黃冬維，汪　勇，楊　普，程廣龍，汪善義，吳　東，趙小偉，楊永新，王小飛，趙輝玲

（1．安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，合肥 230031；2．安徽省義華農(nóng)牧科技有限公司，池州 245106）

皖南黃兔IGF1基因擴增及其多態(tài)性分析

黃冬維1，汪勇2，楊普1，程廣龍1，汪善義2，吳東1，趙小偉1，楊永新1，王小飛1，趙輝玲1

（1．安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，合肥 230031；2．安徽省義華農(nóng)牧科技有限公司，池州 245106）

胰島素樣生長因子1（IGF1）是動物生長發(fā)育等生命過程中的重要調(diào)節(jié)因子，目前關(guān)于家兔IGF1基因序列擴增和多態(tài)性的研究還很少。該研究以安徽皖南黃兔為試驗動物，通過PCR方法擴增其IGF1基因編碼區(qū)全序列，利用混合DNA池測序和生物信息學(xué)方法分析了IGF1基因擴增區(qū)域的遺傳變異特性。結(jié)果獲得皖南黃兔IGF1基因包含第1~5外顯子的基因組序列5條，長度分別為316、657、691、757和403 bp，與種子序列一致性分別為100%、99.5%、99.9%、99.7%和99.8%；5個外顯子組成432 bp的CDS序列，編碼143個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。測序和生物信息學(xué)分析結(jié)果則表明，在皖南黃兔IGF1基因內(nèi)含子1中存在3個多態(tài)位點（3056G>A、3107T>C和3164 G>A），3個位點并不位于剪接位點，但分別位于MZF1、ATF4、CEBPA、HLF和NKX2-8順式作用元件位置，因而可能影響基因表達。該研究成功擴增獲得皖南黃兔IGF1基因全部5個外顯子序列，拼接獲得基因編碼區(qū)全序列，并利用混合DNA池測序法發(fā)現(xiàn)了內(nèi)含子3個新的SNP位點，研究結(jié)果為揭示肉兔IGF1基因功能奠定了基礎(chǔ)。

皖南黃兔；IGF1基因；擴增；多態(tài)性

1　前言

胰島素樣生長因子1（insulin like growth factor 1，IGF1）屬于IGFs家族成員。IGFs家族包含IGF1和IGF2，具有與胰島素相似的結(jié)構(gòu)和功能［1］，對動物生長發(fā)育等多種生命過程產(chǎn)生影響［2-4］。目前，研究表明IGF1在家兔胚胎發(fā)育、抗氧化、促進動脈粥樣硬化方面具有重要調(diào)節(jié)作用。Keswani等［5］檢測了IGF1基因?qū)胫委煂σ蛱ケP功能障礙而生長受限的胚胎、胎盤以及胎兒肝臟、心臟、骨骼肌重量等的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF1使得胚胎、肝臟和骨骼肌重量等都恢復(fù)到正常水平。Chothe等［6］研究發(fā)現(xiàn)，IGF1能夠上調(diào)椎間盤細胞鈉依賴性維生素C轉(zhuǎn)運蛋白2的表達，椎間盤細胞攝入維生素C，從而提高抗氧化能力。Hirai等［7］給新西蘭白兔公兔飼喂添加或不添加IGF1的膽固醇日糧，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF1通過影響內(nèi)皮功能和老化而促進了動脈粥樣硬化。而家兔血清IGF1水平受到日糧中中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量影響，并可能與新西蘭白兔窩產(chǎn)仔數(shù)等性狀相關(guān)聯(lián)［8-9］。另外，家兔肝臟和肌肉IGF1基因表達高低均受到日糧蛋白水平的調(diào)節(jié)，且伊拉兔骨骼肌發(fā)育可能與IGF1基因表達上調(diào)有關(guān)［10-11］。但是，目前對家兔IGF1基因結(jié)構(gòu)及其多態(tài)性的研究還不夠深入。

皖南黃兔是安徽省義華農(nóng)牧科技有限公司與安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院共同選育的肉兔品種。該品種兔體型中等，被毛黃色，生長速度較快，肉質(zhì)優(yōu)良，主要分布于安徽黃山、池州等皖南山區(qū)，是當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖的主要肉兔品種。本研究首先擬結(jié)合利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和DNA池測序技術(shù)擴增，獲得皖南黃兔IGF1基因全部外顯子序列，并對其遺傳變異進行分析，為初步揭示肉兔IGF1基因功能和育種應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

2　材料與方法

2.1試驗動物與樣品

在安徽義華農(nóng)牧科技有限公司選擇皖南黃兔20只（公、母各10只），用剪耳鉗采集耳組織后置于70%酒精，隨冰塊帶回實驗室，再轉(zhuǎn)-75℃保存。參照血液基因組提取試劑盒（天根，北京）的使用說明提取耳組織樣品基因組DNA。再用微量紫外分光光度計測定濃度和純度后，制備100 ng/μL標(biāo)準(zhǔn)樣品，以備基因擴增用。

2.2引物設(shè)計

GenBank查詢獲得家兔IGF1基因序列作為種子序列（NC_013672.1，complement81679775-81748235，68461bp）。以上述IGF1基因組片段序列為模板，應(yīng)用Primer5.0和Oligo6.0設(shè)計5對引物，分別擴增該基因5個外顯子序列。全部引物（見表1）由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成。

表1　IGF1基因序列擴增引物

2.3擴增測序

通過優(yōu)化引物濃度和退火溫度，確定PCR擴增體系為15μL：2×PCRmix（天根，北京）7.5μL，上、下游引物各0.3μL，基因組DNA 0.8μL，去離子水6.1μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃5min，變性95℃30 s，退火60℃30 s，延伸72℃40 s，循環(huán)數(shù)33個，后延伸72℃4min。將20個樣品PCR產(chǎn)物混合，送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司直接測序，重復(fù)測序3次。

2.4序列分析

擴增序列分析用Water程序和BLAST比對程序，多序列比對用CLUSTW，順式作用元件分析使用Nsite 5.2013和JASPARCOREVertebrata。

3　結(jié)果與分析

3.1PCR擴增結(jié)果及序列測定

擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳（150 V，45min）檢測發(fā)現(xiàn)，5對引物擴增產(chǎn)物長度均與預(yù)期片段長度相符，電泳條帶清晰單一且無雜帶（圖1），表明擴增成功。PCR產(chǎn)物測序序列經(jīng)Seqman（Lasergene7.0）處理，構(gòu)建各外顯子重疊群，剔除測序質(zhì)量差的序列，獲得高質(zhì)量序列5條316、657、691、757和403 bp，經(jīng)序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別與種子序列相應(yīng)序列匹配率100%、99.5%、99.9%、99.7%和99.8%，分別包含外顯子1、2、3、4和5序列，內(nèi)含子-外顯子符合GT-AG規(guī)則，表明擴增序列正確。依據(jù)家兔序列拼接皖南黃兔IGF1基因編碼區(qū)（coding sequence，CDS），結(jié)果發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)序列為432 bp，編碼長度為143個氨基酸殘基的蛋白序列（圖2）。

圖1　皖南黃兔IGF1基因PCR擴增產(chǎn)物

圖2　皖南黃兔IGF1基因CDS和編碼蛋白序列

3.2多態(tài)性分析

對混合DNA池樣本PCR擴增結(jié)果進行分析，以確定多態(tài)位點。從測序峰圖看，5個外顯子沒有發(fā)現(xiàn)序列核苷酸變異，僅在內(nèi)含子1靠近外顯子2的序列中存在3個單核苷酸變異，分別為3056G＞A、3107T＞C和3164G＞A（圖3）。

圖3　皖南黃兔IGF1基因內(nèi)含子1核苷酸變異位點

3個變異位點位于內(nèi)含子1的3’端，是否影響IGF1基因剪接？筆者等針對包含所有3個變異的外顯子2上游278 bp序列（從3056G＞A上游40 bp到內(nèi)含子1的3’剪接位點AG）進行了分支位點手動尋找，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上游29～23 bp（CTCTGAC）和113～107 bp（TTCTGAT）兩段序列符合動物經(jīng)典分支位點序列特征。3個變異位點在外顯子2上游130、187和238 bp位置，與113～107 bp相隔17、74和125 bp。

圖4　皖南黃兔IGF1基因內(nèi)含子1剪接分支位點

同時，對內(nèi)含子順式作用元件進行生物信息學(xué)預(yù)測分析。Nsite 5.2013預(yù)測到顯著的調(diào)控序列（RE）共5條（圖5），分別為正向163～175 bp、311～319 bp、311～321 bp和反向91～80 bp、299～290 bp，分別結(jié)合C/EBP、Sp1、MAZ、GATA-1（c）和SP1及SP3。利用JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測（脊椎動物，Relative profile score threshold=85%）轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)3056G＞A、3107T＞C和 3164 G＞A變異位點分別位于 MZF1、（ATF4、CEBPA和HLF）、NKX2-8轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列（圖6）。

圖5　皖南黃兔IGF1基因內(nèi)含子1調(diào)控序列預(yù)測

圖6　皖南黃兔IGF1基因內(nèi)含子1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測

4　討論與結(jié)論

4.1IGF1基因結(jié)構(gòu)

IGF1作為胰島素生長因子家族的重要成員，該基因表達與家兔子宮生長受限［5］、動脈粥樣硬化［7］、1型糖尿病［12］等疾病相關(guān)。IGF1基因主要通過影響早期胚胎發(fā)育而促進動物生長發(fā)育，因而，IGF1可能對家兔多種生命過程具有重要影響。目前，家兔IGF1基因組DNA研究并不多，從NCBI查詢獲得家兔 IGF1基因ID為100008668，該基因定位于第4號染色體，其前體mRNA長432 bp（NM_001082026），蛋白包含143個氨基酸殘基（NP_001075495.1）。本研究以家兔IGF1基因（NC_013672.1）為模板，擴增測序獲得CDS的5個外顯子區(qū)段，均與種子序列高度匹配，序列拼接獲得全部CDS區(qū)序列共432 bp，預(yù)測編碼IGF1蛋白包含143個氨基酸殘基，與前述NCBI種子序列匹配率100%，結(jié)果說明所擴增序列即為家兔IGF1基因序列。然而，IGF1基因還可能存在其他剪接體。Argente等［13］擴增家兔IGF1基因mRNA序列，獲得了兩條剪接體A和B，插入片段為外顯子5，長度52 bp。與Argente等［13］研究結(jié)果相同，本研究CDS區(qū)包含外顯子5序列，即剪接體IGF1B。

4.2IGF1基因多態(tài)性

遺傳變異位點是基因序列的重要特征信息，可能對人類疾病和動物生產(chǎn)性狀表現(xiàn)產(chǎn)生遺傳效應(yīng)，從而作為遺傳標(biāo)記應(yīng)用于抗病治療和動物遺傳育種實踐。Arends等［14］研究發(fā)現(xiàn)，人IGF1基因PCR1標(biāo)記的等位基因191可能導(dǎo)致IGF1基因表達下調(diào)，并與人類出生體重、體長和頭圍等較?。⊿GA）有關(guān)，而737/738位點等位基因198純合則為正常體重。Johnston等［15］把與SGA相關(guān)聯(lián)變異位點定位在IGF1基因啟動子至內(nèi)含子2區(qū)域。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，皖南黃兔IGF1基因內(nèi)含子1存在3個突變位點，雖然它們可能不會影響該基因的正確剪接，但是可能作為增強子或沉默子等順式作用元件而結(jié)合MZF1、（ATF4、CEBPA和HLF）、NKX2-8等轉(zhuǎn)錄因子對家兔IGF1基因轉(zhuǎn)錄起到調(diào)控作用，從而對該基因表達和家兔生長發(fā)育起到直接或間接的調(diào)節(jié)作用［16-17］。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)皖南黃兔IGF1基因所有5個外顯子區(qū)均不存在突變位點，這與Argenete等［13］對子宮容量分化選擇的兩個品系家兔IGF1基因編碼區(qū)未發(fā)現(xiàn)突變位點的結(jié)果一致，同時也與歐洲野兔種子序列（NC_013672.1）編碼區(qū)序列完全相似，因而IGF1基因編碼區(qū)及蛋白序列在家兔中高度保守，預(yù)示其具有重要功能。本研究為肉兔生產(chǎn)性能與IGF1基因相關(guān)性分析奠定了基礎(chǔ)。

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Am plification and Polym orphism Analysisof IGF1Gene ofWannan Yellow Rabbit

Huang Dongwei1，Wang Yong2，ZhaoHuiling1，etal
（1.AnhuiAcademyofAgriculturalSciences，Heifei230031，China; 2.AnhuiYihua AgriculturalScienceand Technology Co.，LTD.，Chizhou 245106，China）

Insulin-likegrowth factor1（IGF1）isoneof important regulators in animalgrowth and development，whileatpresent，it remainsunclear for the sequencestructureand itspolymorphism of IGF1 gene in rabbit.In thisstudy，wholegenomic sequencesof coding region of rabbit IGF1 genewereamplified successfullyusing PCRmethod and theirpolymorphismeswereanalyzed byways ofpoolDNA sequencingand bioinformatics.The resultshowed that fivesequencescompromisingexon 1 to5were316 bp，657 bp，691 bp，757 bp and 403 bp in lengh，respectively，with highly similarity to the temple sequences（100%，99.5%，99.9%，99.7% and 99.8%respectively）；the five exons constituted the CDS（coding sequence）of432 bp in lengh，which could be translated to 143 amino acid residuesof IGF1.Additionally，therewere three polymorphic sites（3056G＞A，3107T＞Cand 3164G＞A）in intron 1，which did not locate in splicing sitesbut in several cis-actingelementssuch asMZF1，ATF4，CEBPA，HLFand NKX2-8，with possibility of regulating geneexpression.To sum up，the five exonssequencesof IGF1 gene ofWannan yellow rabbitand its coding region were acquired，and so did the three new polymorphic sites of partial intron 1.The results of this study can lay foundations for revealing function of IGF1gene inmeat rabbit. Keywords：Wannan yellow rabbit；IGF1 gene；amplification；polymorphism

S829.2

A

2095-3887（2016）06-0006-05

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.06.002

2016-09-14

安微省科技攻關(guān)項目（1501031098）；國家兔產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-44-A-3）

黃冬維（1981-），男，助理研究員，博士，主要從事草食動物育種與生產(chǎn)研究。

趙輝玲（1965-），女，研究員，碩士，主要從事草食動物育種與生產(chǎn)研究。