趙雪松，任 新，段小月，羅州穎，朱 蓉

(吉林師范大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 四平 136000)

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全氟辛烷磺酸鹽暴露對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性與氧化應(yīng)激的影響

趙雪松，任 新，段小月，羅州穎，朱 蓉

(吉林師范大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 四平 136000)

探討了全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)對斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性與氧化應(yīng)激的影響。將斑馬魚胚胎暴露于系列濃度(0.1 mg/L，0.5 mg/L，1 mg/L，5 mg/L，10 mg/L)的PFOS中，分別在胚胎受精后數(shù)小時(shí)(24 hpf，48 hpf，72 hpf，96 hpf，120 hpf)內(nèi)統(tǒng)計(jì)急性發(fā)育毒性指標(biāo)，包括存活率、畸形率、心率以及孵化率。同時(shí)在暴露結(jié)束的120 hpf，檢測相關(guān)的抗氧化酶活性變化，主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Gpx)以及脂質(zhì)過氧化物(MDA)。結(jié)果顯示，PFOS能夠?qū)е屡咛?幼魚存活率降低，畸形率增加，心率加快以及孵化延遲；同時(shí)，胚胎SOD活性以及MDA水平增加，CAT與Gpx活性降低，表明PFOS能夠誘發(fā)斑馬魚胚胎急性發(fā)育中毒，影響其抗氧化系統(tǒng)，導(dǎo)致胚胎產(chǎn)生氧化應(yīng)激。

全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)；斑馬魚胚胎；發(fā)育；氧化應(yīng)激

全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)是全氟代有機(jī)化合物的典型代表，以其優(yōu)良的熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性，高表面活性及疏水性，被廣泛地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和生活消費(fèi)領(lǐng)域，如皮革、紡織品、造紙、室內(nèi)裝潢、電子產(chǎn)品和表面活性劑的加工[1]。PFOS具有難降解、遠(yuǎn)距離傳播能力、生物蓄積性等特點(diǎn)，其廣泛應(yīng)用勢必會(huì)導(dǎo)致大量環(huán)境殘留，尤其是水體中的PFOS會(huì)在水生生物體中進(jìn)行積累[2]。目前毒理學(xué)研究數(shù)據(jù)顯示，PFOS類物質(zhì)對生物具有顯著的甲狀腺毒性[3]、生長發(fā)育毒性[4]、生殖毒性[5]等，但是對水生生物的毒理學(xué)數(shù)據(jù)還有待完善。

斑馬魚(Danio rerio)是一種小型淡水硬骨魚，原產(chǎn)于東印度恒河流域。其身體細(xì)長，成魚體長約4～5 cm，身體兩側(cè)有豎向銀藍(lán)色條紋，如斑馬狀，故得名斑馬魚。斑馬魚飼養(yǎng)簡單，繁殖周期短且能力強(qiáng)，是發(fā)育生物學(xué)、分子遺傳學(xué)和毒理學(xué)的理想模型。隨著環(huán)境毒理學(xué)這一學(xué)科的迅速發(fā)展，近年來，斑馬魚作為一種良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停辉絹碓蕉嗟貞?yīng)用到毒性測試和獨(dú)立研究中。

本文擬通過實(shí)驗(yàn)研究PFOS急性暴露對斑馬魚的發(fā)育毒性與氧化應(yīng)激的影響，以獲得具有現(xiàn)實(shí)意義的毒理學(xué)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 斑馬魚的養(yǎng)殖與胚胎的收集

實(shí)驗(yàn)用斑馬魚購自中國科學(xué)研究院武漢水生所，體長約3～4 cm。將性成熟的斑馬魚養(yǎng)殖于經(jīng)活性炭、珊瑚砂、陶粒過濾并由紫外線消毒的循環(huán)水中(其裝置見圖1)，并在循環(huán)水中加入營養(yǎng)鹽(64.75 mg/L NaHCO3，5.75 mg/L KCl，123.25 mg/L MgSO4·7H2O和294 mg/L CaCl2·2H2O)。水溫保持在28±1 ℃，pH值為 6.85～7.0，光照黑暗周期為12 h明/12 h暗。選用體形正常成熟親魚，按照雌雄1∶2進(jìn)行交配，并用篩網(wǎng)收集受精卵。在解剖鏡下挑選受精后2 h內(nèi)(2 hour post-fertilization，2 hpf)發(fā)育正常的胚胎進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)。

圖1 斑馬魚養(yǎng)殖裝置

1.2 PFOS暴露溶液的配制

實(shí)驗(yàn)選取PFOS作為染毒物質(zhì)。PFOS購自于Sigma公司，純度>99%。由于PFOS不溶于水，所以選取二甲基亞楓(DMSO)對PFOS粉末進(jìn)行溶解。取100 mg干燥的PFOS粉末，溶于10 mL DMSO溶劑中，制成10 mg/mL濃度的PFOS儲(chǔ)備液，并應(yīng)用循環(huán)水依次釋成為0.1 mg/L，0.5 mg/L，1 mg/L，5 mg/L，10 mg/L作為暴露溶液。將所得的這5種濃度的溶液分別裝瓶并標(biāo)注。

1.3 暴露實(shí)驗(yàn)

將收集到的受精卵進(jìn)行清洗后，置于預(yù)先配制的暴露溶液中。具體步驟為：在直徑為180 mm的結(jié)晶皿中分別倒入300 mL空白溶液， 0.1 mg/L，0.5 mg/L，1 mg/L，5 mg/L，10 mg/L PFOS溶液，每個(gè)暴露濃度放入200顆發(fā)育到囊胚期的胚胎，每個(gè)暴露濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù)。為保證溶液中溶質(zhì)的濃度，每天更換50%的暴露液。暴露實(shí)驗(yàn)開始后對急性發(fā)育指標(biāo)進(jìn)行考察，主要包括在24 hpf，48 hpf，72 hpf，96 hpf，120 hpf時(shí)間節(jié)點(diǎn)胚胎/幼魚的存活率與畸形率；72 hpf與84 hpf胚胎/幼魚的孵化率；48 hpf與84 hpf胚胎/幼魚的心率。在暴露120 hpf后，對胚胎/幼魚進(jìn)行抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)的分析。

1.4 胚胎抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)分析

胚胎抗氧化系統(tǒng)指標(biāo)分析主要測定抗氧化酶活性變化，包括超氧化歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Gpx)以及丙二醛(MDA)的水平。測定方法如下：暴露120 hpf后，每個(gè)暴露濃度隨機(jī)收集80個(gè)胚胎/幼魚，用機(jī)械勻漿器進(jìn)行勻漿，制成10%的勻漿液，然后根據(jù)南京建成生物有限公司測定試劑盒的操作規(guī)程對上述內(nèi)容進(jìn)行測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)分析，并利用Levene’s檢驗(yàn)分析方差的同質(zhì)性。所有統(tǒng)計(jì)分析都通過SPSS 17.0軟件(SPSS，Chicago USA)進(jìn)行操作。當(dāng)p<0.05時(shí)，判定存在顯著性差異。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SEM)給出，采用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 PFOS對斑馬魚胚胎急性發(fā)育毒性的影響

將胚胎暴露于不同濃度的PFOS后，在24 hpf，48 hpf，72 hpf，96 hpf和120 hpf時(shí)間節(jié)點(diǎn)胚胎/幼魚的存活率如圖2所示。由圖2可知胚胎/幼魚的存活率24～48 hpf沒有顯著變化，隨著暴露時(shí)間的延長，72～120 hpf胚胎/幼魚的存活率呈現(xiàn)降低趨勢，且與暴露濃度存在依賴關(guān)系。暴露時(shí)間由24 hpf延長至120 hpf，對照組存活率分別為88%和78%，0.1 mg/L PFOS暴露組的存活率由85%降至74%，而10 mg/L PFOS暴露組的存活率由80%顯著降至40%。

圖2 PFOS急性暴露對斑馬魚 胚胎/幼魚存活率的影響

在24 hpf，48 hpf，72 hpf，96 hpf和120 hpf時(shí)間節(jié)點(diǎn)統(tǒng)計(jì)的胚胎/幼魚的畸形率如圖3所示，由圖3可知畸形率與PFOS暴露濃度存在顯著的時(shí)間劑量依賴關(guān)系。隨著暴露濃度的增加，1 mg/L，5 mg/L，10 mg/L PFOS暴露組畸形率顯著增加。隨著暴露時(shí)間由24 hpf延長至120 hpf，以上三組的畸形率分別由14%，15%，18%增加至45%，62%和75%。夏繼剛等研究的PFOS對斑馬魚仔魚急性暴露的結(jié)論與本研究得到的結(jié)論相似，即隨著暴露時(shí)間的延長與暴露濃度的增加，仔魚的死亡率與畸形率增加[6]。

圖3 PFOS急性暴露對斑馬魚 胚胎/幼魚畸形率的影響

(注：*表示p<0.05；**表示p<0.01)圖4 PFOS急性暴露對斑馬魚 胚胎/幼魚孵化率的影響

孵化出殼是斑馬魚胚胎發(fā)育的一個(gè)重要階段。72 hpf與84 hpf胚胎的孵化率如圖4所示，對照組中超過90%的胚胎在72 hpf之前孵化出殼。在72 hpf1 mg/L，5 mg/L，10 mg/L PFOS暴露組與對照組相比孵化率顯著降低(p<0.05)，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系，孵化率分別為58%，30%和25%。當(dāng)暴露時(shí)間延長至84 hpf，PFOS各暴露組胚胎的孵化率有所增加，與對照組沒有顯著差異，說明PFOS濃度的增加雖延遲胚胎的孵化時(shí)間，但不影響胚胎成功孵化。

在48 hpf與84 hpf統(tǒng)計(jì)胚胎/幼魚的心率由圖5所示，各暴露組胚胎48 hpf心率與對照組沒有顯著差異，而在84 hpf1 mg/L，5 mg/L，10 mg/L PFOS暴露組幼魚的心率顯著增加，分別為198±6次/min，210±12次/min，235±24次/min，對照組卻只有158±6次/min。

(注：*表示p<0.05；**表示p<0.01)圖5 PFOS急性暴露對斑馬魚 胚胎/幼魚心率的影響

(A)48 hpf對照；(B)48 hpf充血；(C)48 hpf卵黃囊水腫；(D)96 hpf對照；(E)96 hpf心包水腫；(F)96 hpf尾部畸形圖6 PFOS急性暴露后胚胎/幼魚形態(tài)學(xué)異常

圖6顯示了PFOS急性暴露導(dǎo)致的胚胎/幼魚發(fā)育的形態(tài)學(xué)異常表現(xiàn)，主要包括充血、卵黃囊水腫、心包水腫以及尾部畸形。胡芹的研究也發(fā)現(xiàn)PFOS能夠?qū)е掠佐~出現(xiàn)脊柱彎曲、卵黃囊水腫等異常[7]。2.2 PFOS對斑馬魚胚胎抗氧化系統(tǒng)的影響

氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)氧化損傷的一種常見途徑，抗氧化系統(tǒng)是生物為了避免內(nèi)外源化學(xué)物質(zhì)的損害而通過長期進(jìn)化形成的酶解系統(tǒng)。許多環(huán)境污染物都能夠誘導(dǎo)生物體活性氧(ROS)的過量生成，但生物體有一套完整的抗氧化系統(tǒng)作為保護(hù)體系，主要用于清除機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的多余的自由基，使機(jī)體免受氧化損傷。PFOS對斑馬魚胚胎抗氧化系統(tǒng)的影響如圖7-10所示。

(注：*表示p<0.05；**表示p<0.01)圖7 PFOS急性暴露對斑馬魚 胚胎SOD活性的影響

(注：*表示p<0.05)圖8 PFOS急性暴露對斑馬魚 胚胎CAT活性的影響

(注：*表示p<0.05)圖9 PFOS急性暴露對斑馬魚 胚胎Gpx活性的影響

(注：*表示p<0.05；**表示p<0.01； ***表示p<0.001)圖10 PFOS急性暴露對斑馬魚 胚胎MDA水平的影響

超氧化歧化酶(SOD)是一種源于生命體的活性物質(zhì)，作為抗氧化系統(tǒng)的首道屏障能消除生物體中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。由圖7可知，5 mg/L和10 mg/L暴露組SOD的活性顯著增加(p<0.05)，由對照組的1.65±0.12(U/prot)分別增加至2.26±0.15(U/prot)和3.47±0.28(U/prot)。表明5 mg/L和10 mg/L暴露組胚胎體內(nèi)的自由基含量增加，SOD活性被顯著誘導(dǎo)以抵御增加的自由基，使機(jī)體免受氧化損傷。過氧化氫酶(CAT)存在于紅細(xì)胞及某些組織內(nèi)的過氧化體中，它的主要作用就是催化H2O2分解為H2O與O2，使H2O2不與O2在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成非常有害的-OH。由圖8可知，與對照組相比，5 mg/L和10 mg/L暴露組CAT的活性顯著降低(p<0.05)，由對照組的2.95±0.12(U/prot)分別降低至2.37±0.15(U/prot)和2.42±0.28(U/prot)。杜佳的研究與本研究得到了一致性的結(jié)論，即PFOS急性暴露能夠?qū)е屡咛OD活性增加、CAT活性降低[8]。

谷胱甘肽過氧化物酶(Gpx)是生物體內(nèi)重要的非酶抗氧化劑。在外源物質(zhì)的刺激下，Gpx會(huì)被誘導(dǎo)，有效地清除生理性的或病理性的氧自由基，同時(shí)作為必需的輔助因子參與Gpx相關(guān)酶調(diào)控氧化應(yīng)激的狀態(tài)[9]。由圖9可知，PFOS暴露組胚胎Gpx活性與對照組相比基本呈現(xiàn)降低的趨勢，10 mg/L暴露組降低顯著(p<0.05)，由對照組的202.36±19.87(U/prot)降低至145.43±19.24(U/prot)。這表明，經(jīng)PFOS處理后斑馬魚胚胎的非酶抗氧化能力下降。丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物之一，其含量變化可以反映出機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，從而間接地反映出細(xì)胞損害的程度，對于魚類模型而言，MDA常作為環(huán)境污染物毒性效應(yīng)的敏感指示物。由圖10可知，0.1 mg/L暴露組MDA水平較對照組有數(shù)量上的降低但差異不顯著。0.5～10 mg/L暴露組，隨著暴露濃度的增加，MDA水平升高，呈現(xiàn)依賴關(guān)系。其中1 mg/L，5 mg/L和10 mg/L暴露組MDA水平較對照組顯著增加(p<0.05)，由對照組的2.95±0.25(nmol/mgprot)分別增至4.15±0.65(nmol/mgprot)，4.57±0.51(nmol/mgprot)和5.26±0.65(nmol/mgprot)。這表明PFOS能夠?qū)е屡咛サ闹|(zhì)過氧化。袁璐瑤研究了PFOS對斑馬魚肝臟與肌肉的氧化應(yīng)激反應(yīng)，10 mg/L暴露組的肝臟與肌肉中MDA水平極顯著增加[10]，這與本研究得出了相似的結(jié)論。

3 結(jié)論

(1)PFOS急性暴露對斑馬魚胚胎產(chǎn)生發(fā)育毒性，表現(xiàn)為存活率降低、畸形率增加、心率加快以及孵化延遲。

(2)PFOS急性暴露導(dǎo)致胚胎抗氧化系統(tǒng)發(fā)生變化，SOD活性增加，CAT與Gpx活性降低，同時(shí)MDA水平增加，表明PFOS誘發(fā)胚胎發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)。

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(責(zé)任編校：李秀榮)

On the Effect of PFOS on Developmental Toxicity and Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

ZHAO Xue-song， REN Xin， DUAN Xiao-yue， LUO Zhou-ying， ZHU Rong

(School of Environmental Science and Engineering， Jilin Normal University， Siping 136000， China)

This paper is aimed at studying the effect of PFOS on developmental toxicity and oxidative stress in zebrafish embryos. In the experiments done by the authors， the zebrafish embryos were exposed to PFOS(0.1 mg/L，0.5 mg/L，1 mg/L，5 mg/L，10 mg/L)， and acute developmental toxicity indexes at different hours after fertilization(24 hpf，48 hpf，72 hpf，96 hpf，120 hpf)were collected， including survial rate， malformation rate， heart rate and hatching rate. At the end of 120 hpf exposure， the changes in antioxidant enzyme activity were examined， including superoxide dismutase (SOD)， catalase (CAT)， glutathione peroxidase (Gpx) and lipid peroxidation Oxide (MDA). The results indicate that PFOS tends to decrease the survival rate of embryos and larvae， increase the rate of malformation， speed up the heart rate and delay the hatching. They also show that the activities of SOD and MDA in the embryo increase and those of CAT and Gpx decrease， indicating that PFOS can induce the acute developmental toxicity of zebrafish embryos， affect the antioxidant system and lead to embryonic oxidative stress.

perfluorooctanesul phonic acid potassium salt(PFOS)； zebrafish embryos； development； oxidative stress

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21507039)；吉林省教育廳“十三五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(吉教科合字[2016]第227號(hào))

趙雪松(1983-)，女，吉林雙遼人，講師，博士，主要從事環(huán)境毒理學(xué)研究。

X171.5

A

1672-349X(2016)06-0012-05

10.16160/j.cnki.tsxyxb.2016.06.004