朱咪咪，張 遲,2，常愛玲，黨婉譽(yù)，周彩紅，俞狄虎，吳瑩瑩，張 敏

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300； 2.浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江 臨安 311300）

‘無籽’甌柑小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂特性基因RAD51和MS1的表達(dá)差異分析

朱咪咪1，張 遲1,2，常愛玲1，黨婉譽(yù)1，周彩紅1，俞狄虎1，吳瑩瑩1，張 敏1

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300； 2.浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江 臨安 311300）

‘無籽’甌柑Citrus suavissima ‘Seedless’是野生型甌柑Citrus suavissima的芽變，其花粉完全敗育，敗育起始于小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂形成四分體時(shí)期。研究 ‘無籽’甌柑小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂異常的分子機(jī)制，有利于深入認(rèn)識(shí)果樹芽變的發(fā)生機(jī)制。隨機(jī)選擇 “無籽”甌柑和甌柑各3株，根據(jù)花蕾直徑采集花粉母細(xì)胞時(shí)期（Ⅰ），四分體時(shí)期（Ⅱ），單核花粉粒時(shí)期（Ⅲ），雙核花粉粒時(shí)期（Ⅳ）及花粉粒成熟期（Ⅴ）共5個(gè)時(shí)期的花蕾并分離花藥，利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）分析減數(shù)分裂特性基因RAD51和MS1的相對(duì)表達(dá)量，3次重復(fù)。通過SPSS 16.0的最小顯著差法（LSD）在0.01水平上進(jìn)行各樣品間的相對(duì)表達(dá)量差異分析。結(jié)果表明：RAD51和MS1基因的表達(dá)高峰均集中在第Ⅰ時(shí)期和第Ⅱ時(shí)期，且此時(shí)花藥中的相對(duì)表達(dá)量均極顯著（P＜0.01）高于花蕾。第Ⅰ時(shí)期花藥中， ‘無籽’甌柑RAD51的相對(duì)表達(dá)量為甌柑的3.7倍，MS1可達(dá)300倍；但同時(shí)期花蕾中，RAD51的相對(duì)表達(dá)量?jī)H1.1倍，MS1為140.0倍。 ‘無籽’甌柑RAD51基因在第Ⅰ時(shí)期和第Ⅱ時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量極顯著 （P＜0.01）高于甌柑，說明 ‘無籽’甌柑小孢子母細(xì)胞和四分體時(shí)期的細(xì)胞內(nèi)均存在DNA受損現(xiàn)象； ‘無籽’甌柑MS1基因在第Ⅰ時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量極顯著（P＜0.01）高于甌柑，但第Ⅱ時(shí)期極顯著（P＜0.01）低于甌柑，推測(cè) ‘無籽’甌柑敗育花粉的形成與MS1基因表達(dá)紊亂引起油脂分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)異常密切相關(guān)。圖6表1參24

園藝學(xué)； ‘無籽’甌柑；減數(shù)分裂；花蕾；花藥；RAD51；MS1；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

減數(shù)分裂是植物生活史中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，是有性生殖的前提，是保持物種穩(wěn)定性的基礎(chǔ)［1］。本研究的實(shí)驗(yàn)材料 ‘無籽’甌柑Citrus suavissima ‘Seedless’是1996年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)甌柑Citrus suavissima的無核突變體，具有果實(shí)完全無核的特性［2］。張遲等［3］采用半薄樹脂切片、掃描電鏡、透射電鏡等方法對(duì)其花藥發(fā)育過程和花粉形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)在四分體時(shí)期出現(xiàn)異常，在單核期出現(xiàn)明顯異常，認(rèn)為花粉敗育開始于小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期至四分體時(shí)期。近年來，模式植物減數(shù)分裂行為中的染色體配對(duì)和聯(lián)會(huì)方面的研究取得了較大進(jìn)展。PANOLI等［4］研究了擬南芥Arabidopsis thaliana的直系同源基因Atspo11-1，染色體重組起始于Spoll調(diào)控的DNA雙鏈解開，Atspo11-1突變體中Atspo11-1的缺失會(huì)抑制染色體破碎化。LI等［5］利用熒光原位雜交技術(shù)觀察了擬南芥突變體rad51c-1的早期減數(shù)分裂行為，發(fā)現(xiàn)該突變體的同源染色體無法正常配對(duì)并出現(xiàn)嚴(yán)重的破碎化現(xiàn)象。敲除RAD51C基因后得到的不育植株伴隨有大孢子和花粉母細(xì)胞粗線期染色體異常［6］。ITO等［7］研究了擬南芥中的MALE STERILITY1（MS1）基因，它對(duì)減數(shù)分裂后的花粉發(fā)育很重要，與花粉壁、花粉細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物和絨氈層發(fā)育有關(guān)。在果樹方面，目前的研究多采用分子標(biāo)記法來發(fā)掘育性相關(guān)基因。如王躍進(jìn)等［8］通過分離、提取和純化經(jīng)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA（RAPD）標(biāo)記獲得的特異片段，根據(jù)其序列人工合成一條寡聚核苷酸作引物（5′CCAGT TCGCC CGTAA ATG 3′），在多個(gè)葡萄Vitis vinifera品系中進(jìn)行驗(yàn)證，凡出現(xiàn)約590 bp的DNA片段者即為葡萄無核基因攜帶者和無核性狀表現(xiàn)者。楊英軍等［9］又進(jìn)一步根據(jù)此特異片段設(shè)計(jì)合成了2對(duì)引物，開發(fā)出鑒別無核品種的SCAR（特定序列擴(kuò)增標(biāo)記）。姚春潮等［10］利用RAPD技術(shù)對(duì)美味獼猴桃Actinidia deliciosa var.deliciosa海瓦德×秦雄201雜交F1代雌雄分離群體進(jìn)行分析，通過對(duì)300個(gè)隨機(jī)引物的篩選和研究，得到了與獼猴桃雄性基因鏈鎖的RAPD標(biāo)記S1032-850。NWAFOR等［11］采集了野生型葡萄和一個(gè)無核突變體材料的果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-Seq）分析，對(duì)得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行表達(dá)模式和功能富集分析，發(fā)現(xiàn)花粉和胚囊兩者的發(fā)育途徑具有密切關(guān)聯(lián)，但無核性狀具體由哪些基因控制仍不明了。本研究根據(jù) ‘無籽’甌柑及其野生型小孢子母細(xì)胞時(shí)期花藥轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序結(jié)果，選擇了RAD51和MS1這2個(gè)減數(shù)分裂特性基因，研究它們?cè)?‘無籽’甌柑和甌柑花粉發(fā)育不同時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量差異，來分析 ‘無籽’甌柑小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂異常的分子機(jī)制。此外，鑒于減數(shù)分裂只在特定時(shí)期和特定部位發(fā)生，本研究選取了花蕾和花藥2種材料進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定，進(jìn)而分析不同材料所得結(jié)果的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料甌柑和 ‘無籽’甌柑采自麗水市林業(yè)科學(xué)研究院百果園。當(dāng)花蕾剛露白時(shí)開始取樣，根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)的結(jié)果，采集 ‘無籽’甌柑和甌柑花粉母細(xì)胞形成期（Ⅰ），四分體時(shí)期（Ⅱ），單核花粉粒時(shí)期（Ⅲ），雙核花粉粒時(shí)期（Ⅳ）和花粉粒成熟期（Ⅴ）共5個(gè)時(shí)期的花蕾和對(duì)應(yīng)花藥，5個(gè)時(shí)期的花蕾直徑分別為2.0～2.4 mm，2.8～3.1 mm，3.5～4.5 mm，4.5～6.5 mm和即將開放的花蕾（6.5～7.1 mm，圖1），保存

于-70℃超低溫冰箱。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 采用改良的Trizol法提取甌柑和 ‘無籽’甌柑各5個(gè)時(shí)期花蕾的RNA，用Aidlab公司的 ‘EASYspin PLUS植物RNA快速提取試劑盒’提取花藥RNA，10.0 g· kg-1的瓊脂糖凝膠對(duì)各樣品的 RNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，再經(jīng)NanoDrop-1000測(cè)吸光度值，檢測(cè)樣品RNA的質(zhì)量。

1.2.2 熒光定量PCR cDNA的合成參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScripRRT reagent kit with gDNA Eraser（perfect real time）的說明指南。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中的基因序列（已提交GenBank）設(shè)計(jì)熒光定量特異引物（表1），以甜橙Citrus sinensis的Actin基因（GU911361）為內(nèi)參，采用定量?jī)x器CFX96 real-time system實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad）和熒光染料SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）進(jìn)行實(shí)時(shí)表達(dá)量測(cè)定。反應(yīng)程序?yàn)?5℃,30 s；95℃，5 s；57℃，30 s，39個(gè)循環(huán)；65～95℃，隔5 s上升0.5℃做融解曲線。設(shè)立重復(fù)3個(gè)·樣品-1，根據(jù)2-△△Ct法［12］進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算，利用SPSS 16.0的最小顯著差（LSD）法在0.01水平上比較2個(gè)基因在不同組織和不同時(shí)期中的表達(dá)量差異。

圖1 花粉發(fā)育5個(gè)時(shí)期的花蕾Figure1 Flower buds of five pollen developments

表1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）特異引物Table 1 Specific primers for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 RAD51基因的時(shí)空定量表達(dá)

2.1.1 花蕾中RAD51基因的表達(dá) 以甌柑第Ⅰ時(shí)期花蕾的表達(dá)量為基準(zhǔn)計(jì)算甌柑和 ‘無籽’甌柑各時(shí)期花蕾的RAD51的相對(duì)表達(dá)量。 ‘無籽’甌柑和甌柑花蕾中RAD51的表達(dá)主要集中在第Ⅰ時(shí)期； ‘無籽’甌柑中RAD51基因的相對(duì)表達(dá)量逐漸下降，甌柑先下降，在第Ⅳ時(shí)期和第Ⅴ時(shí)期略有上升（圖2）。

2.1.2 花藥中RAD51基因的表達(dá) 以甌柑第Ⅰ時(shí)期花藥的表達(dá)量為基準(zhǔn)計(jì)算甌柑和 ‘無籽’甌柑各時(shí)期花藥的RAD51相對(duì)表達(dá)量。 ‘無籽’甌柑和甌柑花藥中RAD51的表達(dá)主要集中在第Ⅰ時(shí)期和第Ⅱ時(shí)期，且此時(shí) ‘無籽’甌柑中的相對(duì)表達(dá)量均極顯著（P＜0.01）高于甌柑，第Ⅰ時(shí)期達(dá)3.7倍左右； ‘無籽’甌柑中RAD51基因的相對(duì)表達(dá)量逐漸下降，甌柑在第Ⅱ時(shí)期最高，隨后逐漸下降（圖3）。

2.2 MS1基因的時(shí)空定量表達(dá)

2.2.1 花蕾中MS1基因的表達(dá) 以甌柑第Ⅰ時(shí)期花蕾的表達(dá)量為基準(zhǔn)計(jì)算甌柑和 ‘無籽’甌柑各時(shí)期花蕾的MS1相對(duì)表達(dá)量。 ‘無籽’甌柑和甌柑花蕾中MS1的表達(dá)主要集中在第Ⅰ時(shí)期和第Ⅱ時(shí)期，且此時(shí)期存在極顯著（P＜0.01）差異；第Ⅰ時(shí)期 ‘無籽’甌柑是甌柑的140.0倍左右，但第Ⅱ時(shí)期甌柑是‘無籽’甌柑的2.5倍； ‘無籽’甌柑中MS1基因的相對(duì)表達(dá)量逐漸下降，甌柑在第Ⅱ時(shí)期相對(duì)表達(dá)量最高，隨后逐漸下降（圖4）。

2.2.2 花藥中MS1基因的表達(dá) 以甌柑第Ⅰ時(shí)期花藥的表達(dá)量為基準(zhǔn)計(jì)算甌柑和 ‘無籽’甌柑各時(shí)期花藥的MS1相對(duì)表達(dá)量。 ‘無籽’甌柑和甌柑花藥中MS1的表達(dá)也主要集中在第Ⅰ時(shí)期和第Ⅱ時(shí)期，且存在極顯著（P＜0.01）差異；第Ⅰ時(shí)期 ‘無籽’甌柑是甌柑的300.0倍左右，但第Ⅱ時(shí)期甌柑是 ‘無籽’甌柑的2.0倍； ‘無籽’甌柑中MS1基因的相對(duì)表達(dá)量逐漸下降，甌柑在第Ⅱ時(shí)期相對(duì)表達(dá)量最高，隨后逐漸下降（圖5），此趨勢(shì)與花蕾中相似（圖4）。

圖2 甌柑和 ‘無籽’甌柑花蕾RAD51的相對(duì)表達(dá)量Figure 2 Expression alteration of RAD51 in flower bud of Citrus suavissima and Citrus suavissima ‘Seedless’

圖3 甌柑和 ‘無籽’甌柑花藥RAD51的相對(duì)表達(dá)量Figure 3 Expression alteration of RAD51 in anther of Citrus suavissima and Citrus suavissima ‘Seedless’

圖5 甌柑和 ‘無籽’甌柑花藥MS1的相對(duì)表達(dá)量Figure 5 Expression alteration of MS1 in anther of Citrus suavissima and Citrus suavissima ‘Seedless’

2.3 同種（品種）花蕾和花藥之間基因表達(dá)量的比較分析

分別以 ‘無籽’甌柑和甌柑各自花蕾第Ⅰ時(shí)期的表達(dá)量為基準(zhǔn)計(jì)算同種（品種）花蕾和花藥間的相對(duì)表達(dá)量，比較同一基因在不同組織材料中的表達(dá)差異。除個(gè)別時(shí)期無極顯著（P＜0.01）差異外，2個(gè)種（品種）的其他時(shí)期均是花藥中的相對(duì)表達(dá)量極顯著（P＜0.01）高于各自時(shí)期的花蕾（圖6）。

3 討論

3.1 RAD51的基因功能和表達(dá)分析

RAD51的功能是修復(fù)SPO11引發(fā)產(chǎn)生的雙鏈DNA分子斷裂（double-strand breaks，DSBs）。RAD51會(huì)附著到由蛋白復(fù)合體MRX產(chǎn)生的3′單鏈末端上，以促進(jìn)單鏈 DNA入侵到同源染色體雙鏈中形成重組中間體，在復(fù)合體解開的過程中形成染色體的交換（crossover,CO）和非交換（noncrossover,NCO）［13］。AtRAD51基因單突變體雌、雄減數(shù)分裂過程均不正常，單突變體植株不育，減數(shù)分裂細(xì)胞中無法正常形成聯(lián)會(huì)復(fù)合體且存在大量染色體碎片，而Atspo11-1Atrad51雙突變體中不存在染色體碎片，說明 A-trad51中的染色體碎片來自于AtSPO11引發(fā)的DSBs［14］。動(dòng)物RAD51基因是大腸埃希菌Escherichia coli RecA的同源基因，與植物RAD51也具有一定同源性［15］，在動(dòng)物生命科學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)RAD51蛋白在多

種受損組織中表達(dá)增高，認(rèn)為這是DNA被損傷后細(xì)胞的一種反應(yīng)［16－17］。

圖6 同品種花蕾和花藥間的相對(duì)表達(dá)量Figure 6 Expression alteration of flower buds and anther from the same variety

OSAKABE等［18］對(duì)擬南芥進(jìn)行不同強(qiáng)度的γ射線照射，誘導(dǎo)產(chǎn)生DSBs，對(duì)不同器官內(nèi)RAD51基因進(jìn)行半定量PCR分析，結(jié)果顯示：花芽中RAD51表達(dá)量最高，且隨照射強(qiáng)度增加而增高，說明細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的DSBs越多，RAD51基因越活躍。本研究中， ‘無籽’甌柑第Ⅰ時(shí)期和第Ⅱ時(shí)期的花藥中RAD51的相對(duì)表達(dá)量極顯著（P＜0.01）高于甌柑（圖3），表明 ‘無籽’甌柑小孢子母細(xì)胞時(shí)期和四分體時(shí)期細(xì)胞內(nèi)可能存在某種機(jī)制引起的DNA受損現(xiàn)象。

3.2 MS1的基因功能和表達(dá)分析

MS1基因編碼一個(gè)含有植物同源域（plant homeo domain，PHD）指基序的轉(zhuǎn)錄因子，參與絨氈層的發(fā)育和花粉壁的形成［19］。擬南芥ms1突變體花粉的透射電鏡觀察［20］顯示，前期突變體與野生型均能正常發(fā)育，但從四分體解體開始，突變體中的小孢子和絨氈層細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)和非正常液泡，小孢子內(nèi)孢粉素分布及外壁柱狀基粒棒的發(fā)育均異常，并在隨后的發(fā)育中被液泡充斥而萎縮退化。而‘無籽’甌柑花藥的絨氈層和花粉壁結(jié)構(gòu)與甌柑無明顯差異，但最終花粉粒形態(tài)出現(xiàn)明顯差異，甌柑花粉粒飽滿， ‘無籽’甌柑的花粉粒大多干癟、畸形且無內(nèi)含物，說明MS1在不同物種中的功能存在一定差異［3］。正常情況下，MS1在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂完成、單個(gè)小孢子從四分體分離時(shí)在絨氈層細(xì)胞中表達(dá)量較高［19］。本研究中，甌柑MS1的表達(dá)趨勢(shì)符合此規(guī)律。擬南芥ms1-1突變體［21］MS1的轉(zhuǎn)錄本在小孢子母細(xì)胞時(shí)期（PMC）到減數(shù)分裂期間表達(dá)量是野生型的27.0倍，四分體到有絲分裂Ⅰ時(shí)期表達(dá)量是野生型的600.0倍。本研究中 ‘無籽’甌柑在小孢子母細(xì)胞時(shí)期（第I時(shí)期）的表達(dá)異常升高，在花蕾中是甌柑的140.0倍，花藥中更是高達(dá)300.0倍，反而在四分體時(shí)期（第Ⅱ時(shí)期）顯著降低，僅為甌柑的1/2。

YANG等［21］利用花椰菜Brassica oleracea var.botrytis花葉病毒35S啟動(dòng)子（CaMV35S）使MS1基因過量表達(dá)，得到一些花器官及花粉變異的擬南芥類型，并對(duì)ms1變異花芽進(jìn)行基因芯片分析，其中3個(gè)有關(guān)油脂合成和花粉壁發(fā)育的基因（At5g07550，At5g07410和At5g07560）經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在MS1過表達(dá)的擬南芥類型中均表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，推測(cè)ms1變異株中這些油脂蛋白的缺失影響了TAGs從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的釋放，導(dǎo)致了油質(zhì)的積累和不正常分泌。張敏等［22］通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn) ‘無籽’甌柑中脂轉(zhuǎn)移酶基因（CsLTP）和脂氧合酶基因（CsLOX）的相對(duì)表達(dá)量在花粉粒形成期顯著下降，LTP是MYB99的下游基

因，而MYB99是受MS1調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子［7,21］， ‘無籽’甌柑成熟花粉粒時(shí)期花藥的絨氈層附近有大量的脂類物質(zhì)殘存［3］，因此， ‘無籽’甌柑敗育花粉的形成與MS1基因過表達(dá)引起油脂分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)異常密切相關(guān)。

3.3 不同組織材料的比較分析

本研究利用花蕾與花藥2種組織材料對(duì)RAD51和MS1基因進(jìn)行表達(dá)量比較，發(fā)現(xiàn)同一基因在同一時(shí)期的花蕾和花藥中相對(duì)表達(dá)量差異極顯著（P＜0.01）（圖6）。任磊等［23］采用相對(duì)熒光定量的方法對(duì) 7個(gè)花器官發(fā)育相關(guān)基因在牡丹Paeonia suffruticosa根、莖、葉、花瓣、萼片、雄蕊和心皮中的表達(dá)差異進(jìn)行分析，其中PsPI和PsMADS1主要在花瓣和雄蕊中表達(dá)，其他器官幾乎沒有表達(dá)，表明不同的基因在不同的器官中有不同的表達(dá)模式，具有一定的組織特異性。本研究的重點(diǎn)是 ‘無籽’甌柑減數(shù)分裂異常的分子機(jī)制，因此，采用花藥作為研究材料可以更準(zhǔn)確地反映減數(shù)分裂特性基因的表達(dá)水平。

4 結(jié)論與展望

在花粉母細(xì)胞形成期（Ⅰ），四分體時(shí)期（Ⅱ），單核花粉粒時(shí)期（Ⅲ），雙核花粉粒時(shí)期（Ⅳ），花粉粒成熟期（Ⅴ）等5個(gè)時(shí)期的花蕾和花藥中，同種（品種）中各時(shí)期RAD51和MS1的表達(dá)量均是花藥極顯著（P＜0.01）高于花蕾。第Ⅰ時(shí)期花藥中，‘無籽’甌柑RAD51的相對(duì)表達(dá)量為甌柑的3.7倍，說明 ‘無籽’甌柑的小孢子母細(xì)胞時(shí)期和四分體時(shí)期可能存在某種機(jī)制引發(fā)的DNA受損現(xiàn)象，從而引起RAD51的異常高量表達(dá)。第Ⅰ時(shí)期花藥中MS1的表達(dá)量為甌柑的300.0倍，但第Ⅱ時(shí)期（四分體時(shí)期）銳減為甌柑的1/2；MS1基因的提早過量表達(dá)可能引起油脂分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)的異常，與 ‘無籽’甌柑敗育花粉的形成密切相關(guān)。

CHEN等［24］收集擬南芥性母細(xì)胞進(jìn)行RNA-Seq測(cè)序，結(jié)果顯示：減數(shù)分裂特性基因MND1，At-SPO11-2，AtSRP2，MSS等的表達(dá)量在性細(xì)胞中是花藥中的2.0倍，AtSPO11-1，AtDMC1，AtRAD51C，AtXRCC3等在性細(xì)胞和花藥中表達(dá)量又比種子高，說明基因表達(dá)量與組織特性密切相關(guān)。在后續(xù)的減數(shù)分裂分子機(jī)制研究中，可嘗試?yán)眉す怙@微切割技術(shù)獲取花藥中的性母細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，以獲得更精確的基因信息，推進(jìn) ‘無籽’甌柑減數(shù)分裂異常的研究進(jìn)程。

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Expression of microsporocyte meiosis with special genes RAD51 and MS1 in Citrus suavissima ‘Seedless’

ZHU Mimi1,ZHANG Chi1,2,CHANG Ailing1,DANG Wanyu1,ZHOU Caihong1,YU Dihu1, WU Yingying1,ZHANG Min1
（1.The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China;2.The Key Laboratory for Quality Improvement of Agriculture Products of Zhejiang Province, Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

To obtain the relative expression of two meiosis special genes--RAD51 and MS1 （Male Sterility1）, Citrus suavissima ‘Seedless’,a bud variation of its wild type Ougan （Citrus suavissima）with completely aborted pollens that appear abnormally from the tetrad stage,were studied through the molecular mechanism of abnormal meiosis.According to flower bud diameter,five stages of flower buds and anther--pre-meiotic（PM,Ⅰ）,tetrad（T,Ⅱ）,single-celled（SC,Ⅲ）,dual-core（DC,Ⅳ）,and mature pollen（MP,Ⅴ）--were collected and each was an composite sample from three trees.An experiment in real-time quantitative polymerase chain

horticulture;Citrus suavissima‘Seedless’;meiosis;flower buds;anther;RAD51;MS1;qRT-RCR

S666.1；S759.3

A

2095-0756（2016）06-0921-07

2015-12-19；

2016-01-15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31000897）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y3090494）； 浙江省團(tuán)隊(duì)科技特派員服務(wù)計(jì)劃項(xiàng)目（浙科發(fā)農(nóng)〔2013〕215-122）；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目（2016R412003）

朱咪咪，從事經(jīng)濟(jì)林栽培與利用研究。E-mail：mmzjessica@163.com。通信作者：張敏，副教授，博士，從事經(jīng)濟(jì)林遺傳育種研究。E-mail：mzhang@zafu.edu.cn

10.11833/j.issn.2095-0756.2016.06.001

reaction （qRT-PCR）was conducted by three replications in each sample and the method of least significant difference（LSD）with SPSS 16.0 was used to test the expression differences between samples under the level of P＜0.01.Results showed that expression of RAD51 at Stage I of the anther and the flower buds for C. suavissima‘Seedless’was significantly higher（P＜0.01）than Ougan.At Stage I of the anther,the relative expression of RAD51 in C.suavissima ‘Seedless’was 3.7 times higher than in Ougan with MS1 reaching about 300 times higher.However,at Stage I of the flower buds,RAD51 was only 1.1 times higher and MS1 was about 140 times higher.The significantly higher expression of RAD51 at Stage I indicated that a phenomenon of DNA damage might exist in the microsporocyte and tetrad periods of C.suavissima ‘Seedless’;for gene MS1,significantly higher expression of C.suavissima ‘Seedless’ for Stage I also meant that the aborted pollens of C. suavissima ‘Seedless’had a relationship with the abnormal secretion and transfer of oil lipids that were influenced by disordered expression of MS1.［Ch,6 fig.1 tab.24 ref.］