張 可，吳藝琪，陳 偉，格 桑，陳 佳，羅鴻兵①

(1.四川農(nóng)業(yè)大學土木工程學院，四川 都江堰 611830；2. 哈爾濱工業(yè)大學市政環(huán)境工程學院，黑龍江 哈爾濱 150090)

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施氏假單胞菌PFS-4的篩選、優(yōu)化固定及其對二氯喹啉酸的降解性能

張 可1，吳藝琪2，陳 偉1，格 桑2，陳 佳1，羅鴻兵1①

(1.四川農(nóng)業(yè)大學土木工程學院，四川 都江堰 611830；2. 哈爾濱工業(yè)大學市政環(huán)境工程學院，黑龍江 哈爾濱 150090)

從長期施用二氯喹啉酸的土壤中分離到1株能以二氯喹啉酸為碳源生長的菌株，命名為PFS-4。經(jīng)16S rRNA基因序列和生理生化特性分析，將菌株PFS-4鑒定為施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)。以麥稈吸附-海藻酸鈉包埋方式對菌株進行復合固定，采用正交實驗對固定條件進行優(yōu)化，研究溫度、pH值、碳源對固定化菌劑降解二氯喹啉酸的影響；考察固定化菌劑對污水中二氯喹啉酸的去除效果，并對比分析游離菌及固定化菌劑去除能力的差異。結(jié)果表明，固定化菌劑制備的最佳條件為：海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)為5%，CaCl2為4%，菌膠比1∶2，交聯(lián)時間5 h。在溫度為30 ℃、pH值為7的條件下，經(jīng)5 d培養(yǎng)，固定化菌劑對500 mg·L-1二氯喹啉酸降解率為92.3%。在處理污水中二氯喹啉酸時，游離菌的降解能力受到極顯著抑制 (P<0.01)，而對固定化菌劑降解率影響相對較小，去除率保持在64%以上。麥稈吸附-海藻酸鈉包埋固定化菌劑對不良環(huán)境具有較好緩沖性，可用于微生物降解菌的開發(fā)利用。

二氯喹啉酸；麥稈-海藻酸鈉復合載體；固定化；微生物降解

二氯喹啉酸(quinclorac)為一種選擇性苗后處理除草劑,屬于激素型喹啉羧酸類藥劑,主要用于防治稻田中稗草和其他禾本科雜草[1]。該藥劑性質(zhì)較為穩(wěn)定[2-3],同時具有一定的水溶性,可通過徑流等形式造成水體污染。二氯喹啉酸污染水體的修復方法主要有光催化降解、生物炭吸附以及微生物降解[4],其中微生物修復因在環(huán)境友好方面具有獨特優(yōu)勢而受到廣泛關注。

在應用微生物進行原位修復時,由于環(huán)境中土著微生物的多樣性及污染成分的復雜性,篩選的功能菌株往往不能顯現(xiàn)其特有的高效降解性能[5]。固定化微生物技術通過物理或化學方法將游離的微生物與特定的載體相結(jié)合,為微生物提供相對穩(wěn)定的生存環(huán)境,減輕土著微生物帶來的競爭壓力,緩沖外界物質(zhì)對細胞的毒害,從而達到強化降解的目的[6]。目前固定化微生物技術被廣泛運用于污水中氨氮的去除,以及含酚廢水、含油廢水等高濃度有機廢水的處理,并取得了良好效果[7],但固定化微生物技術在農(nóng)藥污染修復方面的研究相對較少。從已有的研究結(jié)果看,固定化載體和方式對污染物降解效果影響較大[8-10]。探討針對二氯喹啉酸降解微生物的固定化載體及方式有助于微生物菌劑的應用開發(fā)。

國內(nèi)關于二氯喹啉酸降解菌較早的報道為Lü等[11]分離到的洋蔥博克氏菌(Burkholderiacepacia),之后節(jié)桿屬菌株(Arthrobactersp.)、博德特氏(Bordetellasp.)等多個屬的二氯喹啉酸降解菌株被分離出來[12-13]。在進行農(nóng)藥污染水體或土壤原位修復時,由于環(huán)境條件復雜,實驗室中篩選出的高效降解菌株不能適應自然環(huán)境或者不能達到實驗室預期降解效果[14],因此采用一定的方式強化生物降解顯得尤為重要。筆者從長期受污染的環(huán)境中分離到1株能降解二氯喹啉酸的細菌菌株,通過選取具有可生物降解性的麥稈和海藻酸鈉為載體對游離菌株進行固定,考察了固定化菌劑在不同環(huán)境條件下的降解特性,同時研究了其對實際污水中二氯喹啉酸的去除效果,取得了較為滿意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

土樣采集于四川新津(33°25′17″ N,103°55′08″ E)長期施用二氯喹啉酸的土壤(試驗田塊),w(二氯喹啉酸)為19.4～25.3 mg·kg-1。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

二氯喹啉酸(純度w=99%)由四川省農(nóng)資公司提供(購自國家農(nóng)藥中心),甲醇為色譜純,購自天津科密歐化學試劑公司。

基礎無機鹽培養(yǎng)基(MSM):MnCl20.15 g,ZnSO445 mg,Na2MoO436 mg,NaNO34 g,FeCl30.10 g,K2HPO41.5 g,CaCl2·2H2O 0.01 g,KH2PO41.5 g,FeSO4·7H2O 0.04 g,MgSO40.2 g,(NH4)2SO41.0 g。LB培養(yǎng)基:酵母膏5 g,蛋白胨10 g,NaCl 10 g,pH值為7,H2O 1 L。固體培養(yǎng)基加入20 g瓊脂。

1.3 菌株分離與純化

稱取5 g土樣,置于ρ(二氯喹啉酸)為100 mg·L-1的無機鹽液體培養(yǎng)基中,140 r·min-1、25 ℃搖床培養(yǎng)7 d。每隔7 d以10%接種量轉(zhuǎn)接,采用梯度壓力馴化法,ρ(二氯喹啉酸)按100 mg·L-1梯度遞增,最終ρ(二氯喹啉酸)為500 mg·L-1。連續(xù)轉(zhuǎn)接4次后檢驗降解效果。取富集液涂布在500 mg·L-1二氯喹啉酸無機鹽培養(yǎng)基平板上,在25 ℃恒溫箱培養(yǎng),當培養(yǎng)基上長出單菌落后,挑取單菌落轉(zhuǎn)接至含二氯喹啉酸的無機鹽液體培養(yǎng)基試管中,140 r·min-1、25 ℃搖床培養(yǎng),驗證待測菌株的降解效果。取降解二氯喹啉酸效果良好的試管培養(yǎng)液劃線純化、鏡檢,斜面4 ℃保存。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 菌株的生理生化特性

菌株形態(tài)觀察、生理生化試驗方法參見文獻[15]。

1.4.2 DNA提取及PCR擴増

采用DNA提取試劑盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕提取基因組DNA。16S rDNA基因的擴增引物5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′,5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。擴增體系:PCR Mix 10 μL,DNA模板1 μL,引物各1μL,超純水補足30 μL。PCR擴增程序:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min;56 ℃退火1 min;72 ℃延伸2 min;30個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1.4.3 克隆測序

將擴增產(chǎn)物純化、回收,與pGM-T載體連接,然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細胞,通過氨芐抗性及藍白斑篩選陽性克隆,送至上海生工生物工程有限公司測序。所測得的序列用BLAST在GenBank尋找同源菌株及相關標準菌株的序列后,利用MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 固定化菌劑的制備

將去除頂端麥穗的麥稈清洗、烘干、打碎過180 μm孔徑篩,稱取1 g麥稈到含有20 mL無機鹽培養(yǎng)基的錐形瓶,高溫滅菌備用。將固體培養(yǎng)基上的單菌落轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基中,140 r·min-1、25 ℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期后離心收集菌體,用無機鹽液體培養(yǎng)基重懸,作為母液,取一定量加入含麥稈的培養(yǎng)基中,作為吸附載體。將海藻酸鈉(SA)浸泡過夜,高溫滅菌,冷卻后與菌體以不同體積混合均勻,菌體是指經(jīng)麥稈吸附后的菌體。隨后將上述混合液滴入不同質(zhì)量濃度的CaCl2溶液中,靜置固化后用無菌水沖洗3次,置于4 ℃冰箱進行后續(xù)實驗。以海藻酸鈉質(zhì)量分數(shù)、CaCl2質(zhì)量分數(shù)、菌膠比和交聯(lián)時間作為試驗因素,采用正交試驗法,設計4因素3水平的正交實驗L9(3)4,各因子水平取值見表1。

表1 正交實驗因素水平

Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

水平因素Aw(海藻酸鈉)/%因素Bw(CaCl2)/%因素C菌體與海藻酸鈉體積比因素D交聯(lián)時間/h1521∶132632∶143741∶25

1.6 不同環(huán)境因子對二氯喹啉酸降解的影響

將二氯喹啉酸標準品(純度w為99%)溶于甲醇并過濾,配制成不同濃度二氯喹啉酸溶液,按所需濃度添加到培養(yǎng)基中。按10%的體積比將固定化菌劑加入到含500 mg·L-1二氯喹啉酸的培養(yǎng)基中,140 r·min-1、25 ℃搖床培養(yǎng),定時測定二氯喹啉酸含量。分別考察溫度(15、20、25、30、35、40 ℃)、pH值(4、5、6、7、8、9)、外加碳源 (乳糖、淀粉、麥芽糖、葡萄糖、乙酸鈉) 對降解效果的影響。樣品在12 000 r·min-1條件下離心8 min(離心半徑為3 cm),將上清液通過0.22 μm孔徑濾膜后,采用高效液相色譜儀HPLC(Aglient 1200)測定二氯喹啉酸含量。分析條件:柱溫40 ℃,流動相為V(甲醇)∶V(水)=90∶10的混合溶液,流速為0.5 mL·min-1,進樣量為20 μL。色譜柱Inertsil ODS-2151-K(6 mm×150 mm)。所有實驗重復3次,以接種滅活的菌體為對照。

1.7 固定化菌劑對污水中二氯喹啉酸的去除

污水采集于四川新津農(nóng)業(yè)廢水收集池,以氮、磷為主要污染物,并有Cr6+檢出,ρ(二氯喹啉酸)為119.4 mg·L-1。在1 L水中加入φ為5%、10%、15%、20%、25%、30%的固定化菌劑，在溫度為25 ℃、pH值為7、140 r·min-1條件下培養(yǎng)6 d,計算二氯喹啉酸的去除率。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0軟件進行one-way ANONA分析,采用LSD法進行多重比較,采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選及鑒定

經(jīng)過梯度壓力馴化,結(jié)合降解能力測定,從土壤中篩選獲得1株具有降解二氯喹啉酸能力的細菌菌株,命名為PFS-4。菌株PFS-4為革蘭陰性菌，短桿狀;菌落形態(tài)為圓形、濕潤、半透明、表面光滑,其他生理生化特性見表2。

表2 菌株PFS-4的生理生化特性

Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain PFS-4

測試項目結(jié)果測試項目結(jié)果革蘭染色-淀粉水解試驗+v-p測定-甲基紅(M.R)試驗-檸檬酸鹽試驗+明膠液化試驗-產(chǎn)硫化氫試驗-過氧化氫試驗+硝酸鹽還原試驗+接觸酶試驗+乙酸鹽-氧化酶+D-木糖-

+表示陽性；-表示陰性。

提取供試菌株的基因組DNA,擴增16S rDNA片段,T/A克隆后測序,獲得1 419 bp的序列長度,登錄號為KU974966。利用MEGA 6.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。

圖1 菌株16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育圖

結(jié)果表明,菌株PFS-4與假單胞菌屬的施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)序列同源性為99%,結(jié)合生理生化特性,鑒定為施氏假單胞菌。Pseudomonassp.廣泛存在于環(huán)境中,許多具有有機污染物降解能力的菌株已從不同環(huán)境中分離獲得。

2.2 固定化菌劑制備條件的優(yōu)化

為優(yōu)化菌劑的固定條件,以w(海藻酸鈉)、w(CaCl2)、菌膠體積比和交聯(lián)時間為影響因素,設計了4因素3水平實驗。從表3可見,各因素影響為:w(海藻酸鈉)A>交聯(lián)時間D>菌膠體積比C>w(CaCl2)B,即w(海藻酸鈉)(SA)對二氯喹啉酸去除率影響最大,其次為交聯(lián)時間,w(CaCl2)的影響最小。固定化菌劑制備的最優(yōu)組合是A1B3C3D3,即:w(海藻酸鈉)為5%,菌膠體積比為1∶2,w(CaCl2)為4%,交聯(lián)時間為5 h。

表3 二氯喹啉酸降解率正交試驗結(jié)果

Table 3 Orthogonal experiment results of quinclorac degradation

實驗序號水平設置因素A因素B因素C因素D二氯喹啉酸降解率/%1111181.342122293.283133395.154212388.735223180.286231286.317313282.278321376.039332170.92

因素A、B、C、D分別為w(海藻酸鈉)、w(CaCl2)、菌膠體積比和交聯(lián)時間。

表4 二氯喹啉酸降解正交試驗極差分析

Table 4 Analysis of quinclorac degradation rang based on orthogonal experiment

因素均值1/%均值2/%均值3/%極差R因素A89.9285.1176.4013.52因素B84.1183.1984.130.94因素C81.2284.3185.914.69因素D77.5187.2888.6411.13

因素A、B、C、D分別為w(海藻酸鈉)、w(CaCl2)、菌膠體積比和交聯(lián)時間。

2.3 菌株PFS-4的生長曲線及其對二氯喹啉酸的降解

為了使用生長旺盛期的菌株開展后續(xù)實驗,將菌株PFS-4以φ為2%的量接種到ρ為500 mg·L-1的二氯喹啉酸培養(yǎng)基中,在溫度為25 ℃、pH值為7、140 r·min-1條件下培養(yǎng),測定其生長曲線以及對二氯喹啉酸的降解效果(圖2)。經(jīng)2 d培養(yǎng),二氯喹啉酸降解率僅為7%,隨著菌株進入對數(shù)生長期,生長量增大，降解率也隨之增加,5 d后菌株開始衰亡,到6 d時菌株對二氯喹啉酸降解率為76%,菌株對二氯喹啉酸的降解率與菌株生長量在1～5 d時呈顯著正相關。

圖2 菌株PFS-4的生長曲線及對二氯喹啉酸的降解

2.4 溫度對固定化菌株降解二氯喹啉酸的影響

分別以φ為10%和2%的量接種固定化菌劑和游離菌體至含500 mg·L-1二氯喹啉酸的培養(yǎng)基,考察溫度對菌劑降解二氯喹啉酸的影響。從圖3可見,固定化菌劑在前2 d降解量較低,各溫度下降解率無顯著差異(P>0.05)。

圖3 溫度對固定化菌劑和游離菌體降解二氯喹啉酸的影響

3 d后,隨著生長量增加,降解作用也隨之加強,最后趨于穩(wěn)定,與游離菌株PFS-4生長曲線一致,說明菌體經(jīng)麥稈-海藻酸鈉固定后對菌株生長特性影響小?？傮w而言,固定化菌劑在15～35 ℃范圍時,具有較穩(wěn)定的降解率。游離菌體在溫度低于或高于30 ℃時,降解率迅速下降,在15和40 ℃時降解率分別為21.1%和17.8%，適應溫度范圍窄,而固定化菌劑適應溫度的范圍較寬。此前相關研究中分離到的二氯喹啉酸降解菌在30～37 ℃范圍內(nèi)具有較高降解能力,但對溫度敏感,溫度變化會引起降解率的大幅變化[12,16-17]。因此,固定化處理可增加菌種對溫度的適應能力,將有利于復雜環(huán)境中二氯喹啉酸的生物降解。

2.5 pH值對菌劑降解二氯喹啉酸的影響

分別以φ為10%和2%的量接種固定化菌劑和游離菌體至含二氯喹啉酸(500 mg·L-1)的無基鹽培養(yǎng)基,在溫度為30 ℃、140 r·min-1條件下,考察不同pH值對菌劑降解二氯喹啉酸的影響。由圖4可知,固定化菌劑及游離菌在pH值為7時降解率最高,分別為92.3%和79.7%。當pH值從7降到4時,固定化菌劑降解率下降66%,游離菌體下降78%;當pH值從7到9時,固定化菌劑降解率下降18%,游離菌體下降44%。pH值的改變對菌體的降解產(chǎn)生了顯著抑制作用(P<0.05),但固定化菌劑抵抗酸堿變化的能力強于游離菌體,這與此前關于固定化菌劑相關研究結(jié)果一致[6]。

直方柱上方英文小寫字母不同表示

2.6 碳源對菌劑降解二氯喹啉酸的影響

在此前的研究中發(fā)現(xiàn)外加碳源對固定化菌劑降解有機物效果產(chǎn)生較大影響[18],因此選取5種碳源考察了其對菌劑降解二氯喹啉酸(500 mg·L-1)的影響。如圖5所示,各碳源的添加對固定化菌劑降解均具有促進作用，但效果不顯著(P>0.05),乙酸鈉的作用最強,添加后對二氯喹啉酸的降解率也僅比對照增加不到2%。而對于游離菌株,乙酸鈉、葡萄糖、乳糖以及麥芽糖顯著增加了菌體的降解能力(P<0.05),僅淀粉對游離菌株的降解產(chǎn)生了抑制作用,這與此前郭雅妮等[19]關于淀粉對菌株降解聚乙烯醇(PVA)的研究結(jié)果一致,分析原因可能是由于淀粉屬于高生物降解性物質(zhì),很容易被降解,大量菌體隨著時間增長迅速,產(chǎn)生營養(yǎng)競爭導致菌體量下降。外加碳源對固定化菌劑降解能力的影響較小,而對于游離菌體影響較大,推測可能與載體自身含碳量較高從而導致外加碳源對強化作用較弱有關。岳黎等[20]關于碳氮源對苯酚降解菌作用的研究中發(fā)現(xiàn)葡萄糖的添加抑制了降解效果,說明碳源對降解菌降解效果的影響除了與碳源類型有關外,還與菌株特性有關。

直方柱上方英文小寫字母不同表示

2.7 菌劑對農(nóng)田污水中二氯喹啉酸的去除

為考察游離菌體及固定化菌劑對實際污水中二氯喹啉酸的去除效果,從農(nóng)業(yè)污水收集池取水樣,測定水樣中ρ(二氯喹啉酸)為119.4 mg·L-1,pH值為7.8。調(diào)整pH值到7.0,加入不同量的游離菌以及固定化菌劑,室溫培養(yǎng)6 d后測定去除率。如圖6所示,不同投加量的固定化菌劑對二氯喹啉酸的去除率在64.7%以上。而游離菌體的去除率約為固定化菌劑去除率的50%。隨著投加量的增加,降解率有增加趨勢,但當投菌量達到一定值后,降解率開始下降,這是由于在馴化過程中過量的菌體增殖形成了營養(yǎng)競爭,導致降解率下降。固定化菌劑對實際污水中二氯喹啉酸的去除率低于在實驗室條件下相同濃度的二氯喹啉酸模擬污水,這與實際污水中復雜的化學成分及微生物對營養(yǎng)的競爭有關。

固定化載體和高效降解菌是固定化微生物技術的2個重要支撐,而固定化方式是協(xié)調(diào) 2個支撐的關鍵媒介[6],這3者缺一不可。麥稈作為植物殘體,含有豐富的C、N等營養(yǎng)元素,對微生物和酶都有很強的親和力[7],因此具有良好前景。

直方柱上方英文小寫字母不同表示同一菌體

3 結(jié)論

(1)從長期施用二氯喹啉酸的土壤中分離到1株能降解二氯喹啉酸的菌株PFS-4,經(jīng)生理生化及分子生物學鑒定為施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri),在25 ℃、pH值為7條件下,經(jīng)6 d培養(yǎng)后,對500 mg·L-1二氯喹啉酸降解率達76%以上。

(2)采用麥稈-海藻酸鈉對菌株PFS-4進行固定,固定化菌劑制備的最優(yōu)組合為:w(海藻酸鈉)為5%,菌膠體積比為1∶2,w(CaCl2)為4%,交聯(lián)時間為5 h。

(3)固定化菌劑在溫度為30 ℃、pH值為7的最適條件下,對500 mg·L-1二氯喹啉酸降解率達92.3%,強化了游離菌體的降解效果,而且對溫度及酸堿的耐受強度大于游離菌體。

(4)固定化菌劑對未經(jīng)處理的農(nóng)業(yè)污水中二氯喹啉酸去除率在64%以上,顯著高于游離菌的去除率(P<0.05)。

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(責任編輯： 陳 昕)

Isolation,Immobilization and Characterization of Quinclorac-Degrading Strain Pseudomonas stutzeri PFS-4.

ZHANG Ke1, WU Yi-qi2, CHEN Wei1, GE Sang2, CHEN Jia1, LUO Hong-bing1

(1.College of Civil Engineering, Sichuan Agricultural University, Dujiangyan 611830, China;2.School of Municipal and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China)

Using quinclorac as carbon source, one strain, named PFS-4, was isolated from long-term contaminated soil. Strain PFS-4 was identified asPseudomonasstutzeribased on physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA sequence analysis. PFS-4 immobilization condition was optimized by orthogonal experiment, and then the effects of different temperature, initial pH, carbon and nitrogen sources on the degradation of quinclorac by the immobilized bacteria were examined. The performance of free bacteria and immobilized bacteria in actual wastewater were also detected. The results show that the optimal conditions for immobilization were as follows: alginate concentration 5%, calcium chloride 4%, bacteria cement ratio 1∶2, crosslinking time 5 h. The immobilized bacteria could effectively degrad 92.3% of quinclorac (500 mg·L-1) after 5 d inoculation at the condition of 30 ℃ and pH 7.0. The results also revealed that the degradation rate decreased when treating actual wastewater. The degradation rate of free bacteria was significantly inhibited (P<0.01)when treating wastewater, on the contrary,immobilized bacteria were less affected and the removal rate remained above 64%. Therefore, wheat-straw adsorption-sodium alginate immobilized bacteria can be applied in quinclorac biodegradation treatment because of its good buffering to adverse circumstances.

quinclorac； wheat straw-SA carrier； immobilization； biodegradation

2015-11-11

國家自然科學基金(51278318);四川省科技支撐計劃(2013SZ0103,2014NZ0044)

X592

A

1673-4831(2016)06-1018-06

10.11934/j.issn.1673-4831.2016.06.024

張可(1982—),女,四川成都人,講師,碩士,主要從事環(huán)境微生物及市政污水處理研究。E-mail: zhangke@sicau.edu.cn

① 通信作者E-mail: luohongbing66@163.com