同時(shí)，有不法分子利用此類藥物實(shí)施麻醉搶劫、迷奸、毒駕等犯罪行為，也有將該類藥物與其它毒品混合使用的案件發(fā)生[1，2]。扎來普隆主要在肝臟經(jīng)醛氧化酶作用形成5-氧扎來普隆，少數(shù)經(jīng)CYP3A4作用形成脫乙基扎來普?。▓D1）[3]。單劑量服用扎來普隆，口服吸收快，代謝迅速，活性代謝物濃度低，且化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定[4，5]。因此，在刑事案件中，對(duì)扎來普隆原藥及其代謝物同時(shí)定性與定量檢測(cè)，有利于還原案件客觀情況。目前檢測(cè)生物樣品中扎來普隆原體的方法主要有氣相色譜法[6]、液相色譜法[7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9～11]。但還未見同時(shí)檢測(cè)扎來普隆及其兩種代謝產(chǎn)物的報(bào)道。因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便、高靈敏度的分析方法具有重要意義。

2002年，Anastassiades 等[12]首次提出了QuEChERS快速樣品前處理方法，因其具有快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效、可靠及安全（Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged and Safe）的特點(diǎn)而迅速成為研究熱點(diǎn)[13]。QuEChERS前處理技術(shù)多用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)[14～16]、臨床醫(yī)學(xué)[17]、獸藥及醫(yī)藥殘留[18]等領(lǐng)域。在法庭科學(xué)中應(yīng)用鮮見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用QuEChERS 前處理方法并進(jìn)行了改進(jìn)，超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行檢測(cè)，建立了同時(shí)檢測(cè)全血中扎來普隆及其兩種代謝產(chǎn)物5-氧扎來普隆和脫乙基扎來普隆QuEChERS- UPLC-TQ/MS方法。在30 s內(nèi)可以完成樣品的測(cè)定，滿足了辦案中快速準(zhǔn)確獲得定性與定量分析數(shù)據(jù)的要求。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Shimadzu 30A-LC超高效液相色譜儀和Shimadzu 30A 自動(dòng)進(jìn)樣器（日本 Shimadzu 公司）；API 5500 QTrap三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex公司）；Milli-Q去離子水發(fā)生器（美國(guó)Millipore 公司）；Eyela Cute Mixer CM100高速振蕩器（日本Eyela公司）；高速離心機(jī)（美國(guó)Thero公司）；96孔去磷酯板ISOLUTE PLD+ 50mg 96孔板（瑞典Biotage公司）；PSA萃取柱SEP-Pak Vac PSA 1mL（Waters公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品： 扎來普隆、5-氧-扎來普隆、脫乙基扎來普隆（加拿大Toronto公司）；乙腈、0.1%甲酸-乙腈、甲酸、乙醇（色譜純，Thermo Fisher公司）；無水Na2SO4（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無水MgSO4（分析純，北京百靈威科技有限公司）?？瞻籽獦尤∽员本?fù)興醫(yī)院。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備： 分別準(zhǔn)確稱取10 mg（精確到0.01 mg）的扎來普隆、5-氧扎來普隆、脫乙基扎來普隆標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容至10 mL，配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別吸取適量單標(biāo)儲(chǔ)備液，用乙腈逐級(jí)稀釋為1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，密封，于 10℃保存。使用前，用乙腈稀釋至所需要的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.2 樣品制備

取0.5 mL空白血液樣品置于15 mL塑料離心管中，添加200 μL混合標(biāo)準(zhǔn)品，振蕩10 s，混勻后加入300 mg無水MgSO4，并加入1.3 mL 0.1%甲酸-乙腈，振蕩5 min，充分混勻。使用離心機(jī)8000 r/min離心10 min。取部分上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)膜過濾，濾液供UPLC-MS/MS分析。

2.3 檢測(cè)條件

2.3.1 超高效液相色譜條件 選用Waters ACQUITY UPLC BEH C18（150 mm× 2.1 mm，1.7 μm）色譜柱； 柱溫40℃； 進(jìn)樣量1 μL； 0.1%甲酸（A相）和0.1%甲酸-乙腈（B相）作為流動(dòng)相，流速0.4 mL/min。采用4 min梯度洗脫模式： 0～0.5 min，10% B； 0.5～0.51 min，10%～50% B； 0.51～1.6 min， 50% B； 1.6～1.7 min，50%～10% B； 1.7～4.0 min， 10% B。

2.3.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源正離子掃描模式（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式（MRM）； 離子源電壓（IS）： 5500 V； 源溫度（TEM）： 600℃； 氣簾氣（CUR）： 0.20 MPa； 噴霧氣（GSI）： 0.38 MPa； 輔助氣（GS2）： 0.34 MPa； 碰撞氣（CAD）： High。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

比較了Waters ACQUITY UPLC BEH C18（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）和ZORBAX Eclipse PlusC18（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）兩種色譜柱，前者對(duì)目標(biāo)物分離效果更好，且呈現(xiàn)更好的峰形，因此選用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱。

從選擇性、分離效果及靈敏度角度考慮，流動(dòng)相的有機(jī)相選擇乙腈比甲醇更理想。從目標(biāo)物分子結(jié)構(gòu)分析，目標(biāo)物具有氰基，能夠電離吸收電子。流動(dòng)相中加入適當(dāng)甲酸，可以提高離子化效率。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)表明，使用水（A）和乙腈（B）作為流動(dòng)相，3種目標(biāo)物保留時(shí)間集中，無法分離。使用0.1%甲酸（V/V）（A）和0.1%甲酸-乙腈（V/V）（B）作為流動(dòng)相，扎來普隆及其兩種代謝產(chǎn)物可以實(shí)現(xiàn)很好的分離（圖2）。

比較了3種洗梯度脫程序?qū)δ繕?biāo)的分離效果： （1） 0～1.0 min， 10% B； 1.0～1.1 min， 10%～90% B； 1.1～2.0 min， 90% B； 2.0～2.1 min， 90%～10% B； 2.1.0～4.0 min， 10% B。（2） 0～1.0 min， 10% B； 1.0～1.1 min， 10%～50% B； 1.1～2.0 min， 50% B； 2.0～2.1 min， 50%～10% B； 2.1～4.0 min， 10% B。（3） 0～0.5 min， 10% B； 0.5～0.51 min， 10%～50% B； 0.51～1.6 min， 50% B； 1.6～1.7 min， 50%～10% B； 1.7～4 min， 10% B。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，第3種洗脫程序?qū)δ繕?biāo)物的分離效果最佳。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

選擇ESI+電離模式，使用注射針泵分別注入扎來普隆及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)品。在m/z 100～350范圍內(nèi)進(jìn)行母離子掃描，在一級(jí)全掃描質(zhì)譜中得到母離子質(zhì)量數(shù) +。調(diào)節(jié)儀器參數(shù)，選擇+作為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜裂解分析，不斷增加碰撞能，子離子碎片逐漸增多。最終選定強(qiáng)度最高的兩對(duì)子離子與母離子組成兩對(duì)離子對(duì)，作為定性分析離子，并以最強(qiáng)的離子對(duì)作為定量分析離子。同時(shí)，對(duì)去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，在選定的條件下，扎來普隆及其代謝產(chǎn)物均有良好的色譜峰（表1）。

3.3 前處理提取溶劑的優(yōu)化

基質(zhì)效應(yīng)是指在樣品測(cè)定過程中，待測(cè)物以外的其它物質(zhì)直接或間接影響待測(cè)物響應(yīng)的現(xiàn)象[19]。隨著QuEChERS方法應(yīng)用范圍拓寬，實(shí)驗(yàn)人員可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況對(duì)樣品提取溶劑[20]、樣品凈化過程[21]、提取液濃縮過程[22]等進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到降低基質(zhì)效應(yīng)的作用。血液樣品中基質(zhì)成分非常復(fù)雜，主要是內(nèi)源性的磷脂、脂肪、膽固醇、甘油三酯和蛋白質(zhì)[23，24]。為避免復(fù)雜的基質(zhì)成分在液質(zhì)檢測(cè)中產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，影響定量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)選用有機(jī)溶劑提取。根據(jù)文獻(xiàn) [24] 報(bào)道，甲酸可沉淀蛋白質(zhì)和脂肪。本研究發(fā)現(xiàn)，在有機(jī)溶劑中添加適量甲酸（0.1%， V/V）可提高蛋白沉淀效果。因此優(yōu)化前處理?xiàng)l件后，選擇0.1%甲酸-乙腈（V/V）作為提取溶劑

為避免緩沖鹽對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)造成基質(zhì)效應(yīng)，在提取過程中未使用緩沖溶液。實(shí)驗(yàn)選用無水MgSO4作為脫水用鹽，同時(shí)對(duì)比無水Na2SO4脫水效果。結(jié)果表明，Na2SO4遇水易板結(jié)，不易在血液中充分混勻，與文獻(xiàn)[25]一致。

3.4 前處理凈化方法的優(yōu)化

樣品凈化的目標(biāo)是要盡可能除去生物樣品中的雜質(zhì)，同時(shí)最大限度保留目標(biāo)物，降低基質(zhì)效應(yīng)的同時(shí)，保證較高回收率。

考察了3種凈化方法： 方法（1）為傳統(tǒng)QuEChERS方法，將離心后的提取液過PSA（乙二胺-N-丙基）固相萃取柱，并用0.1%甲酸-乙腈洗脫、定容。PSA用于去除有機(jī)酸、酚類和少量的色素等，在農(nóng)殘檢測(cè)中有效消除有機(jī)酸和色素等干擾，從而降低了基質(zhì)效應(yīng)； 方法（2）是將離心后的提取液過96 孔去磷酯板 ISOLUTE PLD，以便有效除去血液中磷脂成分，從而降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響； 方法（3）為省略凈化過程，將離心后的提取液直接經(jīng)0.22 μm有機(jī)膜過濾，濾液供LC/MS分析。

采用國(guó)際上通行的 Matuszewski方法[26]，比較不同條件下的峰面積平均值?？疾旎|(zhì)效應(yīng)（ME）和回收率（RE）。

A組： 標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣分析所得峰面積； B組： 經(jīng)前處理方法提取后添加標(biāo)準(zhǔn)品溶液樣品，分析所得峰面積； C組： 全血中加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液后經(jīng)前處理方法提取所得峰面積。

3種凈化方法對(duì)目標(biāo)物的回收率及基質(zhì)效應(yīng)的影響見圖3。結(jié)果表明，3種前處理方法均有效降低了基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)回收率均達(dá)到90%以上，均滿足實(shí)際辦案要求。綜合考慮，方法（3）的回收率最高，同時(shí)簡(jiǎn)化了凈化過程，一步完成萃取凈化，節(jié)省了時(shí)間，減少了耗材。因此，本實(shí)驗(yàn)選用第3種凈化方法。

3.5 方法評(píng)價(jià)

3.5.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限 在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行方法學(xué)的考察。取空白全血5份各0.5 mL。分別配制成0.5， 1.0， 5.0， 10， 50和100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品。按2.3節(jié)方法進(jìn)行前處理后，再進(jìn)行儀器分析。以不同濃度目標(biāo)物的峰面積進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明，扎來普隆及其代謝產(chǎn)物在0.5～100 ng/mL范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9975～0.9987，以3倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的添加水平作為檢出限（LOD），10倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的添加作為定量限（LOQ），結(jié)果見表2。

3.5.2 方法回收率和精密度 方法采用空白血樣添加標(biāo)準(zhǔn)混合目標(biāo)物方式，在空白血樣中分別添加0.5， 5和50 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度血樣平行配制3份樣品， 按照2.3節(jié)的方法進(jìn)行處理。通過對(duì)比峰面積計(jì)算回收率（見表3），結(jié)果令人滿意。

4 結(jié) 論

采用QuEChERS方法處理樣品，以超高效液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)血液中的扎來普隆及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。通過對(duì)色譜、質(zhì)譜條件和前處理方法的優(yōu)化，建立了同時(shí)檢測(cè)全血中扎來普隆及其代謝產(chǎn)物5-氧扎來普隆和脫乙基扎來普隆QuEChERS-UPLC-TQ/MS分析方法。優(yōu)化的QuEChERS前處理方法綜合了除蛋白方法簡(jiǎn)便快速和固相萃取方法低基質(zhì)效應(yīng)的優(yōu)勢(shì)，在有效降低基質(zhì)效應(yīng)的同時(shí)，保證了較高的回收率。本方法快速靈敏、回收率高，能夠滿足實(shí)際辦案的需求。

References

1 Gunja N. Journal of Medical Toxicology， 2013， 9（2）： 155-162

2 Moore K A， Zemrus T L， Ramcharitar V， Levine B， Fowler D R. Forensic Science International， 2003， 134（2-3）： 120-122

3 WEN Yu-Guan， MA Cui， QIU Chang， HOU Jing， LU Xin-Qiao. Pharmaceutical Journal of Chinese People′s Liberation Army， 2004， 20（1）： 24-26

溫預(yù)關(guān)， 馬 崔， 邱 暢， 侯 靜， 陸欣喬. 解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2004， 20（1）： 24-26

4 Weitzel K W， Wickman J M， Augustin S G， Strom J G. Clinical Therapeutics， 2000， 22（11）： 1254-1267

5 Beer B， Ieni J R， Wu WH， Clody D， Amorusi P， Rose J， Mant T， Gaudreault J， Cato A， Stern W. J. Clin. Pharmacol.， 1994， 34（4）： 335-344

6 ZHANG Lei-Ping， YU Zhong-Shan， HE Yi， CHANG Jing. Forensic Science and Technology， 2011， （1）： 13-15

張蕾萍， 于忠山， 何 毅， 常 靖. 刑事技術(shù)， 2011， （1）： 13-15

7 DENG Ming， ZHANG Su-Fen， LIU Jian-Fang， LIU Hui-Chen. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis， 2004， 24（6）： 611-613

鄧 鳴， 張素芬， 劉建芳， 劉會(huì)臣. 藥物分析雜志， 2004， 24（6）： 611-613

8 Karlonas N， Ramanavicius A， Ramanaviciene A. J. Sep. Sci.， 2014， 37（5）： 551-557

9 Montenarh D， Hopf M， Maurer H H， Schmidt P， Ewald A H. Biotechnol. Pro.， 2014， 406（3）： 803-818

10 ZHANG Lei-Ping， HUANG Shuang， SHU Cui-Xia. Forensic Science and Technolog， 2015， 40（1）： 122-126

張蕾萍， 黃 霜， 舒翠霞. 刑事技術(shù)， 2015， 40（1）： 122-126

11 MA Ren-Ling， ZHOU Hong-Hua， LIU Wen-Hua， ZHANG Xi-Yue， FAN Yu. Journal of China Pharmaceutical University， 2003， 34（4）： 330-333

馬仁玲， 周紅華， 劉文華， 張曦岳， 范 瑜. 中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2003， 34（4）： 330-333

12 Anastassiades M， Lehotay S J， Stajnbaher D， Schenck F J. J. AOAC Int.， 2003， 86（2）： 412-431

13 LIU Man-Man， KANG Shu， YAO Cheng. Chinese Journal of Pesticide Science， 2013， 15（1）： 8-22

劉滿滿， 康 澍， 姚 成. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 15（1）： 8-22

14 DONG Mao-Feng， BAI Bing， TANG Hong-Xia， WANG Wei-Min， ZHAO Zhi-Hui， HAN Zheng， SONG Wei-Guo. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（5）： 663-668

董茂鋒， 白 冰， 唐紅霞， 王偉民， 趙志輝， 韓 錚， 宋衛(wèi)國(guó). 分析化學(xué)， 2015， 43（5）： 663-668

15 ZHANG Chi， SONG Ying， PAN Jia-Rong， JIAO Bi-Ning， SUI Ke， LIANG Shi-Zheng， FENG Tao， FU Li-Li. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（8）： 1154-1161

張 弛， 宋 瑩， 潘家榮， 焦必寧， 睢 珂， 梁世正， 馮 濤， 付麗麗. 分析化學(xué)， 2015， 43（8）： 1154-1161

16 LUO Yan-Bo， ZHENG Hao-Bo， JIANG Xing-Yi， LI Xue， ZHANG Hong-Fei， ZHU Feng-Peng， PANG Yong-Qiang， FENG Yu-Qi. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（10）： 1538-1544

羅彥波， 鄭浩博， 姜興益， 李 雪， 張洪非， 朱風(fēng)鵬， 龐永強(qiáng)， 馮鈺锜. 分析化學(xué)， 2015， 43（10）： 1538-1544

17 Usui K， Hayashizaki Y， Hashiyada M， Funayama M. Legal Med.， 2012， 14（6）： 286-296

18 Lopes R P， Reyes R C， Romero-González R， Vidal J L， Frenich A G. J. Chromatogr. B， 2012， s895-s896（3）： 39-47

19 WANG Peng， JIANG Xue-Hua， WANG Ling. Chinese Journal of New Drugs， 2011， （20）： 1953-1956

王 鵬， 蔣學(xué)華， 王 凌. 中國(guó)新藥雜志， 2011， （20）： 1953-1956

20 Lee S W， Choi J H， Cho S K， Yu H A， Abd EI-Aty A M， Shimb J H. J. Chromatogr. A， 2011， 1218（28）： 4366-77

21 Cajka T， Sandy C， Bachanova V， Drabova L， Kalachova K， Pulkrabova J， Hajslova J. Anal. Chim. Acta， 2012， 743（18）： 51-60

22 Ewa C， Anna S R， Ruiz J M M， Magdalena S Z. Food Chem.， 2011， 125（2）： 773-778

23 YAO Meng-Kan， MA Bing-Liang， MA Yue-Ming. Chin. J. Pharm. Anal.， 2010， 30（12）： 2436-2439

姚夢(mèng)侃， 馬秉亮， 馬越鳴. 藥物分析雜志， 2010， 30（ 2）： 2436-2439

24 Dmitrovic J， Chan S C， Chan S H Y. Toxicol. Lette.， 2002， 134（s 1–3）： 253-258

25 GUO Zhen， CHANG Jing， YANG Rui-Qin， LUAN Yu-Jing， WANG Fang-Lin， YU Zhong-Shan. Journal of Instrumental Analysis， 2015， 34（9）： 986-992

郭 震， 常 靖， 楊瑞琴， 欒玉靜， 王芳琳， 于忠山. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)， 2015， 34（9）： 986-992

26 Matuszewski B K， Constanzer M L， Chavez-Eng C M. Anal. Chem.， 2003， 75（13）： 3019-3030

Abstract A fast testing method was established for the determination of zaleplon and its two metabolites， 5-oxozaleplon and desethylzaleplon， in blood by ultra performance liquid chromatography tandem electrospray ionization triple quadrapole-mass spectrometry （UPLC-TQ/MS）. The optimized QuEChERS （Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged and Safe） method was used for sample preparation. The blood samples were extracted with 0.1% acetic acid and dehydrated by adding anhydrous magnesium sulfate. The targets were separated on a Waters BEH C18 column by gradient elution with 0.1% formic acid-0.1% formic acid/acetonitrile as mobile phase， ionized with positive electrospray （ESI+）， and detected under multiple reaction monitoring （MRM） mode. As a result， zaleplon and its two metabolites displayed excellent linearity in the concentration of 0.5-100 ng/mL （R2>0.997）. The average recoveries ranged from 92.0% to 100.1%. The RSD were in the range of 1.9%-5.3%. Besides， the limit of detection（LOD）of this method for target drugs was 0.05 ng/mL （S/N=3）， while limits of quantification （LOQ） were in the range of 0.1-0.5 ng/mL （S/N=10） . This method can meet the demand of rapidity and accuracy in the analysis of actual cases.

Keywords Zaleplon； 5-Oxozaleplon； Desethylzaleplon； QuEChERS； Ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry