褚文達(dá)

（上海市寶山區(qū)疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科，上海201901）

ELISA法和RT-PCR法在麻疹病毒檢測(cè)中的應(yīng)用比較分析

褚文達(dá)

（上海市寶山區(qū)疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科，上海201901）

目的 探討酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，RT-PCR）對(duì)疑似麻疹病例的麻疹病毒的檢測(cè)，為疾病的盡早確診及治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 以上海市寶山區(qū)2014年4月至2015年12月的250例疑似麻疹病例為研究對(duì)象，采集其血清標(biāo)本和咽拭子標(biāo)本，分別應(yīng)用ELISA法檢測(cè)患者血清中的麻疹特異性的免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）抗體和RT-PCR法檢測(cè)咽拭子中麻疹病毒的核酸。結(jié)果 250例疑似麻疹病例，排除風(fēng)疹病毒陽(yáng)性的34例病例，其中麻疹病毒（measles virus，MV）IgM抗體呈陽(yáng)性的有80例，陽(yáng)性率為37.04%；MV RT-PCR呈陽(yáng)性的有128例，陽(yáng)性率為59.26%。RT-PCR的檢測(cè)陽(yáng)性率顯著高于IgM檢測(cè)（χ2=41.14，P＜0.001）。結(jié)論 RT-PCR法可快速診斷麻疹病毒的病原學(xué)，且對(duì)出疹初期麻疹I(lǐng)gM呈陰性的病例可進(jìn)一步確診，是一種有效可靠的方法。

麻疹病毒； 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR； 血清； 核酸

麻疹病毒（measles virus，MV）感染臨床上可引起發(fā)熱及出疹為特征的急性病毒性呼吸道傳染病，其發(fā)病率之高，傳染性之強(qiáng)，已屬于我國(guó)計(jì)劃免疫的病毒之一。對(duì)麻疹進(jìn)行早期診斷，并采取一定的預(yù)防措施，能有效減少麻疹的暴發(fā)。但由于風(fēng)疹病毒（rubella virus，RV）與麻疹病毒的臨床癥狀相似，常易引起混淆，因此區(qū)分二者需要進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)室診斷。目前實(shí)驗(yàn)室對(duì)麻疹病毒的診斷主要有血清學(xué)方面的診斷和病原學(xué)方面的診斷［1-3］。在麻疹的防治工作中，有研究［4］表明選擇合適的抗體能顯著提高檢測(cè)的陽(yáng)性率。IgG抗體由于檢測(cè)步驟復(fù)雜，人為誤差較大，并且需要雙份血清，采血時(shí)間引起誤差，導(dǎo)致檢測(cè)陽(yáng)性率較低，尤其在麻疹早期診斷中，與IgG相比，特異檢測(cè)IgM抗體更有效

幫助麻疹的確診。目前我國(guó)建立的麻疹實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)，是利用ELISA對(duì)患者血清中的麻疹特異性的IgM抗體進(jìn)行檢測(cè)［5］。RT-PCR是一項(xiàng)于近年迅速發(fā)展的高特異性、高靈敏度的對(duì)核酸進(jìn)行快速檢測(cè)的技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是普通定量PCR無(wú)法達(dá)到的，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于病毒等各種病原微生物核酸的快速檢測(cè)［6］。本文以寶山區(qū) 2014年 4月至2015年 12月的疑似麻疹病例為研究對(duì)象，分別應(yīng)用ELISA法檢測(cè)患者血清中的麻疹特異性的IgM抗體和RT-PCR法檢測(cè)麻疹病毒的核酸，并進(jìn)一步探討兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)效果。

材料和方法

1 一般資料

本組250份標(biāo)本來(lái)源于寶山區(qū)2014年4月至2015年12月的疑似麻疹病例，其中男160例，女90例，平均年齡10.8±3.3歲。出疹后14天內(nèi)進(jìn)行血標(biāo)本采集，用于ELISA法檢測(cè)患者血清中的麻疹特異性的IgM抗體；出疹后5天內(nèi)進(jìn)行咽拭子標(biāo)本采集，用于RT-PCR法檢測(cè)麻疹病毒核酸，同時(shí)利用兩種方法檢測(cè)標(biāo)本中的風(fēng)疹病毒，以排除風(fēng)疹病毒的干擾。

2 儀器與試劑

Bio-Tek（ELX-808）酶標(biāo)儀（貨號(hào)：196682）；ABI 7500熒光定量PCR儀；麻疹病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)于珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)海泰生物制藥有限公司（產(chǎn)品編號(hào)：YZB/國(guó)6817-2012）；風(fēng)疹/麻疹病毒 RNA檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）購(gòu)于江蘇碩士生物科技有限公司。

3 方法

3.1 ELISA法檢測(cè)血清IgM抗體 ①血清標(biāo)本處理：無(wú)菌注射器抽取患者靜脈血，4℃離心，2 000 r/min，10 min，取血清。②ELISA法檢測(cè)：嚴(yán)格按照麻疹病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，結(jié)束后以空白調(diào)零，用酶標(biāo)儀讀出450 nm處的吸光度值，或者通過(guò)（A450nm-A630nm）計(jì)算吸光度值，通過(guò)該吸光度值判定檢測(cè)結(jié)果。

3.2 RT-PCR檢測(cè)麻疹病毒核酸 ①咽拭子的采集：無(wú)菌棉簽蘸取患者咽部分泌物，避免觸及口腔黏膜、舌和唾液。加入至3～5 mL病毒標(biāo)本保存液中，在靠近頂端處折斷棉簽，后按照Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit（貨號(hào)：52904）提取試劑盒提取RNA，用于后續(xù)擴(kuò)增。②RT-PCR法檢測(cè)：嚴(yán)格按照麻疹病毒RNA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，反應(yīng)體系配置完成后于PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄：50℃，30 min，1個(gè)循環(huán)；預(yù)變性：95℃，5 min，1個(gè)循環(huán)；變性、退火、延伸：95℃，10 s，55℃，共45個(gè)循環(huán)；在55℃時(shí)收集熒光信號(hào)，檢測(cè)通道為：FAM，VIC，ROX（注：PCR儀設(shè)置時(shí)不選ROX校正，淬滅基團(tuán)選None）。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分?jǐn)?shù)）的形式表示，配對(duì)資料采用配對(duì)組χ2檢驗(yàn)。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同樣本ELISA和RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果

共收集250例疑似麻疹病例的血液標(biāo)本和咽拭子標(biāo)本，排除兩種方法檢測(cè)風(fēng)疹病毒為陽(yáng)性的34例病例，從而排除風(fēng)疹干擾因素。剩余的216份血清標(biāo)本中MV IgM抗體呈陽(yáng)性的有80例，陽(yáng)性率為37.04%，其中有四份可能為假陽(yáng)性；216份咽拭子標(biāo)本中 MV RT-PCR呈陽(yáng)性的有128例，陽(yáng)性率為59.26%。兩方法檢驗(yàn)結(jié)果具有顯著性差異，RT-PCR的檢測(cè)陽(yáng)性率較高（χ2=41.14，P＜0.001），見(jiàn)表1。

表1 不同樣本ELISA和RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果比較

2 檢測(cè)時(shí)間分析

由上述MV IgM檢測(cè)結(jié)果呈陰性而 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性的52份標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，其中46份標(biāo)本的檢測(cè)時(shí)間處于發(fā)病的1～5 d，見(jiàn)表2。

表2 檢測(cè)時(shí)間比較

討 論

麻疹病毒樣本一般通過(guò)血液或鼻咽分泌物來(lái)采集，早期研究表明，在麻疹前驅(qū)期或者患者機(jī)體出現(xiàn)皮疹第1天，病人血液或者呼吸道分泌物易分離出麻疹病毒［7］。

對(duì)上海市寶山區(qū)2014年4月至2015年12月250份麻疹疑似病例，在發(fā)病2周內(nèi)采集靜脈血或咽拭子，分別采用ELISA法檢測(cè)血清樣本中IgM抗體和采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法檢測(cè)咽拭子樣本中麻疹病毒核酸。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ELISA法檢測(cè)麻疹病毒陽(yáng)性率顯著低于RT-PCR法對(duì)麻疹病毒核酸的檢測(cè)。通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)為陽(yáng)性結(jié)果的128例患者中，有52例患者麻疹病毒IgM抗體的檢測(cè)結(jié)果為陰性，其原因?yàn)榛颊咴诟腥韭檎畈《局螅檎領(lǐng)gM抗體在發(fā)病早期較少產(chǎn)生或者不產(chǎn)生，并且抗體產(chǎn)生帶有個(gè)體差異性。有文獻(xiàn)報(bào)道，出疹3d內(nèi)，通過(guò)麻疹I(lǐng)gM抗體來(lái)檢測(cè)麻疹病毒可能出現(xiàn)的假陽(yáng)性結(jié)果高達(dá)30%［8］。因此，在患者發(fā)病早期，通過(guò)血清樣本檢測(cè)麻疹I(lǐng)gM抗體來(lái)進(jìn)行確診并不十分可靠，可能會(huì)出現(xiàn)漏檢［9］。若臨床上仍采用麻疹I(lǐng)gM抗體進(jìn)行確診，則應(yīng)在出疹之后4d到28d再次進(jìn)行麻疹I(lǐng)gM抗體檢測(cè)，抗體檢測(cè)的時(shí)間跨度一般較長(zhǎng)［10］。所以，ELISA法對(duì)麻疹確診具有局限性，不僅早期檢測(cè)結(jié)果不理想，而且耗時(shí)長(zhǎng)，患者對(duì)抽血有排斥感，另外，病毒血癥可能會(huì)在患者出疹前7d出現(xiàn)，出疹1～2 d內(nèi)，中和抗體出現(xiàn)在血清中，血循環(huán)中病毒可能消失，因此出疹可能是由于體內(nèi)出現(xiàn)抗體-病毒復(fù)合物這種炎癥物質(zhì)［11］，所以醫(yī)生在實(shí)際操作中需把握好患者就診和采血時(shí)間等。

采用RT-PCR法檢測(cè)麻疹病毒核酸來(lái)對(duì)患者進(jìn)行確診，不僅方便易行，檢測(cè)的特異性和靈敏度均高于ELISA檢測(cè)。RT-PCR法能夠在發(fā)熱僅1d的小兒樣本中檢測(cè)出麻疹病毒［12］，可用于麻疹病毒核酸早期的快速診斷及篩查，如果病例為陽(yáng)性則不需要再檢測(cè)IgM抗體即可確診，而ELISA法可作為RT-PCR法的有力補(bǔ)充。另外對(duì)于一些患者的血清IgM抗體呈陰性可進(jìn)一步通過(guò)RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，達(dá)到彌補(bǔ)漏檢的目的［13-14］。雖然RT-PCR能提高特異性檢測(cè)，但是如果模板序列中有堿基發(fā)生變異，則RTPCR過(guò)程中，探針就不能有效結(jié)合模板，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性。因此，對(duì)某些基因變異發(fā)生率較高的微生物，如病毒等，設(shè)計(jì)引物的難度與真核生物相比大幅增加。另外，本研究的樣品量較少，研究結(jié)果不夠全面，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。

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（潘子昂編輯）

Comparison of Enzyme Linked Immunosorbent Assay（ELISA）and Real-time PCR Assay（RT-PCR）in the Detection of Measles Virus

CHU Wen-da
（Center for Disease Control and Preventionof Baoshan District Shanghai，Shanghai 201901，China）

Objective To explore the measles virus of suspected measles cases through ELISA and the RT-PCR to provide scientific experimental basis for taking immediate measures to control outbreak of measles.Methods Venous blood and throat swab specimens were collected from 134 suspected measles cases in Baoshan，Shanghai from Apr.2014 to Dec.2015.Serum measles IgM was detected by ELISA.Measles viral RNA from throat swab specimens was detected by RT-PCR.Results From 250 cases of suspected measles，80 measles virus IgM antibody detected by ELISA method was positive with the positive rate of 37.04%，while 128 measles virus nucleic acid was positive with the positive rate of 59.26%.The positive rate of RT-PCR was significantly higher than that of IgM（χ2=20.83，P＜0.001）.Conclusion RT-PCR is a rapid method for diagnosis of measles virus.It can further confirm the initial IgM negative measles rash cases，which is effective and reliable.

Measles virus； Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）； Real-time fluorescent PCR assay（RT-PCR）； Serum； Nucleic acid

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.11.032

2016-06-20；

2016-08-03