李洪濱，朱誠棋，周 湘，馬良進，蘇 秀

（1.浙江農(nóng)林大學 林業(yè)與生物技術(shù)學院，浙江 臨安 311300； 2.華南農(nóng)業(yè)大學 林學院， 廣東 廣州510642）

紅哺雞竹異香柱菌的形態(tài)學和分子鑒定

李洪濱1，朱誠棋2，周 湘1，馬良進1，蘇 秀1

（1.浙江農(nóng)林大學 林業(yè)與生物技術(shù)學院，浙江 臨安 311300； 2.華南農(nóng)業(yè)大學 林學院， 廣東 廣州510642）

竹叢枝病是普遍發(fā)生并導(dǎo)致竹林退化的最具破壞性的病害之一。研究該病害的病原對于該病的防治有重大的意義。異香柱菌屬Heteroepichlo?箬竹異香柱菌Heteroepichlo? sasae是引起竹子叢枝病的病原之一。利用形態(tài)學結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析的方法，對采自浙江桐鄉(xiāng)的紅哺雞竹Phyllostachys iridescens叢枝病病原進行了分離鑒定。結(jié)果表明：根據(jù)該分離物的形態(tài)特征、平板純培養(yǎng)物的培養(yǎng)特征以及基于內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)-核糖體DNA（ITS-rDNA）序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，最終確定為箬竹異香柱菌。該分離物與紅哺雞竹叢枝病的關(guān)系還需進一步研究。圖5參14

森林保護學；紅哺雞竹；叢枝??；箬竹異香柱菌；植原體；系統(tǒng)發(fā)育分析

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅哺雞竹健株和叢枝病株均于2014年4月采自浙江省桐鄉(xiāng)市靈安鎮(zhèn)。采集的新鮮樣品直接用于試驗或保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)觀察 觀察采集到的新鮮子實體的顏色、大小及質(zhì)地；作真菌子座橫截面的徒手切片，觀察真菌的子囊殼、子囊及子囊孢子。

1.2.2 分離培養(yǎng)及培養(yǎng)特征的觀察 取新鮮的子實體，將它切成2～3 mm的小段，用體積分數(shù)為75%的乙醇浸泡2～3 s后，再用體積分數(shù)為10%的次氯酸鈉消毒3～5 min，最后用無菌水漂洗，用滅菌濾紙控干后移植于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板上，放入25℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔24 h觀察并記錄真菌的生長狀況。

1.2.3 紅哺雞竹叢枝病真菌的分子檢測 ①植物總DNA的提取。分別稱取0.1 g真菌子座及平板菌絲體，采用Takara各種材料全基因組提取試劑盒（Takara,中國大連）的方法提取總DNA，濃度檢測合格后，置于-20℃冰箱中備用。②聚合酶鏈式反應(yīng)擴增。聚合酶鏈式反應(yīng)的引物為真菌內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)-核糖體DNA（ITS-rDNA）區(qū)段通用引物對ITS1F/ITS4，用Taq酶（Takara,中國大連）進行擴增，具體反應(yīng)體系參照說明書。聚合酶鏈式反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min,35個循環(huán)中，94℃變性30 s，50℃退火45 s,72℃延伸1 min,最后72℃延伸10 min。產(chǎn)物于4℃保存。 ③ 聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物的電泳檢測及序列測定。聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物在10 g·kg-1瓊脂糖凝膠，150 V，25 min電泳檢測后，委托杭州皓豐生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 紅哺雞竹叢枝病植原體的分子檢測 ①植物總DNA的提取。稱取0.1 g感病及健康的紅哺雞竹植株的韌皮部組織，采用常規(guī)的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法分別提取總DNA，濃度檢測合格后，置于-20℃冰箱中備用。②聚合酶鏈式反應(yīng)擴增。參照邱并生等［12］的方法，采用巢式聚合酶鏈式反應(yīng)的方法擴增植原體。所用引物為植原體通用引物R16mF2/R16mR1及R16F2/R16R2［13］，用Taq酶（Takara,中國大連）進行擴增。第1輪以植株的總DNA為模板，R16mF2/R16mR1為引物，聚合酶鏈式反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min；35個循環(huán)中，94℃變性30 s，55℃退火45 s,72℃延伸1 min；最后72℃延伸10 min。第2輪用第1輪擴增產(chǎn)物的50倍稀釋液為模板，R16F2/R16R2為引物，退火溫度提高到60℃，其余條件與第1輪相同。聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物的電泳檢測及序列測定與1.2.3相同。

1.2.5 序列同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 從美國生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi. nlm.nih.gov/）下載與本實驗所得序列相關(guān)的基因序列，并使用MEGA 6.06［14］數(shù)據(jù)軟件中的neighbor-joining法構(gòu)建進化樹，其中 ‘bootstrap’設(shè)定為1 000次重復(fù)，遺傳距離使用MEGA 6.06數(shù)據(jù)軟件屮提供的 ‘Jukes and Cantor’法進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 感病植株癥狀表現(xiàn)

紅哺雞竹叢枝病多發(fā)于老竹林以及缺乏管理且過密的竹林，發(fā)病時間多為4月初至7月中旬，發(fā)病癥狀為個別竹枝發(fā)病，進而擴展到其他枝條。發(fā)病的竹枝呈現(xiàn)掃把狀，分枝增多，竹葉明顯變小，葉片

的顏色也較正常葉片淡（圖1）。

2.2 紅哺雞竹叢枝真菌的形態(tài)特征

子座包裹于竹葉鞘中，為彎曲桿狀，中間稍厚，兩端稍細，形如香柱，為肉質(zhì)質(zhì)地，長度約為3～7 cm，呈灰色或者黑色，中軸有一淺黃色線狀條帶連接兩端（圖2A），切開后內(nèi)部為綠色。子囊殼大多為長圓形或卵圓形，緊密地著生于子座外側(cè)，顏色為褐色或暗紅色，成熟的子囊殼外側(cè)有一孔狀開口（圖2B），隱約可見內(nèi)部長條狀子囊（圖2C）。組織分離實驗發(fā)現(xiàn)，該菌生長極其緩慢，容易被雜菌污染，常規(guī)組織分離15 d左右才長出菌絲體，菌絲為純白色的毛絨狀，菌正反面菌絲顏色一致（圖2D）。在對該菌落的逐步觀察記錄中發(fā)現(xiàn)，該菌在組織分離20～30 d生長速度最快，之后生長減緩。

圖1 紅哺雞竹叢枝病癥狀Figure 1 Witches’-broom symptom of infected Phyllostachys iridescens

圖2 子實體和菌落形態(tài)Figure 2 Fruiting bodies and colony

2.3 紅哺雞竹叢枝真菌的分子檢測

以真菌ITS-rDNA區(qū)段通用引物ITS1F/ITS4作為引物，從紅哺雞竹子座及平板菌絲體中擴增到了約600 bp的片段（圖3），與預(yù)期大小相符；而健康組織及雙蒸水的對照中沒有出現(xiàn)特異擴增帶，說明該病樣中確實有真菌存在。

2.4 紅哺雞竹叢枝植原體的PCR檢測結(jié)果

利用巢式聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)從表現(xiàn)癥狀的紅哺雞竹的韌皮部組織中沒有擴增出片段，而從陽性對照桑萎縮病樣品（本實驗保存）中擴增到了約1.2 kb的預(yù)期大小的片段（圖4）。說明感病紅哺雞竹沒有受到植原體的侵染。

2.5 紅哺雞竹叢枝真菌序列分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

紅哺雞竹叢枝真菌經(jīng)測序列得到545 bp的ITS-rDNA序列，將該序列與美國生物技術(shù)信息中心中的基因序列進行比對。結(jié)果表明：該病原菌與異香柱菌屬Heteroepichlo?的2個代表種sasae-K，sasae-H（GeneBank登錄號：AB065430.1和AB065432.1）的同源性高達97%。從美國生物技術(shù)信息中心下載相關(guān)

的ITS-rDNA序列，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖5），結(jié)果可見：分離自紅哺雞竹的叢枝真菌與Heteroepichlo? sasae-K和Heteroepichlo? sasae-H的親緣關(guān)系最近，此節(jié)點支持率為100%。

圖3 紅哺雞竹叢枝真菌ITS-rDNA序列聚合酶鏈式反應(yīng)擴增電泳圖Figure 3 PCR amplification of ITS-rDNA of fungi

圖4 紅哺雞竹叢枝植原體16S rRNA基因序列聚合酶鏈式反應(yīng)擴增電泳圖Figure 4 PCR amplification of 16S rRNA gene of phytoplasma associated with Phyllostachys iridescens witches’-broom

圖5 利用鄰接法構(gòu)建的基于ITS-rDNA序列的系統(tǒng)進化樹Figure 5 Phylogenetic tree based on ITS-rDNA sequences of Ph.iridescens witches’-broom and related fungi constructed with the neighbor-joining method

3 結(jié)論與討論

本研究通過形態(tài)學特征觀察和聚合酶鏈式反應(yīng)檢測從紅哺雞竹叢枝病枝中檢測到了1種真菌，并根據(jù)ITS-rDNA序列一致性和系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果，明確該真菌為箬竹異香柱菌Heteroepichlo? sasae。

目前，已知竹香柱型叢枝病病原有箣竹香柱菌和箬竹香柱菌2種。前者的子座為微黃色，平板培養(yǎng)物分生孢子較短，后者子座為紫色，分生孢子較長，其余構(gòu)造沒有顯著差異［6］。采自浙江桐鄉(xiāng)紅哺雞竹叢枝病的子座顏色為深紫色，與箬竹香柱菌更為接近；而本試驗中，平板純培養(yǎng)物未能見到分生孢子產(chǎn)生，這也許跟培養(yǎng)時間、溫度、營養(yǎng)有關(guān)系。本試驗采用的是PDA培養(yǎng)基及25℃的培養(yǎng)條件，今后可以對這些條件做些調(diào)整進行進一步的研究。系統(tǒng)發(fā)育學上，ITS-rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，采自紅哺雞竹

叢枝病的試驗菌株與異香柱菌屬Heteroepichlo?構(gòu)成一個分支，且與Heteroepichlo? sasae高度聚類，節(jié)點支持率達到了100%，說明它們的親緣關(guān)系很近，可以解釋為紅哺雞竹叢枝病的試驗菌株為H.sasae的1個分離物，由于寄主不同，產(chǎn)生了一些遺傳上的差異。

國內(nèi)異香柱菌引起竹叢枝病的報道較少，對H.sasae和 H.bambusae這2種病原的描述也比較簡單。本研究從紅哺雞竹叢枝病枝上分離到的真菌與程燕林等［9］在短穗竹叢枝病枝上分離鑒定的真菌均為箬竹異香柱菌。這將該真菌的寄主范圍又進一步擴大，但該真菌是否為紅哺雞竹叢枝病的病原菌，還需要進一步的致病性實驗驗證。中國竹叢枝病發(fā)生十分普遍，有必要對不同竹種上的香柱菌進行詳細的形態(tài)學以及分子系統(tǒng)學的研究以確定其分類地位。

［1］ 徐梅卿,戴玉成,范少輝,等.中國竹類病害記述及其病原物分類地位（上）［J］.林業(yè)科學研究,2006,19（6）:692－699.

XU Meiqing,DAI Yucheng,FAN Shaohui,et al.Records of bamboo disease and the taxonomy of their pathogens in China（Ⅰ）［J］.For Res,2006,19（6）:692－699.

［2］ 徐梅卿,戴玉成,范少輝,等.中國竹類病害記述及其病原物分類地位（下）［J］.林業(yè)科學研究,2007,20（1）:45－52.

XU Meiqing,DAI Yucheng,FAN Shaohui,et al.Records of bamboo disease and the taxonomy of their pathogens in China（Ⅱ）［J］.For Res,2007,20（1）:45－52.

［3］ 楊永剛,吳小芹.竹叢枝病病原研究進展［J］.浙江農(nóng)林大學學報,2011,28（1）:144－148.

YANG Yonggang,WU Xiaoqin.Research progress on pathogens of witches’broom of bamboo［J］.J Zhejiang A&F Univ,2011,28（1）:144－148.

［4］ 朱熙樵.竹類幾種叢枝病的特征［J］.森林病蟲通訊,1985，4（2）:42－44.

ZHU Xiqiao.The characteristics of several kinds of bamboo witches’broom［J］.For Pest Dis,1985,4（2）:42－44.

［5］ 王華清,陳嶺偉,李馥純,等.廣東省毛竹叢枝病研究初報［J］.森林病蟲通訊,1999,18（3）：22－26.

WANG Huaqing,CHEN Linwei,LI Fuchun,et al.Moso bamboo witches’broom in Guangdong Province［J］.For Pest Dis,1999,18（3）：22－26.

［6］ TANAKA E,TANAKA C,TSUDA M,et al.Heteroepichlo?,gen.nov.（Clavicipitaceae;Ascomycotina）on bamboo plants in East Asia［J］.Mycoscience,2002,43（2）:87－93.

［7］ 張立欽,王雪根.中國竹類真菌資源［J］.竹子研究匯刊,1997,18（3）:66－72.

ZHANG Liqin,WANG Xuegen.Fungus research of bamboos in China［J］.J Bamboo Res,1997,18（3）:66－72.

［8］ 魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海:上海科學技術(shù)出版社,1979.

［9］ 程燕林,侯成林,高健.短穗竹上一種異香柱菌的形態(tài)學及分子鑒定［J］.北京林業(yè)大學學報,2009,31（1）:84－90.

CHENG Yanlin,HOU Chenglin,GAO Jian.Identification of Heteroepichloe species on Brachystachyum densiflorum by morphology and phylogeny［J］.J Beijing For Univ,2009,31（1）:84－90.

［10］ 林雪堅,吳光金,徐靜輝.水竹叢枝病的研究（I）癥狀和病原［J］.中南林學院學報,1987,7（2）:132－135.

LIN Xuejian,WU Guangjin,XU Jinghui.Study on witches’broom of fishscale bamboo（Ⅰ）symptoms and pathogens［J］.J Cent South For Coll,1987,7（2）:132－135.

［11］ 朱熙樵,黃金生.關(guān)于類菌原體引起叢枝病的探討［J］.竹子研究匯刊,1992,11（1）:4－9.

ZHU Xiqiao,HUANG Jinsheng.Approach on witches’broom of bamboos caused by mycoplasma like organism［J］.J Bamboo Res,1992,11（1）:4－9.

［12］ 邱并生,李橫虹,史春霖,等.從我國20種感病植物中擴增植原體16S rDNA片段及其RFLP分析［J］.林業(yè)科學,1998,34（6）:67－74.

QIU Bingsheng,LI Henghong,SHI Chunlin,et al.Amplification of phytoplasma 16s rDNA from 20 infected plants in China and their RFLP analysis［J］.Sci Silv Sin,1998,34（6）:67－74.

［13］ LEE I M,HAMMOND R W,DAVIS R E,et al.Universal amplification and analysis of pathogen 16S rDNA for classification and identification of Mycoplasmalike organisms［J］.Phytopathology,1993,83（8）:834－842.

［14］ TAMURA K,STECHER G,PETERSON D,et al.MEGA6:molecular evolutionary genetics analysis version 6.0［J］. Mol Biol Evol,2013,30（12）:2725－2729.

Morphological and molecular identification of Heteroepichlo? sasae isolated from Phyllostachys iridescens

LI Hongbin1,ZHU Chengqi2,ZHOU Xiang1,MA Liangjin1,SU Xiu1
（1.School of Forestry and Biotechnology,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China;2.School of Forestry,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,Guangdong,China）

Witches’-broom,one of the most common diseases of bamboo,induces extremely destructive deterioration of bamboo stands.This study on the pathogens of witches’-broom was conducted to help control the disease.Branches of Phyllostachys iridescens were collected from Tongxiang City in Zhejiang Province,which suffered from witches’-broom,and its pathogen,Heteroepichlo? sasae,was studied by morphologic and phylogenetic methods.Results showed that according to morphological,cultural,and phylogenetic characteristics Heteroepichlo? sasae was isolated from infected Phyllostachys iridescens branches.However,the relationship between this isolate and witches’-broom disease needs further study.［Ch,5 fig.14 ref.］

forest protection;Phyllostachys iridescens;witches’-broom;Heteroepichlo? sasae;phytoplasma; phylogenetic analysis

S763.1

A

2095-0756（2016）06-1040-05

2015-11-20；

2015-12-23

浙江省重中之重林學一級學科開放基金項目（KF201330）；浙江省教育廳資助項目（Y201431042）

李洪濱，從事林木病原微生物鑒定研究。E-mail：240615800@qq.com。通信作者：蘇秀，實驗師，從事林木病理學研究。E-mail：suxiu@zafu.edu.cn

10.11833/j.issn.2095-0756.2016.06.016

竹子是多年生的禾本科Gramineae植物。中國約有竹子39屬500余種。紅哺雞竹Phyllostachys iridescens廣泛分布在浙江、江蘇、湖北等省，是非常重要的經(jīng)濟和觀賞竹。竹子叢枝?。╳itches’-broom of bamboo）又名掃帚病，鳥巢病，能導(dǎo)致竹子生長衰退，嚴重影響竹子質(zhì)量以及出筍率，降低其觀賞性，甚至竹子大面積枯死。雖然國內(nèi)已有一些有關(guān)竹子病原菌的研究報道［1－2］，但有關(guān)竹子叢枝病病原的研究報道相對較少。竹子叢枝病病原復(fù)雜，涉及多個病原物如竹針孢座囊菌Aciculosporium take，竹暗球腔菌Phaeosphaeria bambusae，異香柱菌屬Heteroepichloe以及植原體（phytoplasma）等，也有多種病原物混合侵染的報道［3］。竹香柱型叢枝病在中國報道的較少，其病原菌包括箣竹香柱菌Epichlo? bambusae和箬竹香柱菌Epichlo? sasae等2種。朱熙樵［4］曾在浙江省境內(nèi)的短穗竹Brachystachyum densiflorum，淡

竹Phyllostachys glauce，白哺雞竹Phyllostachys dulcis及毛竹Phyllostachys edulis上收集到箣竹香柱菌的標本；王華清等［5］也從毛竹上采集到箣竹香柱菌的樣品。2002年，日本學者TANAKA等［6］根據(jù)形態(tài)學結(jié)合分子檢測的結(jié)果，將這2種菌更名為箣竹異香柱菌Heteroepichlo? bambusae和箬竹異香柱菌H. sasae。目前，國內(nèi)明確的報道是H.sasae能引起箬竹叢枝?。?,7-8］及短穗竹叢枝?。?］。對于植原體與真菌復(fù)合侵染引起叢枝病的情況，有研究發(fā)現(xiàn)，水竹Phyllostachys heteroclada叢枝病病枝的電鏡觀察中同時存在類細菌、植原體和瘤座菌菌絲，并且類細菌的培養(yǎng)液接種健株后能誘發(fā)水竹叢枝?。?0］；朱熙樵等［11］從竹瘤座菌Balansia take引起的竹叢枝病病枝中發(fā)現(xiàn)有植原體的存在。本研究應(yīng)用形態(tài)學特征觀察結(jié)合聚合酶鏈式反應(yīng)檢測手段，對浙江桐鄉(xiāng)市紅哺雞竹叢枝病枝進行了病原物的分離與分子鑒定。